复合促生菌株筛选及其对油菜、黄瓜幼苗的促生效果.pdf

15 Vegetables 2020 6 试验研究 复合促生菌株筛选及其对油菜 黄瓜幼苗的促生效果 张 亮 1 盛 浩 1 谭 丽 2 袁 红 1 易建平 3 邓立平 4 1 湖南农业大学资源环境学院 湖南 长沙 410128 2 醴陵市农业农村局土壤肥料工作站 湖南 醴陵 412200 3 醴陵市 农业农村局 湖南 醴陵 412200 4 醴陵市农技推广中心 湖南 醴陵 412200 收稿日期 2020 03 11 基金项目 国家自然科学基金 41571234 湖南省自然科学基金 2019JJ50259 1515 学术创新团队带头人培养 项目 通讯作者 谭丽 摘要 为了筛选获得复合型功能微生物 PGPR 菌株材料 进而从功能微生物的角度理解稻 油轮 作制度的优势 以稻 稻 稻 油轮作制度下耕层水稻土壤作为筛选源 采用选择性培养基传统培养法 对可培养细菌 固氮菌 解磷菌以及产IAA 菌株进行分离和筛选 并利用人工气候箱培育试验验证了对 部分筛选获得的复合型促生菌株对油菜 黄瓜幼苗早期生物促生效果 结果表明 稻 稻轮作耕层土壤 可分离固氮菌35株 解磷菌3 株 稻 油轮作耕层土壤可分离固氮菌38株 解磷菌35株 具有固氮 解磷 以及较强生长素分泌能力的复合型促生菌株6株 其普遍对油菜和黄瓜早期幼苗株高生长具有一定的促生 效果 可分别提高25 45 111 96 和4 45 18 22 此外 DD 69和DY 111 菌株对黄瓜根长 D Y 6 和 DD 79菌株对黄瓜鲜质量具有显著的促生作用 关键词 植物根际促生菌 轮作 水稻土 菌株筛选 油菜 黄瓜 Screening of Multifunctional PGPR and Their Promotion Effects on Rape and Cucumber Seedlings ZHANG Liang 1 SHENG Hao 1 TAN Li 2 YUAN Hong 1 YI Jianping 3 DENG Liping 4 1 College of Resources and Environment Hunan Agricultural University Changsha 410128 China 2 Soil Fertilizer Work Station Liling Agricultural and Rural Bureau Liling 412200 China 3 Liling Agricultural and Rural Bureau Liling 412200 China 4 Liling Agricultural Technology Extension Center Liling 412200 China Abstract In order to obtain the materials of composite functional microbial PGPR strains and then understand the advantages of rice rape system from the perspective of functional microorganisms using the arable soil of rice rice and rice rape system as the screening sources the cultivable bacteria nitrogen fixing bacteria NFB phosphate solubilizing bacteria PSB and auxin bacteria AB were isolated and screened by traditional selective medium culture method In the incubator culture experiment the early biological growth promoting effect of some selected compound growth promoting strains on rape and cucumber seedlings was verified The results showed that 35 strains of NFB strains and 3 PSB strains could be isolated from top 16 