常见植物真菌性病害拮抗酵母菌的筛选与鉴定.pdf

年 月第 卷第 期 收 稿 日 期 作 者 简 介 马伟东 男 河南省镇平县人 南阳市镇平县农业推广站高级农艺师 主要研究方向为土壤肥料研究 与实践 通 信 作 者 张俊杰 男 河南省汝州市人 郑州轻工业大学副教授 博士 主要研究方向为功能微生物生态与 应用 引 用 格 式 马伟东 李硕 王晨晨 等 常见植物真菌性病害拮抗酵母菌的筛选与鉴定 轻 工学报 中 图 分 类 号 文 献 标 识 码 文 章 编 号 常 见 植 物 真 菌 性 病 害 拮 抗 酵 母 菌 的 筛 选 与 鉴 定 关 键 词 植物真菌性病害 拮抗酵母菌 平板对峙法 马伟东 李硕 王晨晨 刘溢彩 张畅 吴昊 田寅 张俊杰 南 阳 市 镇 平 县 农 业 推 广 站 河 南 南 阳 郑 州 轻 工 业 大 学 食 品 与 生 物 工 程 学 院 河 南 郑 州 摘 要 针对黄瓜枯萎病病原菌 黄瓜尖孢镰刀菌 烟草赤星病病原菌 赤星霉 菌 和紫云英根腐病病原菌 紫云英根腐病菌 种常见植物真菌性病害 采用 平板对峙法 从已分离保存的 株酵母菌中筛选出具有较强拮抗作用的 株 酵母菌 通过形态学特征 生理生化特征 基因测序分析以确定其分类学地位 结果表明 酵母菌 对黄瓜尖孢镰刀菌拮抗效果最好 其抑菌率为 该菌株被鉴定为 酵母菌 对赤星霉 菌拮抗效果最好 其抑菌率为 该菌株被鉴定为 酵 母菌 对紫云英根腐病菌拮抗效果最好 其抑菌率为 该菌 株被鉴定为 年 月第 卷第 期 前言 由真菌引起的植物病害在全球范围内都较 为常见 针对植物病害的主要防治手段是施 加化学农药 而这一措施会造成致病菌产 生抗药性 农药残留等问题 因此 生物防治 的理念越来越受到业界的重视 生物防治主要 是利用拮抗微生物及其代谢产物对植物病害病 原菌产生抑制作用 从而削弱病原菌致病力 达 到防治效果 生物防治由于具有不污染环境 不使致病菌产生抗药性等优点而成为近年来农 作物病虫害防治的研究热点 果蔬等在生长 采摘 运输 贮藏等过程中 若处理不当 易腐烂变质 而真菌性病原菌是引 起果蔬等腐烂的主导因素 黄瓜枯萎病是 由黄瓜尖孢镰刀菌引起的土传真菌性病害 可 严重影响黄瓜的水分含量 进而影响黄瓜的 品质和产量 目前已报道的对黄瓜枯萎病病 原菌 黄瓜尖孢镰刀菌 具有生物防治潜力的 微生物主要有假单胞菌属 链霉菌 芽孢杆 菌 细菌 等 烟草赤星病 又称赤斑病 是 一种由半知菌亚门链格孢属赤星霉菌侵染引起 的主要危害烟叶的真菌性病害 目前已报 道的对烟草赤星病病原菌 赤星霉菌 具有生 物防治潜力的微生物主要有芽孢杆菌 放线菌 等 在田间 生物防治菌剂对烟草赤星病 已具有很好的应用效果 紫云英根腐病是由 紫云英根腐病病原菌 紫云英根腐病菌 引起 的一种真菌性病害 是造成紫云英产量减少的 重要病症之一 酵母菌对植物真菌性病原菌具有拮抗效 果 同时具有防治效果好 不污染环境 繁殖速 度快 遗传稳定 不威胁人类健康等优 点 农作物果实采摘后 使用酵母菌替 代化学农药防治植物真菌性病害 已成为二战 后世界各国农作物病虫害防治的研究热点之 一 拮抗酵母菌 植物真菌性病害病原菌与宿主 植物可相互影响 同时 拮抗酵母菌的生物防治 效果也是多种机制共同作用的结果 一是拮 抗酵母菌通过与病原菌展开空间与资源的竞 争 抑制病原菌的生长 二是拮抗酵母菌 通过诱导植物 产生抑制病原菌的拮抗物 质 三是拮抗酵母菌自身也能产生具有抑菌 