1株生防菌的鉴定及其发酵条件优化.pdf

浙 江 大 学 学 报 农 业 与 生 命 科 学 版 46 2 177 188 2020 Journal of Zhejiang University A g r i c 2 Institute of New Fertilizer Resources and Technology Guizhou University Guiyang 550025 China 3 Guizhou Key Laboratory for Tobacco QualityStudy Guiyang550025 China Abstract The taxonomic identification and antimicrobial effect of a strain called F11 which has inhibitory effect on strawberry gray mold was studied In order to improve the fermentation efficiency of the strain the fermentation formula and conditions were optimized by orthogonal experiment and single factor test The results showed that the strain F11 could inhibit the growth and reproduction of 12 common pathogens with high inhibition rate reaching 79 88 or more which showed that this strain possessed broad spectrum and high efficiency antimicrobial effect and that it would be a hidden promising resource for biological control agent to resist plant diseases The strain F11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens by observation of colony morphology physiological and biochemical tests 16S rRNA and gyrB gene sequencing The fermentation medium of strain F11 was optimized from L 16 4 3 2 6 orthogonal test 3 00 g L beef extract 10 00 g L peptone 5 00g LNaCl 3 00g Lglucose 2 00g LMgCl 2 Furthermore thesinglefactortestfurthershowedthatbasedon DOI 10 3785 j issn 1008 9209 2019 05 301 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 31760133 贵 州 省 科 技 计 划 2017 0106 贵 州 省 科 技 计 划 项 目 黔 科 合 平 台 人 才 2017 5788 号 贵 州大学人才引进项目 2015 10 号 贵州省生物学一流学科建设项目 GNYL 2017 009 通信作者 Correspondingauthor 刘丽 https orcid org 0000 0002 4210 7450 E mail liuliz706 第一作者 Firstauthor 陈海念 https orcid org 0000 0003 3541 7116 E mail 571661476 收稿日期 Received 2019 05 30 接受日期 Accepted 2019 09 23 第 46 卷 浙 江 大 学 学 报 农 业 与 生 命 科 学 版 the optimized medium the suitable initial pH of strain F11 culture was 7 0 and the befitting temperature was 30 