鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定.pdf

收 稿日期 修 订日期 基 金项目 国家重点研发计划 上海出入境检验检疫科研项目 通 信作者 鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定 王 晨 俞 禄珍 宋 绍禕 李 友军 田 沂民 上海东郁园林科技有限公司 上 海 中华人民共和国上海海关 上 海 摘 要 草莓滑刃线虫是一种重要的叶和芽寄生线虫 可侵染多种重要花卉 经济作物 被列入我国检疫性有害生物 名录 目前 草莓滑刃线虫的鉴定以形态学鉴定为主 但一线口岸常分离不到雌虫 鉴定困难 本研究采用形态特 征和分子特征相结合的方法对草莓滑刃线虫进行鉴定 对鸢尾种苗中截获的滑刃属线虫群体雌虫 雄虫进行形态观 察和形态测计并与已报道文献进行比较 扩 增该群体的 区 并测序 构建基于 序列的系统发育 进 化树 采用草莓滑刃线虫特异引物对该群体 样 本进行扩增 结果表明 该群体与草莓滑刃线虫俄罗斯种群 的测量值相接近 系统进化关系分析显示 该群体与 公 布的草莓滑刃线虫均处于同一进化支 采用草莓滑刃 线虫特异引物 扩增可产生片段大小为 的 目的条带 关键词 草莓滑刃线虫 形态学特征 系统发育分析 鉴定 中图分类号 文 献标识码 草 莓滑刃线虫 是 一 种叶和芽寄生线虫 可侵染多种重要花卉 经济作 物 造成叶片 幼芽 嫩枝严重损伤 是极具破坏性 的 具有重要经济意义的线虫 草 莓是该线虫典 型的寄主 感染该线虫后 植株结果量大大减少且果 小 歪曲 严重影响草莓的品质及产量 该 线虫 还可侵染蕨类 百合科 石蒜科 鸢尾科 毛茛科 菊 科 报春花科等 多 种植物 其中涉及多种经济价 值较高的观叶 观花植物 已成为世界多个国家花卉 产业的重要威胁之一 该 线虫被我国列入检疫 性有害生物名录 年 年 上 海口岸多次 在进 境 铃 兰 酢 浆 草 落 新妇 芍 药 等 观赏花卉种苗中截获草莓滑刃线虫 目 前 草莓滑刃线虫的鉴定以传统的形态学鉴定为 主 但草莓滑刃线虫及其近似种的形态特征极其相 似 采用传统的形态学鉴定方法难以区分 且分离不 到雌虫时 仅靠幼虫或雄虫无法进行准确鉴定 故该 法的使用局限性较大 本实验室通过查阅国内外文 献并开展试验摸索 建立了草莓滑刃线虫形态学与 分子生物学相结合的鉴定技术 可供参考使用 现将 上海口岸进境一批次鸢尾种苗中草莓滑刃线虫的检 疫过程报道如下 材 料与方法 线 虫分离 口岸进境的鸢尾种苗为繁殖材料 地下部分根 系稍修剪 地上部分修剪后高度仅 左 右 含基 部茎 叶及芽 剪 取鸢尾种苗的地上部分 采用浅 盘法进行线虫分离 次日 过 目网筛收集线虫 在 体视显微镜下镜检 形 态学鉴定 挑取线虫制成临时玻片 在光学显微镜下进行 形态观察 拍照及测量 并采用 公 式对线虫 进行测计 分 子生物学鉴定 线虫 提 取 用挑针挑取线虫若干条 放入去离子水中洗涤 次 备用 挑取单条经过洗涤的线虫 用挑针捅破 或割 成 多 段 采 用 试 剂盒提取 通 用引物 扩 增 采用线虫 通 用引物对线虫 进 行 扩 增 引物为 反 应 体 系 包 括 引 物各 模 板 聚 合 酶 总 体积 扩 增程序为 个 循环 扩 增产物在 琼 脂糖凝胶 缓 冲液中 电 泳 染 色 后 用 凝 胶 成 像 系 统 分析 将所得 产 物送上海生工生物有限公司进 行测序 测得的序列用 程 序比对后进行校 对和拼接 并在 中 进 行序列分 析 利用 软 件以最大似然法 构 建系统进化树 特异引物 扩 增 采用草莓滑刃线虫的特异引物对线虫 进 行 扩 增 上 游 引 物 下 游 引 物 反 应 体系同 扩 增程序参照 等 预 期 扩增产物片段大小为 结 果与分析 形 态学描述 雌虫 虫体细长 热杀死后虫体直到弯 侧区窄 侧线 条 头部稍高 光滑 前端平 略缢缩 口针 细 口针基部球小而明显 食道体部呈细长管状 中 食道球明显 呈长卵圆形 食道腺长叶状 背覆盖 肠 阴门位于体中后部 阴门唇稍突起 阴门横裂 阴道向前倾斜 阴道长约为阴门处体宽的 单 卵巢 前伸 卵母细胞单行排列 受精囊长卵圆形 通常有精子 后阴子宫囊长囊状 长度超过肛阴距 的 常有精子 尾长圆锥形 末端尖细 中间有 一钝的尾尖突 雄虫 热杀死后虫体尾部向腹面弯曲 体前部与 雌虫相似 单精巢 前伸 精母细胞单行排列 交合 刺玫瑰刺形 有中等发达的基顶和基喙 交合刺背缘 长 尾 部具 对尾乳突 分别位于 肛门后 尾中部和近尾端处 尾圆锥形 末端有 个 钝的尾尖突 测 量值 本研究种群草莓滑刃线虫雌虫的形态测量值和 其他种群比较结果显示 与 描 述的俄罗斯 种群相比 值 基本吻合 其他测量值体 长 口针长 