能力的代谢物质 该代谢物质具有重要的病 原菌拮抗作用 另外 不同酵母菌对不同植物真 菌性病害病原菌的拮抗效果也有所不同 张俊 杰等 从分离自葡萄果皮的酵母菌中 筛选出 一株对黄瓜尖孢镰刀菌具有明显拮抗作用的酵 母菌 并证明了该酵母菌对黄瓜尖孢镰刀菌具 有潜在的生物防治效果 目前 鲜见拮抗酵母菌 对赤星霉菌和紫云英根腐病菌具有潜在的生物 防治效果的相关报道 近年来 由于分子生物学的快速发展 利用 鉴定菌株的技术被广泛应用于酵母菌的 马 伟 东 等 常 见 植 物 真 菌 性 病 害 拮 抗 酵 母 菌 的 筛 选 与 鉴 定 分类鉴定 很多模式菌株的 区 区和 区的序列被公布 在 国际核酸序列中 这使得酵 母菌的分类鉴定更加快速和精确 也标志着酵 母菌鉴定从传统的表型性状鉴定跨入现代遗传 信息特性鉴定的新阶段 基于此 本文拟选择黄瓜尖孢镰刀菌 赤星 霉菌和紫云英根腐病菌作为研究对象 采用平 板对峙法 从 株酵母菌中筛选出对 种常见 植物真菌性病原菌具有较强拮抗作用的酵母菌 菌株 通过形态学特征 生理生化特征 基因测 序分析确定其分类学地位 以期为植物真菌性 病害的生物防治提供参考 材料与方法 材 料 供 试 菌 株 黄瓜枯萎病病原菌 黄瓜尖 孢镰刀菌 由河南农业大学提供 烟草赤星病 病原菌 赤星霉菌 由郑州轻工业大学提供 紫云英根腐病病原菌 紫云英根腐病菌 由中 国农业大学提供 酵母菌 由郑州轻工业大学食 品与生物工程学院微生物资源分类实验室分离 并保存 主 要 试 剂 柱式基因组 抽提 试剂盒 酵母菌 引物 和 引物 和 以上 试剂均由上海生工生物工程股份有限公司提供 主 要 培 养 基 培养基 马铃薯 葡萄糖 琼脂粉 去离子水定容 至 培养基 酵母粉 蛋白胨 葡 萄糖 去离子水定容至 其中 固 体培养基加琼脂粉 鉴别培养基 酵母粉 胰蛋白胨 葡萄糖 琼脂粉 溴甲酚绿 去离子水定容至 调 值至 以上培养基均在 条件下高压蒸汽灭 菌 仪 器 与 设 备 型超净工 作台 苏州安泰空气技术有限公司产 型恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗器械有限公 司产 型台式离心机 上海安亭科学 仪器厂产 型生化培养箱 北京中兴 伟业仪器有限公司产 型紫外分析仪 北 京君意东方电泳设备有限公司产 型聚 合酶链式反应扩增仪 美国 公司产 实 验 方 法 酵 母 菌 的 活 化 与 纯 化 将保存于郑州 轻工业大学食品与生物工程学院微生物资源分 类实验室菌库 中的 株酵母菌 分 离自霞多丽葡萄果皮和葡萄酒酿造过程中 进 行活化 吸取 酵母菌菌液 置于 培 养基上 于 条件下培养 待菌落长出后 即为活化完成 挑取培养基中的单菌落 在 培养基上经过 次划线接种培养 获得 纯化后的酵母菌菌株 植 物 真 菌 性 病 害 病 原 菌 的 活 化 用直 径 的打孔器在有黄瓜尖孢镰刀菌的 培养基上打出菌块 将菌块倒扣在 培养基 的中央 使病原菌表面与培养基表面尽可能接 触 于 条件下正向放置培养 再倒置培 养 待菌落长出后即为活化完成 赤星霉菌和紫 云英根腐病菌的活化方法同上 拮 抗 酵 母 菌 的 初 筛 借鉴参考文献 的方法 分别在 个 培养基平板的背 面十字划线 将每个平板分为 个相等的区域 取生长良好的 种病原菌菌饼 半径为 年 月第 卷第 期 分别倒扣在 个 平板的十字交叉中心 并 在每个区域内距中心菌饼 处划线接种酵 母菌 