andtheproperoscillationratewas150r min whichthenumberofviablecellswere4 67 10 9 CFU mL K e y w o r d s biocontrolbacterium identification inhibitoryeffect orthogonalexperiment mediumoptimization 以 化 学 农 药 为 主 导 的 植 物 病 害 防 治 策 略 附 带 的 农 药 残 留 超 标 病 原 菌 抗 药 性 增 强 及 生 态 平 衡 被 破 坏 等 问 题 日 益 凸 显 1 3 而 微 生 物 防 治 表 现 出 的 无 污 染 无 公 害 长 效 性 处 理 费 用 低 廉 等 优 势 4 7 使 得 生 物 防 治 技 术 成 为 控 制 植 物 病 害 的 最 佳 选 择 之 一 8 9 目 前 许 多 有 益 微 生 物 已 应 用 于 植 物 病 害 防 治 中 10 12 包 括 真 菌 细 菌 和 一 系 列 放 线 菌 等 13 生 防 菌 种 类 不 同 其 生 物 防 治 的 机 制 也 不 相 同 如 枯 草 芽 孢 杆 菌 Bacillus subtilis B 916 产 生 的 抗 真 菌 蛋 白 物 质 通 过 核 糖 核 酸 酶 和 凝 结 作 用 抑 制 水 稻 稻 瘟 病 菌 核 病 纹 枯 病 及 灰 霉 病 病 原 菌 菌 丝 的 生 长 从 而 防 治 水 稻 多 种 病 害 14 木 霉 菌 Trichoderma spp 可 在 其 他 微 生 物 上 缠 绕 生 长 同 时 产 生 抗 菌 类 物 质 来 抑 制 该 微 生 物 的 活 性 降 低 病 原 微 生 物 的 致 病 能 力 促 进 植 物 生 长 以 多 粘 芽 孢 杆 菌 Bacillus polymyxa SQR 21 制备 的生 物有 机肥 施用 于香 蕉根 围 土 壤 中 可 提 高 香 蕉 植 株 根 尖 的 蛋 白 类 抗 菌 物 质 几 丁 质 酶 的 活 性 显 著 促 进 香 蕉 植 株 生 长 降 低 香 蕉 枯 萎 病 的 发 病 指 数 15 HELMY 等 16 发 现 从 荧 光 假 单 胞 菌 Pseudomonas fluorescens 中 分 离 纯 化 获 得 的 嗜 铁 素 可 有 效 遏 制 烟 草 赤 星 病 菌 Alternaria alternata 尖 孢 镰 刀 菌 Fusariumoxysporum 黄 曲 霉 Aspergillusflavus 等 多 种 病 原 菌 的 生 长 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 Bacillus amyloliquefaciens FZB42 产 生 的 聚 酮 化 合 物 对 由 梨 火 疫 病 病 原 菌 Erwinia amylovora 引 起 的 梨 火 疫 病 具 有 良 好 的 防 治 效 果 17 赵 青 云 等 18 发 现 枯 草 芽 孢 杆 菌Y IVI 能 促 进 香 草 兰 生 长 发 育 同 时 减 少 尖 孢 镰 刀 菌 的 数 量 降 低 连 作 障 碍 并 可 产 生 铁 载 体 吲 哚 乙 酸 等 物 质 促 进甜瓜生长 上 述 研 究 为 生 防 菌 更 好 地 应 用 于 农 业 生 产 提 供 了 一 定 的 参 考 依 据 展 现 出 生 防 菌 良 好 的 农 业 应 用 前 景 生 防 菌 株 的 种 属 确 定 可 培 养 性 发 酵 效 率 及 其 抑 菌 效 果 等 是 保 证 生 物 防 治 效 果 的 前 提 也 是 决 定 其 能 否 从 实 验 室 走 向 田 间 的 关 键 培 养 基 组 分 及 发 酵 条 件 皆 会 明 显 影 响 微 生 物 的 生 长 发 育 和 抑 菌 活 性 物 质 的 形 成 19 而 通 常 欲 提 高 生 防 菌 抑 菌 活 性 物 质 的 产 量 则 应 先 保 证 其 细 胞 产 量 20 鉴 于 此 我 们 对 课 题 组 前 期 研 究 筛 选 所 得 的1 株 对 草 莓 灰 霉 病 菌 strawberry gray mold 具 有 较 佳 拮 抗 作 用 的 菌 株 F11 开 展 了 进 一 步 研 究 测 试 了 该 菌 株 对 多 种 常 见 病 原 菌 的 抑 菌 