Vegetables 2020 6 试验研究 化肥和农药在现代农业生产中发挥着重要作 用 然而随着化肥与农药使用量的逐年增加 其 残留物对环境造成了巨大危害 在提倡高产 高 效 绿色农业的大背景下 高效 复合型促生菌 的研究与应用为寻求传统化肥 农药替代产品以 及修复受损土壤环境指明了方向 根际促生菌 Plant Growth Promoting Rhizobacteria PGPR 泛指一类自由生长在根际土壤环境中或根系内 部 并具有促进植物生长或增加作物产量 抑制 病虫害能力的根际细菌 其对克服土壤逆境 改 善微生态环境具有特殊意义 1 目前为止 国内 外已经发现的具有防病促生潜能的根际微生物有 20多个种属 包括根瘤菌 沙雷氏属 荧光假单 孢菌 芽孢杆菌等 2 上述根际促生菌对于植物 的促生机制主要包括合成对于植物生长发育有直 接促进作用的物质 如吲哚乙酸 IAA 等植物激 素 改变元素形态促进植物对于养分的吸收等 如固氮 解磷 2 8 然而 大多数菌株在克服 养分 病害逆境时功能较为单一 因此 筛选获 得具有复合能力的促生菌株 对高效改善根际营 养与调控土壤微生态环境具有非常重要的意义 油菜 Brassica napus L 和黄瓜 Cucumis sativus L 均为我国大面积种植作物 特别是油 菜 因其花期之前可作菜用 花期之后籽粒可榨 油而具有 油 菜兼顾 之特色 在我国蔬菜和 食用油领域占有重要地位 9 本研究以稻 油不 同轮作条件下的耕层土壤为样本 拟通过选择性 培养方法获得兼具固氮 解磷以及产IAA 能力的 复合型高效促生菌株 并通 过 盆 栽 试 验 对 其 促 生 效果予以验证 本研究不仅能够为蔬菜种植养分培 育资源的更广阔替代利用提供优良促生菌株材料 还可以从可培养耕层土壤促生菌数量的角度揭示 稻 油轮作制度对地力生态功能维护的优势 1 材料和方法 1 1 试验材料 1 1 1 供试土壤与种子 土壤为稻 油轮作与稻 稻轮作耕层土壤 位于湖南浏阳的农大稻 油轮作试验田 油菜品种为常杂油菜3 号 购于湖南省农业 科学院湘科种苗集团 黄瓜品种为蔬研十号 购 于湖南兴蔬种业有限公司 1 1 2 培养基 肉汤酵母培养基 NBY 营养肉汤粉8 g 酵母提取物2 g 磷酸氢二钾2 g 磷酸二氢钾0 5 g 葡萄糖2 5 g 1 mol L七水合硫酸镁1 mL 去离 子水1 L 琼脂15 g pH值7 5 固氮培养基 阿须贝培养基 无N培养基 苹果酸2 g 三水合磷酸氢二钾0 5 g 七水合硫酸 镁0 2 g 氯化钠0 1 g 二水合氯化钙20 mg 钼酸 钠2 mg 氢氧化钾4 5 g 5 溴百里酚5 mL 维生 素H 10 mg 琼脂15 g 去离子水1 L pH值7 5 解磷培养基 葡萄糖10 g 磷酸钙5 g 六水合 氯化镁5 g 七水合硫酸镁0 25 g 氯化钾0 2 g 硫 酸铵0 1 g 琼脂15 g 去离子水1 L pH值7 0 液体LB 培养基 胰蛋白胨10 g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 去离子水950 mL pH值7 0 IAA 检测培养基为胰蛋白胨大豆肉汤培养基 胰蛋白胨17 g 植物蛋白胨3 g 氯化钠5 g 磷酸氢 二钾2 5 g 葡萄糖2 5 g 色氨酸100 g mL 最 终pH值7 3 0 2 1 2 试验方法 1 2 1 复合促生菌株筛选试验 土壤可培养细菌分离采用连续稀释法 具 soil in rice rice rotation system 38 NFB strains and 35 PSB strains could be isolated from top soil in rice rape rotation system and 6 strains of compound type NFB PSB AB PGPR were isolated from top soil in two rotation systems which could promote the growth of plant height of rape and cucumber seedlings by 25 45 111 96 and 4 45 18 22 respectively In addition DD 69 and DY 111 had significant growth promoting effects on the cucumber root