使酵母菌生长区域保持一致 每个病原菌 做 次平行 同时以不接种酵母菌的 培养 基平板作阴性对照 将所有平板用密封条密封 好后 于 条件下正向培养 后 再倒置 培养 待培养结束后 与阴性对照组进行对 比 将对 种病原菌有抑制作用的酵母菌初步筛 选出来 用精度为 的游标卡尺测量病原 菌直径 对峙平板中的病原菌直径越小 表明抑 制作用越强 酵母菌的拮抗作用越好 拮 抗 酵 母 菌 的 复 筛 进一步对初次筛 选得到的拮抗酵母菌进行复筛 以确定酵母菌 拮抗效果的强弱 根据 的方法 个平板 上只接种 株酵母菌 进行复筛 并计算抑菌 率 计算公式如下 抑菌率 对照组菌落直径 实验组菌落直径 对照组菌落直径 抑菌率越高 表明酵母菌抑菌作用越强 拮 抗作用越好 拮 抗 酵 母 菌 的 初 步 鉴 定 将复筛得到 的拮抗酵母菌 划线接种至 鉴别培养基上 于 条件下暗培养 在暗室用白炽灯作 为唯一光源 以保证结果的一致性 观察菌落 形态特征 菌落的大小 色泽等 对筛选 得到的酵母菌进行初步鉴定 挑取单菌落 接种 于 液体培养基中 于 条 件下培养 在 倍光学显微镜下观察酵母 菌细胞的形态学特征 拮 抗 酵 母 菌 的 基 因 测 序 将复筛得到 的拮抗酵母菌接种于 液体培养基中 于 条件下过夜培养 按照酵母菌 基因组 试剂盒的说明提取酵母菌基因组 区段使用正向引物 和 反向引物 进行扩增 区段使用正 向引物 和反向引物 进行扩增 体系和扩增程序 参见文献 对 产物进行琼脂糖 质量 分数为 凝胶电泳检测 电泳参数为电压 定时 初步判断扩增片段的大小 和质量 并将扩增后的 产物送上海生工生 物工程股份有限公司进行测序 拮 抗 酵 母 菌 的 系 统 发 育 分 析 用 软件对 产物测序结果进行序列修正 在 数据库中利用 工具对修正后的 区段序列和 区段 序列进行序列相似性比对 并下载序列相似性 最高的已知种群序列作为参比序列 建立系统 发育树 结果与分析 拮 抗 酵 母 菌 的 筛 选 结 果 经过初步筛选 从 株酵母菌中得到对黄 瓜尖孢镰刀菌 赤星霉菌和紫云英根腐病菌具 有明显拮抗作用的 株酵母菌 分别编号为 和 再用这 株酵母菌对 种 病原菌做平板对峙实验 进行拮抗酵母菌的复 筛 抑菌效果见表 由表 可知 对黄瓜尖孢镰刀菌拮抗效果 最佳的酵母菌是 其次是 和 对应的抑菌率分别 为 和 对赤星霉菌拮抗 效果最佳的酵母菌是 其次是 和 对应的抑菌 马 伟 东 等 常 见 植 物 真 菌 性 病 害 拮 抗 酵 母 菌 的 筛 选 与 鉴 定 表 拮抗酵母菌对 种病原菌的抑菌效果 拮抗酵母菌 黄瓜尖孢镰刀菌 平均直径 抑菌率 赤星霉菌 平均直径 抑菌率 紫云英根腐病菌 平均直径 抑菌率 对照组 率分别为 和 对紫云英 根腐病菌拮抗效果最好的酵母菌是 其次是 和 对应的抑菌率分别为 和 拮 抗 酵 母 菌 的 初 步 鉴 定 结 果 对筛选得到的 株拮抗酵母菌进行形态 学鉴定 其在 鉴定培养基上的菌落形态和 显微细胞形态如图 所示 表型聚类结果如表 所示 拮 抗 酵 母 菌 的 系 统 发 育 分 析 结 果 基 于 区 段 的 系 统 发 育 分 析 基于 区段的拮抗酵 母菌菌株系统发育树如图 所示 由图 可以 看出 和 与 和 聚为同一分支 类似地 与 和 聚为同一分支 和 与 和 聚为同一分支 和 与 和 聚为同一分支 但以上 种拮抗酵母菌菌 W W110 9 W W110 9 W W10453 