效 果 并 结 合 形 态 学 生 理 生 化 方 法 16SrRNA 及gyrB 的 分 子 生 物 学 方 法 对 其 进 行 了 鉴 定 最 后 对 该 菌 株 的 发 酵 培 养 基 配 方 及 发 酵 条 件 进 行 了 优 化 筛 选 研 究 结 果 可 为 挖 掘 其 作 为 植 物 病 害 防 治 的 潜 在 资 源 提 供 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1 1 供 试 材 料 供 试 菌 株 F11 菌 株 由 贵 州 大 学 新 型 肥 料 资 源 与 技 术 研 究 所 在 前 期 研 究 时 从 草 莓 根 际 土 壤 中 分 离筛选得到 对草莓灰霉病菌具有拮抗性能 供 试 病 原 菌 水 稻 稻 瘟 病 菌 Pyriculariaoryzae 猕 猴 桃 葡 萄 座 腔 菌 Botryosphaeria dothidea 烟 草 黑 胫 病 菌 Phytophthora parasitica var 烟 草 炭 疽 病 菌 Colletotrichum nicotianaeAv 樟 树 胶 孢 炭 疽 病 菌 Colletotrichum gloeosp orioides 高 粱 斑 点 病 菌 Pseudomonas syringae pv syringae Van Hall 玉 兰 炭 疽 病 菌 Colletotrchum magnoliaecamara 核 盘 菌 Sclerotinia sclerotiorum 禾 谷 炭 疽 菌 Colletotrichum graminicola Cesati Wilson 玉 米 大 斑 病 菌 Setosphaeria turcica 辣 椒 炭 疽 菌 Colletotrichum capsici 烟 草 赤 星 病 菌 Alternaria alternata Freis Keissler 共12 种 病 原 菌 均 为 贵 州 省山地农业病虫害重点实验室惠赠 1 2 培 养 基 营养肉 汤 nutrientbroth NB 液体培 养基 3 00g 牛 肉 膏 10 00g 蛋 白 胨 5 00gNaCl 2 00g LMgCl 2 加 水 至1000mL pH7 0 高 压 1 10 5 Pa 灭 菌30min 冷却备用 NB 固 体 培 养 基 在NB 液 体 培 养 基 的 基 础 上 加 入 琼 脂20 0 g 高 压 1 10 5 Pa 灭 菌30 min 冷 却 备用 178 第 2 期 陈 海 念 等 1 株 生 防 菌 的 鉴 定 及 其 发 酵 条 件 优 化 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 potato dextrose agar PDA 培 养 基 200g 马 铃 薯 去 皮 切 块 煮 沸0 5h 纱 布 过 滤 20g 蔗 糖 20g 琼 脂 加 水 至1000mL pH 自 然 7 0 高 压 1 10 5 Pa 灭 菌30 min 冷 却 后 倒 平 板 备用 1 3 种 子 菌 液 的 制 备 取 一 环F11 菌 苔 于NB 固 体 培 养 基 上 画 线 在 30 恒 温 培 养 箱 GXZ 258A 浙 江 省 宁 波 江 南 仪 器 厂 中 培 养24h 后 挑 取 单 菌 落 接 种 于NB 液 体 培 养 基 中 于30 150r min 下 振 荡 培 养18h 经 前 期 F11 生长曲线确定 获得F11 种子菌液 1 4 试 验 设 计 1 4 1 菌 株F11 对 病 原 菌 的 抑 菌 效 果 分 析 采 用 经 典 的 平 板 对 峙 培 养 法 观 察 菌 株F11 的 拮 抗 情 况 并 测 定 其 对 各 病 原 菌 的 抑 菌 圈 大 小 具 体 方 法 为 将 直 径 为7 5 mm 的 圆 形 病 原 菌 苔 菌 块 置 于 PDA 平 板 的 中 央 在 距 平 板 中 心2 0cm 处 的4 个 对 角 线 上 接 种F11 拮 抗 菌 每 个 处 理 重 复3 次 另 在PDA 平 板 中 心 接 种 病 原 真 菌 作 空 白 对 照 在28 生 化 培 养 箱 内 培 养 连 续 培 养6 8d 测 定 抑 菌 圈 大 小 1 4 2 菌 株F11 的 鉴 定 1 4 2 1 菌株F11 的形态特征和生理生化特性鉴定 将 稀 释 的 菌 株 发 酵 液 均 