尾长较长 但其数值范围部分重叠 与 顾建锋描述的荷兰种群相比 值 及口针长一 致性较高 虽本种群体长较长 但在荷兰种群的范围 内 值 存在一定差异 与国内刘维志描述的种群 相比 值 口 针长 尾长较一致 值 较 大 但测量值均有重叠范围 雄虫测量值体长 口针 长较其他种群较长 值均与各种群测量 值范围 大部分重叠 卷 第 期 王晨等 鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定 图 草莓滑刃线虫雌虫形态特征 图 草莓滑刃线虫雄虫形态特征 表 鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫雌虫与其他种群的测量值比较 形 态指标 本 研究种群 中 国种群 荷 兰种群 俄 罗斯种群 口 针长 尾 长 代 表样本数 为 体长 为体长与最大体宽的比值 为体长与体前端至食道与肠连接处长度的比值 为 体长与尾长的比值 为 尾长 与肛门处体宽的比值 为体前端至阴门的距离 体 长 长度测量单位为 下 同 表 鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫雄虫与其他种群的测量值比较 形 态指标 本 研究种群 中 国种群 荷 兰种群 俄 罗斯种群 口 针长 交 合刺长 尾 长 图 基于滑刃属线虫 区序列构建的系统进化树 区 系统进化分析 采用引物 对 该种群线虫的 区 域进行扩增 得到约 的 片段 经双向 测序及拼接得到 序 列 通过 比 对分 析 发现该序列 登 录号为 与 草莓 滑刃线虫 序 列相差 相 似 度达 系统发育树显 示该线 虫与草莓滑刃线虫位于同一分支 支持率为 其 中 本 线 虫 群 体 与 俄 罗 斯 日 本 的种 群亲缘关系更近 特 异引物检测 采用草莓滑刃线虫特异引物扩增本研究种群雌 虫 幼虫 样 本及阳性对照均获得 的 特 异性片段 空白对照未发生特异性扩增 图 图 草莓滑刃线虫特异引物 扩增凝胶电泳图 卷 第 期 王晨等 鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定 综 合形态学特征及分子鉴定结果 确认鸢尾种 苗中截获的线虫为草莓滑刃线虫 讨 论 近 年来 我国花卉产业规模不断扩大 种球的进 口需求量也大幅增加 据统计 我国已成为仅次于 美国的荷兰花卉种球第二大进口国 进 口的种 球品种繁多 主要有百合 风信子 郁金香 洋水仙 等 球根类花卉是多年生草本花卉 可在地下存活 多年 因此其根茎携带有害线虫的风险很高 近年 来 我国口岸多次在进境种苗中截获鳞球茎茎线虫 腐烂茎线虫 草莓滑刃线虫 菊花滑刃线虫等检疫性 线虫 草 莓滑刃线虫是重要的检疫性病原线虫 该线 虫世界分布范围广 欧洲 原苏联各成员国 日本 美 国 加拿大 新西兰 澳大利亚等国均有报道 我国局 部地区 辽宁 广东 云南等 有报道发生 该 线 虫的远距离传播主要依靠种苗的调运 因此口岸应 加强对进境种苗的线虫检疫工作 谨防检疫性线虫 随种苗在国内种植时扩散 对我国农林业 花卉业生 产造成严重威胁 目前对草莓滑刃线虫的鉴定主要依靠传统的形 态学鉴定 但草莓滑刃线虫及其近似种的形态特征 极其相似 传统的形态学鉴定方法很难区分 如 等 都 曾在一段时间内被认为是草莓滑刃线虫的同物异 名 本 实验室采用形态学与分子生物学相结合 的鉴定方法 可实现对样品中的幼虫进行鉴定 且对 鉴定人员的专业性要求不高 适合一线口岸进行 推广 本次鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫种群 其形态测量值与俄罗斯种群最接近 基于 区 构建的系统发 育树显示 该种群与俄罗斯种群亲 缘关系 更 近 这 可 能 与 该 批 鸢 尾 种 苗 来 自 于 荷 兰相关 参 考文献 国 家质量监督检验检疫总局 草 莓滑刃线虫 检疫鉴定方法 北京 中国标准出版社 刘 维 志 植 物 线 虫 志 北 京 中国农业出版社 张 绍升 植物线虫病害诊断和治理 福州 福建科学技术 出版社 刘 维志 草莓叶芽线虫病 新农业 顾 建锋 杨兰英 徐瑛 进口百合种球中截获草莓滑刃线虫 植物检疫 李 艳梅 百合 市场仍需突破 中国花卉园艺 动植物检验检疫 信息资源共享服务平台 责 任编辑 田 喆 櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍 更 正 本 刊 年 第 期的 南方根结线虫侵染下罗汉果 转录因子的鉴定分析 作 者李惠敏 李佳 慧 程颖 韦文琼 李璐璐 陈玉梅 页 表 中的 的 表达模式 应无上标 表 达 模式 则 有上标 特此更正 并向作者和读者致歉 植物保护 编辑部 年 月 日