W W1045 W W10196 W W1045 W W103 1 W W10986 W W1114 W W10140 图 拮抗酵母菌在 鉴定培养基上的 菌落形态 左 和显微细胞形态 右 株均同时与不同的菌株聚为同一分支 因此不 能在种的水平上进行划分 和 聚为同一分支 且序列相似性 年 月第 卷第 期 表 拮抗酵母菌在 鉴定培养基上的表型聚类结果 拮抗酵母菌 菌落颜色 菌落形态 显微细胞形态 白边 绿圈 白顶 光滑 有光泽 湿润 突起 不透明 椭圆形 单生 单端芽殖 白边 浅蓝顶 光滑 有光泽 湿润 突起 不透明 柠檬形 单生 两端芽殖 白边 绿圈 白顶 光滑 有光泽 湿润 突起 不透明 梭形 单生 单端芽殖 白边 绿圈 浅绿顶 光滑 有光泽 湿润 突起 不透明 椭圆形 单生 单端芽殖 白边 绿圈 浅绿顶 光滑 有光泽 湿润 突起 不透明 椭圆形 单生 单端芽殖 白边 深绿顶 光滑 有光泽 湿润 突起 不透明 梭形 单生 单端芽殖 白边 白顶 光滑 有光泽 湿润 突起 不透明 椭圆形 单生 单端芽殖 白边 白顶 光滑 有光泽 湿润 突起 不透明 椭圆形 单生 单端芽殖 黄边 深绿顶 光滑 有光泽 湿润 突起 不透明 柠檬形 单生 单端芽殖 黄边 绿圈 白顶 光滑 有光泽 湿润 突起 不透明 椭圆形 单生 单端芽殖 O O 5O Hanseniaspora opuntiae YLLl 4 MF979222 Hanseniaspora guilliermondii YLL5 MF9792l 4 WYCCWl l O 29 WYCCWl l O 79 WYCCWl O 37l Hanseniaspora vineae 2O TASLl 5 KX42l 39l WYCCWl l l 42 WYCCWl O l 4O WYCCWl O 457 WYCCWl O 453 WYCCWl O 452 WYCCWl O l 96 WYCCWl O 986 Torulaspora delbrueckii WO GB52 DO 869O 79 Lachancea thermotolerans SLDY O 53 MH748632 Starmerella bacillaris SF2 2l O 2II4 MHO 4893 Candida zemplinina A9 4 5 EU386755 Kodamaea ohmenri 64 MKO 26222 Pichia terricola Y2 2O KY996739 Issatchenkia terricola KDLYH3 5 KJ5O 6735 l O O l O O l O O l O O l O O l O O 7l 99 63 图 基于 区段的拮抗酵母菌菌株系统发育树 为 因此 可将 鉴定为 基 于 区 段 的 系 统 发 育 分 析 基于 区段的拮抗酵母菌菌株系统 发育树如图 所示 由图 可以看出 与 聚为同一分 支 序列相似性为 因此 可将 鉴定为 和 与 聚为同一分支 序列相似性为 因此 可将 和 鉴 定为 与 聚为同一分支 序列相似性为 因此 可将 鉴定为 和 与 聚为同一分支 序列相似性为 因此 可将 和 鉴定为 结论 本研究选取郑州轻工业大学食品与生物工 程学院微生物资源分类实验室分离筛选得到的 马 伟 东 等 常 见 植 物 真 菌 性 病 害 拮 抗 酵 母 菌 的 筛 选 与 鉴 定 图 基于 区段的拮抗酵母菌株系统发育树 