匀 涂 布 于NB 固 体 培 养 基 平 板 上 放 入 恒 温 培 养 箱 28 条 件 下 恒 温 培 养 2d 出 现 单 菌 落 后 观 察 菌 落 形 状 颜 色 边 缘 表 面 隆 起 形 状 透 明 度 等 并 在LeicaDM500 电 子 显 微 镜 德 国 徕 卡 公 司 下 观 察 细 胞 的 形 状 结 构 大 小 等 菌 株 的 形 态 特 征 和 生 理 生 化 特 性 鉴 定 参 照2012 年 修 订 的 伯 杰 氏 系 统 细 菌 学 手 册 第 二 版 21 1 4 2 2 菌株F11 的16SrRNA 和gyrB 基因鉴定 菌 株DNA 的 提 取 取 对 数 生 长 期 的 菌 株F11 菌 液 以1 2 10 4 r min 离 心5min 收 集1 5mL 上 清 液 将 菌 体 悬 浮 于 400 L 提 取 液 10 mmol L NaCl 20 mmol L Tris HCl 1 mmol L 乙 二 胺 四 乙 酸 ethylene diamine tetraacetic acid EDTA 中 pH 8 0 加 入100 L 终 质 量 浓 度 为100 g mL 的 蛋 白 酶 K 和500 g mL 的 十 二 烷 基 硫 酸 钠 sodium dodecyl sulfate SDS 溶 液 将 其 轻 轻 混 匀 后 于37 条 件 下 水 浴1h 再 在65 条 件 下 水 浴1h 加 入600 L 的 酚 三 氯 甲 烷 异 戊 醇 室 温 下 颠 倒 混 匀 后 以1 2 10 4 r min 离 心10min 将 上 清 液 移 入1 5mL 离 心 管 重 复 该 步 骤 向 含 有DNA 的 上 清 液 水 相 中 加 入 1 10 体 积 的3mol L 乙 酸 钠 pH5 5 和2 倍 体 积 的 无 水 乙 醇 轻 颠 混 匀 后 于 20 条 件 下 沉 淀1 h 以 1 2 10 4 r min 离 心15 min 弃 上 清 液 用70 无 水 乙 醇 洗 涤 沉 淀 以1 2 10 4 r min 离 心15min 弃 上清 液 风 干 用50 150 L TE 缓 冲 液 10 mmol L Tris HCl 与1mmol LEDTA 的 混 合 缓 冲 液 pH8 0 溶解基因组DNA 在 20 条件下储存 备用 菌 株DNA 的 聚 合 酶 链 式 反 应 polymerasechain reaction PCR 扩 增 以 菌 株F11 基 因 组DNA 为 模 板 进 行16SrRNA 和gyrB 基 因 扩 增 16SrRNA 引 物 序 列 如 下 27F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 1492R 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 gyrB 基 因 引 物 序 列 22 如 下 UP 1 5 GAAGTCATCATG ACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA 3 UP 2r 5 AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTC NACRTCNGCRTCNGTCAT 3 PCR 扩 增 体 系 为 10 mol L 正 反 向 引 物 各1 L 天 根2 TaqPCR 混 合 液12 5 L 模 板DNA2 L 用 无 菌 去 离 子 水 补 足 至 25 L 其 中 天 根2 Taq PCR 混 合 液 包 括 0 1 U L Taq 聚 合 酶 各500 mol L dNTP 20 mmol L Tris HCl pH 8 3 100 mmol L KCl 3 mmol L MgCl 2 及 其 他 稳 定 剂 和 增 强 剂 PCR 反 应 条 件 95 预 变 性 4 min 98 变 性10 s 62 退 火1 min 72 延 伸2 min 30 个 循 环 72 延 伸8 min 将16S rRNA 和 gyrB 基 因 扩 增 产 物 纯 化 后 进 行 测 序 分 析 通 过 NCBI 数 据 库 https blast ncbi nlm nih gov 与 GenBank 中 的 序 列 对 测 序 结 果 进 行Blast 比 对 分 析 并 构 建 系 统 发 育 树 从 分 子 水 平 上 对 菌 株F11 进 行 鉴定 1 4 3 培 养 基 配 方 优 化 采 用L 16 4 3 2 6 的 正 交 设 计 对 菌 株F11 培 养 基 配 方 进 行 优 化 其 中 4 水 平 的3 因 素 分 别 为 牛 肉 膏 蛋 白 胨 NaCl 2 水 平 的6 因 素 分 别 为 葡 萄 糖 Mn Mo Fe B Mg 共 设 置1 16 号 处 理 表1 以NB 培 养 基 处 理17 作 为 空 白 对 照 各 处 理 按1 接 种 量 接 种 后 在30 150r min 条 件 下 振 荡18h 采 用 T6 XSJ 紫外可见 分光光度 计 北京普析 通用仪器 有 限 责 任 公 司 测 定 可 表 征 菌 悬 液 细 胞 浓 度 的 吸 光 度 值D 600nm 23 24 每 个 处 理 重 复5 次 完 全 随 机 排 列 根 据 正 交 试 验 结 果 分 析 各 试 验 因 素 的 适 宜 水 平 1 4 4 发 酵 条 件 优 化 对 菌 株F11 进 行 不 同 初 始pH 6 0 6 5 7 0 7 5 179 第 46 卷 浙 江 大 学 学 报 农 业 与 生 命 科 学 版 8 0 不 同 培 养 温 度 25 30 33 35 40 和 不 同 振 荡 速 率 100 150 170 180r min 的 发 酵 条 件 优 化 试 验 各 处 理 的F11 种 子 液 接 种 量 均 为1 其 中 不 同 初 始pH 试 验 的 培 养 温 度 为30 振 荡 速 率 为 150r min 不 同 培 养 温 度 试 验 的 培 养 基pH 为 优 选 确 定 的pH 振 荡 速 率 为150 r min 不 同 振 荡 速 率 试 验 的 培 养 基pH 为 优 选 确 定 的pH 培 养 温 度 为 优 选 确 定 的 温 度 各 处 理 重 复5 次 完 全 随 机 排 列 振 荡 培 养18 h 测 定 发 酵 液 吸 光 度 值D 600nm 由 此 确 定 菌 株F11 的 最 佳 培 养 基 的 初 始pH 培 养 温 度 和 振 荡 速 率的优化水平 1 4 5 优 化 效 果 鉴 定 按1 接 种 量 将 菌 株F11 接 种 于 优 选 配 方 培 养 基 上 在 最 佳 发 酵 条 件 下 振 荡 培 养18h 获 得 从 对 数 期 刚 转 入 稳 定 期 的 菌 株F11 发 酵 液 测 定 发 酵 液 在 600nm 处 的 吸 光 度 值 和 活 菌 数 以NB 液 体 培 养 基 为对照 鉴定优化效果 1 5 数 据 分 析 采 用 混 菌 法 计 算 相 对 抑 制 率 采 用 十 字 交 叉 法 测 量 生 长 菌 落 直 径 按 下 列 公 式 计 算 出 相 对 抑 制 率 相 对 抑 制 率 对 照 菌 落 直 径 mm 处 理 菌 落 直 径 mm 对 照 菌 落 直 径 mm 7 5 mm 100 式 中 处理菌落的初始直径为7 5mm 试 验 数 据 采 用Excel2010 整 理 并 作 图 采 用DPS 14 0 进 行 单 因 素 和 正 交 试 验 方 差 分 析 采 用MEGA 6 0 软 件 中 的 邻 接 法 构 建 系 统 发 育 树 2 结 果 与 分 析 2 1 菌 株F11 对 多 种 病 原 菌 的 抑 制 作 用 经 平 板 对 峙 培 养 试 验 对 病 原 菌 生 长 直 径 进 行 测 定 并 采 用t 检 验 发 现 经 菌 株F11 拮 抗 处 理 后 病 原 菌 生 长 受 到 了 明 显 抑 制 可 见F11 对 多 种 病 原 菌 的 生 长 具 有 拮 抗 性 能 表2 其 中 菌 株F11 对 核 盘 菌 的 抑 制 作 用 最 强 相 对 抑 制 率 达 到100 00 其 次 为 玉 米 大 斑 病 菌 菌 株F11 对 其 的 相 对 抑 制 率 为 94 74 且 对 烟 草 炭 疽 病 菌 玉 兰 炭 疽 病 菌 和 猕 猴 桃 葡 萄 座 腔 菌 等 病 原 菌 的 抑 制 率 均 达79 88 以 上 由 此 说 明 F11 具 有 高 效 广 谱 的 抑 菌 效 果 表 现 出 良好的生防应用潜能 2 2 菌 株F11 的 形 态 特 征 如 图1A 所 示 菌 株F11 菌 落 呈 圆 形 边 缘 不 整 齐 呈 锯 齿 状 表 面 干 燥 有 褶 皱 无 黏 性 不 透 明 乳 