株酵母菌 经过平板对峙法进行初筛和复 筛 得到 株对黄瓜尖孢镰刀菌 赤星霉菌和 紫云英根腐病菌具有较好拮抗作用的酵母菌 其中 对黄瓜尖孢镰刀菌拮抗效果最好的酵母 菌是 其抑菌率为 该菌 株被鉴定为 对赤星霉菌拮 抗效果最好的酵母菌是 其抑菌 率为 该菌株被鉴定为 对紫云英根腐病菌拮抗效果最好的酵母 菌是 其抑菌率为 该菌 株被鉴定为 该研究结果确定了酵母菌对上述 种植物 真菌性病原菌具有一定的生物防治效果 为发 展绿色农业提供了一定的指导 然而 在大田中 需要考虑的因素众多 对于拮抗酵母菌在土壤条 件下的抑菌效果 拮抗因子 尚需进行代谢产物 的分离检测 以及相应的盆栽和大田试验 参 考 文 献 杜 欣 谊 植 物 病 害 生 防 微 生 物 的 研 究 进 展 现 代 化 农 业 王 倡 宪 王 艳 张 志 不 同 磷 浓 度 条 件 下 地 表 球 囊 霉 对 黄 瓜 枯 萎 病 抗 性 和 抗 氧 化 酶 活 性 的 影 响 江 苏 农 业 科 学 马 晓 凤 黄 瓜 枯 萎 病 综 合 防 控 西 北 园 艺 综 合 刘 淼 四 霉 素 水 剂 防 治 黄 瓜 枯 萎 病 田 间 药 效 试 验 报 告 农 民 致 富 之 友 王 芳 王 晓 倩 王 莹 等 种 杀 菌 剂 对 黄 瓜 尖 孢 镰 刀 菌 的 毒 力 测 定 试 验 中 国 农 学 通 报 朱 宇 航 黄 思 洋 陈 华 保 等 烟 草 赤 星 病 防 治 药 剂 的 筛 选 烟 草 科 技 张 乃 芹 郝 明 慧 贾 海 慧 等 多 功 能 菌 剂 防 治 黄 瓜 枯 萎 病 及 对 黄 瓜 产 量 影 响 的 研 究 现 代 园 艺 杨 侃 侃 刘 晓 虹 陈 宸 等 黄 瓜 枯 萎 病 研 究 进 展 湖 南 农 业 科 学 张 林 尧 孟 祥 龙 王 午 可 等 生 物 菌 剂 对 苹 果 枝 干 轮 纹 病 的 田 间 防 效 研 究 河 南 农 业 科 学 王 丽 丽 朱 诗 君 金 树 权 等 黄 瓜 枯 萎 病 拮 抗 菌 株 的 筛 选 及 其 生 物 防 效 浙 江 农 业 科 学 施 河 丽 孙 立 广 谭 军 等 生 物 有 机 肥 对 烟 草 青 枯 病 的 防 效 及 对 土 壤 细 菌 群 落 的 影 响 年 月第 卷第 期 中 国 烟 草 科 学 宋 金 宇 刘 程 惠 胡 文 忠 等 拮 抗 酵 母 菌 对 果 蔬 病 害 防 治 的 研 究 进 展 保 鲜 与 加 工 裘 纪 莹 王 未 名 陈 建 爱 等 拮 抗 菌 在 果 蔬 保 鲜 中 的 应 用 研 究 进 展 食 品 工 业 科 技 郭 晋 云 胡 晓 峰 李 勇 等 黄 瓜 枯 萎 病 对 黄 瓜 光 合 和 水 分 生 理 特 性 的 影 响 南 京 农 业 大 学 学 报 王 敏 土 传 黄 瓜 枯 萎 病 致 病 生 理 机 制 及 其 与 氮 素 营 养 关 系 研 究 南 京 南 京 农 业 大 学 魏 滟 洁 田 叶 韩 王 炎 峰 等 球 毛 壳 菌 与 枯 草 芽 孢 杆 菌 组 合 对 抗 黄 瓜 枯 萎 病 防 御 酶 活 性 的 影 响 山 东 农 业 科 学 祝 久 香 黄 瓜 枯 萎 病 拮 抗 细 菌 的 筛 选 发 酵 及 生 防 机 理 研 究 长 沙 中 南 林 业 科 技 大 学 唐 明 程 智 敏 向 金 友 等 烤 烟 赤 星 病 发 生 规 律 及 影 响 