白 色 光 学 显 微 镜 下 可 见 该 菌 株 细 胞 为 短 杆 状 部 表 1 L 16 4 3 2 6 正交试验设计方案 Table1 DesignofL 16 4 3 2 6 orthogonalarrayexperiment 处理 Treatment 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 牛肉膏 Beefextract 1 1 00 1 1 00 1 1 00 1 1 00 2 2 00 2 2 00 2 2 00 2 2 00 3 3 00 3 3 00 3 3 00 3 3 00 4 5 00 4 5 00 4 5 00 4 5 00 蛋白胨 Peptone 1 2 00 2 5 00 3 7 00 4 10 00 1 2 00 2 5 00 3 7 00 4 10 00 1 2 00 2 5 00 3 7 00 4 10 00 1 2 00 2 5 00 3 7 00 4 10 00 NaCl 1 2 00 2 5 00 3 7 00 4 10 00 2 5 00 1 2 00 4 10 00 3 7 00 3 7 00 4 10 00 1 2 00 2 5 00 4 10 00 3 7 00 2 5 00 1 2 00 葡萄糖 Glucose 1 0 00 1 0 00 2 3 00 2 3 00 2 3 00 2 3 00 1 0 00 1 0 00 1 0 00 1 0 00 2 3 00 2 3 00 2 3 00 2 3 00 1 0 00 1 0 00 Mn MnSO 4 2H 2 O 1 0 00 1 0 00 2 0 50 2 0 50 2 0 50 2 0 50 1 0 00 1 0 00 2 0 50 2 0 50 1 0 00 1 0 00 1 0 00 1 0 00 2 0 50 2 0 50 Mo Na 2 MoO 4 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 B H 3 BO 3 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 Fe FeSO 4 7H 2 O 1 0 00 2 0 10 1 0 00 2 0 10 2 0 10 1 0 00 2 0 10 1 0 00 2 0 10 1 0 00 2 0 10 1 0 00 1 0 00 2 0 10 1 0 00 2 0 10 Mg MgCl 2 1 0 50 2 2 00 2 2 00 1 0 50 1 0 50 2 2 00 2 2 00 1 0 50 2 2 00 1 0 50 1 0 50 2 2 00 2 2 00 1 0 50 1 0 50 2 2 00 括号内的数据为培养基中各因子水平的实际量 g L Datainparenthesesaretheactualdosageofthelevelofeachfactorinthemedium g L 180 第 2 期 陈 海 念 等 1 株 生 防 菌 的 鉴 定 及 其 发 酵 条 件 优 化 分 椭 圆 状 有 芽 孢 形 成 两 端 钝 圆 很 少 成 链 成 单 或 是 成 短 链 排 列 初 步 鉴 定 为 芽 孢 杆 菌 属 图1B 2 3 菌 株F11 的 生 理 生 化 特 征 生 理 生 化 鉴 定 结 果 表3 表 明 菌 株F11 经 革 兰 氏 染 色 呈 阳 性 在1 8 NaCl 处 理 条 件 下 均 可 生 长 在 鸟 氨 酸 脱 羧 酶 赖 氨 酸 脱 羧 酶 甲 基 红 反 应 硫 化 氢 实 验 中 结 果 为 阴 性 在 半 乳 糖 苷 酶 接 触 酶 氧 化 酶 脲 酶 精 氨 酸 双 水 解 酶 淀 粉 水 解 明 胶 水 解 酪 素 水 解 硝 酸 盐 还 原 柠 檬 酸 生 长 50 生 长 VP Voges Proskauer 反 应 的 实 验 中 结 果 为 阳 性 对 比 发 现 菌 株F11 的 生 理 生 化 特 征 与 其 他4 种 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 基 本 一 致 结 合 菌 株F11 的 菌 落 及 细 胞 形 态 特 征 初 步 拟 定 菌 株F11 为 解 淀 粉 芽 孢 杆菌 2 4 菌 株F11 的 分 子 鉴 定 在 细 菌 的 进 化 过 程 中 16S rRNA 基 因 和gyrB 基 因 具 有 较 高 的 保 守 性 16S rRNA 平 均 每5 000 万 年 碱 基 的 替 换 变 化 率 为1 而gyrB 基 因 每100 万 年 碱 基 的 替 换 变 化 率 为0 7 0 8 gyrB 可 弥 补 16SrRNA 序 列 无 法 区 分 近 缘 种 的 缺 陷 能 更 好 地 区 分 近 似 种 因 此 结 合2 种 基 因 扩 增 测 序 方 式 可 使 菌 株 的 种 属 鉴 定 更 为 准 确 经 测 序 菌 株F11 的 16S rRNA 及gyrB 基 因 序 列 长 度 分 别 为1 457 bp 和 879bp 测 序 结 果 通 过NCBI 数 据 库 进 行Blast 比 对 其 识 别 号 分 别 为8TCWE8SN015 和8TE5X4BT014 A B 100 m A 肉眼观察 B 光学显微镜下观察 A Visualobservation B Observationunderopticalmicroscope 图1 菌株F11 的形态 Fig 1 MorphologyofstrainF11 表 2 菌株 F 11 对 12 种病原菌的抑制作用 Table2 InhibitoryeffectsofstrainF11on12pathogens 病原菌 Pathogen 烟草黑胫病菌 Phytophthoraparasiticavar 烟草炭疽病菌 ColletotrichumnicotianaeAv 樟树胶孢炭疽病菌 Colletotrichumgloeosporioides 高粱斑点病菌 Pseudomonassyringaepv syringaeVanHall 玉兰炭疽病菌 Colletotrchummagnoliaecamara 核盘菌 Sclerotiniasclerotiorum 禾谷炭疽菌 ColletotrichumgraminicolaCesatiWilson 玉米大斑病菌 Setosphaeriaturcica 烟草赤星病菌 Alternariaalternata Freis Keissler 辣椒炭疽菌 Colletotrichumcapsici 水稻稻瘟病菌 Pyriculariaoryzae 猕猴桃葡萄座腔菌 Botryosphaeriadothidea 相对抑制率 Relativeinhibition rate 80 53 90 69 86 67 80 97 83 51 100 00 82 15 94 74 81 42 86 06 79 88 91 52 病原菌直径 Pathogendiameter 对照组 Controlgroup cm 5 63 1 02 5 05 0 35 9 00 0 00 8 63 0 64 8 63 0 63 9 00 0 00 6 63 0 49 7 40 0 96 7 30 0 56 9 00 0 00 6 30 0 36 9 00 0 00 F11 拮抗组 AntagonismgroupofF11 cm 1 70 0 26 1 15 0 07 1 85 0 07 2 25 0 49 2 05 0 21 0 75 0 01 1 80 0 20 1 10 0 20 1 97 0 21 1 90 0 20 1 87 0 21 1 45 0 21 t 检验 ttest 6 46 15 30 12 35 11 81 13 54 11 82 15 73 11 08 15 54 12 31 18 44 14 13 P 值 Pvalue 0 0029 0 0021 0 0001 0 0013 0 0087 0 0001 0 0001 0 0002 0 0001 0 0014 0 0001 0 0002 181 第 46 卷 浙 江 大 学 学 报 农 业 与 生 命 科 学 版 选 取 相 似 度 较 高 的 序 列 及 大 肠 埃 希 菌 等 相 似 度 较 低 的 菌 株 序 列 为 外 群 采 用 邻 近 法 构 建 系 统 发 育 树 16S rRNA 系 统 发 育 树 图2 显 示 菌 株F11 与 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌B amyloliquefaciens Fito F321 序 列 号 MG836692 1 在 同 一 分 支 上 Blast 比 对 相 似 性 高 达99 79 在gyrB 基 因 系 统 发 育 树 图3 