因 素 调 查 研 究 现 代 农 业 科 技 杨 波 烟 草 赤 星 病 拮 抗 细 菌 筛 选 及 其 分 析 杭 州 浙 江 大 学 曾 琛 陈 庆 园 刘 洋 等 贵 州 省 兴 义 市 烟 草 赤 星 病 发 生 情 况 调 查 河 南 农 业 科 学 宋 莉 莎 司 世 飞 龙 友 华 等 烟 草 赤 星 病 生 防 芽 孢 杆 菌 的 筛 选 鉴 定 及 其 生 长 条 件 研 究 河 南 农 业 科 学 司 世 飞 烟 草 赤 星 病 生 防 菌 筛 选 及 发 酵 条 件 优 化 贵 阳 贵 州 大 学 司 世 飞 宋 莉 莎 任 静 等 一 株 抗 烟 草 赤 星 病 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 的 筛 选 及 鉴 定 河 北 大 学 学 报 自 然 科 学 版 李 锡 宏 余 君 陈 守 文 等 防 治 烟 草 赤 星 病 的 生 防 菌 剂 田 间 对 比 试 验 湖 北 植 保 刘 普 方 静 凡 程 运 江 等 生 防 酵 母 菌 防 治 果 品 采 后 病 害 机 理 的 研 究 进 展 华 中 农 业 大 学 学 报 高 云 慨 张 荣 意 钟 利 文 等 株 新 分 离 拮 抗 酵 母 菌 株 对 芒 果 炭 疽 病 生 防 效 果 及 其 分 类 鉴 定 热 带 生 物 学 报 刘 椰 拮 抗 酵 母 新 种 鉴 定 及 其 对 柑 橘 果 实 采 后 主 要 病 害 的 防 治 机 理 研 究 重 庆 西 南 大 学 彭 景 贤 酵 母 菌 对 柑 橘 采 后 病 害 的 生 物 防 治 及 防 治 机 理 的 研 究 福 州 福 建 农 林 大 学 关 鑫 三 株 生 防 酵 母 菌 对 番 茄 灰 霉 病 生 物 防 治 的 比 较 研 究 哈 尔 滨 东 北 农 业 大 学 周 海 莲 葡 萄 有 孢 汉 逊 酵 母 对 灰 霉 病 抑 制 机 理 的 探 讨 南 京 南 京 农 业 大 学 张 红 印 罗 伦 隐 球 酵 母 对 水 果 采 后 病 害 的 生 物 防 治 及 其 防 治 机 理 研 究 杭 州 浙 江 大 学 温 新 宇 拮 抗 酵 母 菌 的 筛 选 鉴 定 及 其 制 剂 对 枇 杷 贮 藏 保 鲜 的 影 响 镇 江 江 苏 大 学 张 俊 杰 尚 益 民 田 寅 等 株 黄 瓜 枯 萎 病 菌 拮 抗 酵 母 的 分 离 鉴 定 及 其 拮 抗 作 用 初 探 河 南 农 业 大 学 学 报 杨 云 甜 菜 根 腐 病 拮 抗 菌 的 筛 选 鉴 定 与 抑 病 效 果 研 究 哈 尔 滨 黑 龙 江 大 学 薛 军 侠 徐 艳 文 杨 莹 等 培 养 基 在 酿 酒 酵 母 筛 选 中 的 应 用 中 国 酿 造 王 红 苹 果 和 梨 果 表 面 酵 母 多 样 性 及 其 食 用 安 全 性 研 究 济 南 齐 鲁 工 业 大 学 张 俊 杰 尚 益 民 陈 锦 永 等 河 南 不 同 地 区 赤 霞 珠 葡 萄 表 皮 酵 母 菌 多 样 性 研 究 中 国 酿 造 张 俊 杰 尚 益 民 程 大 伟 等 河 南 安 阳 赤 霞 珠 葡 萄 果 表 酵 母 菌 的 分 离 与 鉴 定 轻 工 学 报 文 雨 婷 张媱 李 杨 等 棉 花 黄 萎 病 菌 拮 抗 酵 母 菌 筛 选 及 鉴 定 河 南 农 业 科 学