上 表 3 菌株 F 11 与其他解淀粉芽孢杆菌生理生化鉴定结果对比 Table3 ComparisonofphysiologicalandbiochemicalidentificationresultsofstrainF11withotherBacillusamyloliquefaciens 指标Index 半乳糖苷酶 galactosidase 接触酶Catalase 氧化酶Oxidase 脲酶Urease 精氨酸双水解酶Argininedihydrolase 淀粉水解Starchhydrolysis 明胶水解Gelatinhydrolysis 酪素水解Caseinhydrolysis 鸟氨酸脱羧酶Ornithinedecarboxylase 赖氨酸脱羧酶Lysinedecarboxylase 硝酸盐还原Nitratereduction 柠檬酸生长Citricacidgrowth 50 生长Growthat50 VP 反应Voges Proskauerreaction 甲基红反应Methylredreaction 硫化氢产生Hydrogensulfideproduction 甘露醇Mannitol 山梨醇Sorbitol 鼠李糖L rhamnose 蔗糖D sucrose 蜜二糖Melibiose 革兰氏染色Gramstain F11 LX1 25 WTD 26 H 2 27 H 7 28 LX1 WTD H 2 H 7 为4 种解淀粉芽孢杆菌 阳性反应 阴性反应 LX1 WTD H 2 andH 7belongtoBacillusamyloliquefaciens Positivereaction Negativereaction NR116022 1 Bacillus amyloliquefaciens BCRC 11601 CP006960 1 Bacillus amyloliquefaciens UMAF6614 CP014783 1 Bacillus amyloliquefaciens B15 KY007189 1 Bacillus amyloliquefaciens SH207 MG836692 1 Bacillus amyloliquefaciens Fito F321 F11 NR102783 2 Bacillus subtilis subsp subtilis NR112116 2 Bacillus subtilis IAM 12118 NR116017 1 Bacillus subtilis BCRC 10255 AM293345 1 Bacillus thuringiensis NR 074540 1 Bacillus cereus ATCC 14579 KY982963 1 Bacillus sp CKG5 KY982962 1 Bacillus thuringiensis CKG2 AJ704827 1 Bacillus sp P9 J01859 1 Escherichia coli M25588 1 Escherichia coli 52 98 60 99 87 100 100 88 13 13 75 94 7 图2 16SrRNA 的系统发育树 Fig 2 Phylogenetictreeof16SrRNA 182 第 2 期 陈 海 念 等 1 株 生 防 菌 的 鉴 定 及 其 发 酵 条 件 优 化 菌 株F11 与 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 B amyloliquefaciens Rx 35 序 列 号 JN086142 1 在 同 一 分 支 上 Blast 比 对 相 似 性 高 达99 89 结 合 菌 株 形 态 和 生 理 生 化 特 征 确 定 菌 株 F11 为 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 B amyloliquefaciens 2 5 基 于NB 培 养 基 的 配 方 优 化 如 图4 所 示 菌 落F11 菌 悬 液D 600nm 值 在 处 理 间 存 在 显 著 差 异 P 0 05 其 中 正 交 试 验 处 理12 14 的D 600nm 值 均 显 著 高 于NB 培 养 基 处 理17 的 D 600nm 值 0 59 以处理12 的D 600nm 值 1 41 为最高 图5 与 表4 显 示 在 各 因 子 中 除B 和Fe 的2 水