length DY 6 and DD 79 had significant growth promoting effects on the fresh quality of cucumber respectively Keywords plant growth promoting rhizobacteria rotation paddy soil strain screening rape cucumber 17 Vegetables 2020 6 试验研究 体步骤为 称取10 g土壤于置有90 mL无菌水的 250 mL三角瓶中 振荡摇匀30 min 180 r min 静置5 min 分别吸取1 mL悬液加入置有9 mL 无菌水的灭菌试管中 后依次连续稀释至10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 等不同浓度 吸取不同浓度 混合液100 L并涂布于NBY培养皿中 于25 条 件倒置培养于生化培养箱中 菌株纯化 每隔12 h观察上述培养皿生长情 况 待菌落生长至适合形态时 用接种棒挑取单 菌落划线至NBY培养皿 25 条件倒置培养于生 化培养箱培养 备用 促生菌初筛 分别将纯化后的菌株接种于固 氮 解磷培养基 室温条件培养 每隔12 h观察 菌株生长情况 在2 种固氮培养皿上同时可以良 好生长的菌株记为固氮菌 在解磷培养基上可观 察到清澈透明圈的菌株记为解磷菌 所有记号菌 株均另划线接种至新NBY 培养皿 编号 室温培 养3 d 后转至4 低温保存 备用 促生菌复筛 将疑似菌株重复进行固氮解磷 培养试验 以检验效果是否准确 同时将疑似固 氮解磷菌株分别接种至含有5 mL液体LB 培养基 的10 mL试管中 于170 r min 28 条件下振荡 培养48 h 后加入Salkowsky生长素显色试剂 观 察显色反应 确定其产IAA 能力强弱 如显粉红 色则为产生长素菌株 记号并进行生长素定量检 测 IAA 定量检测 10 接种于IAA 检测培养基的各 生防菌株在24 150 r min条件下振荡培养48 h 后 经12 000 r min离心10 min 1 mL菌悬液加入 2 mL Salkowsky试剂并混匀 于28 培养30 min后 得到粉色显色 并在530 nm条件下进行比色 以 10 100 g mL的标准IAA稀释液设置标准曲线 单位表示为 g mL 1 2 2 盆栽促生试验 采用人工气候箱培育油菜和黄瓜幼苗 具体 步骤为 1 土壤 过2 mm筛风干土 装杯 2 供试促生菌经纯化后接种于100 mL NBY 液体培养基振荡培养48 h 备用 3 将形态 一致的油菜种子 黄瓜种子分别于各菌株发酵液 中浸种10 min 后均匀播种于上述土杯中 每杯 5 粒 并将剩余菌液倒入各处理土壤 以清水 作为对照 4 培养于人工气候箱中 培养条 件 28 光照16 h 16 无光8 h 试验设无菌对照处理和已筛选出的不同复合 菌株处理 各处理重复10杯 日常管理 10 d后 观察记录不同处理油菜 黄瓜幼苗植株鲜质量 根长 株高等生长指标 2 结果与分析 2 1 固氮 解磷菌株初筛结果 从表1 可以得出 筛选并纯化处理后 最终 获得稻 稻轮作土壤中可分离菌株194株 稻 油轮作土壤中可分离菌株208株 通过选择性培养基专性生长培养法 初步筛 选共获得固氮菌73株 其中稻 稻轮作土壤获得 35株 稻 油轮作土壤获得38株 解磷菌38株 其中稻 稻轮作土壤获得3 株 稻 油轮作土壤 获得35株 表1 2 2 固氮 解磷菌株复筛验证 通过对比2 种不同种植制度中所获解磷菌与 固氮菌编号 图1 图2 发现 同时兼具解磷 与固氮效果的复合菌株编号为 59 69 79号 稻 稻 6 7 14 107 110 111 112 号 稻 油 2 3 复合型固氮解磷菌产IAA能力定量检测 通过对兼具固氮与解磷特性的复合菌株进 行产IAA 能力定量检测后发现 DD 69 DD 79 D Y 6 D Y 7 DY 111 DY 112具有较强的 IAA 分泌能力 10 g mL 其浓度范围为 10 09 12 59 g mL 表2 表1 固氮 解磷菌株筛选结果 土壤来源 可分离细菌 初筛 复筛 初筛解磷菌 初筛固氮菌 兼具固氮解磷菌 稻 稻轮作土壤 194 3 35 3 稻 油轮作土壤 208 35 38 7 株 18 Vegetables 2020 6 试验研究 2 4 盆栽促生实验结果分析 如表3 所示 与对照相比 筛选出的6 株复 合型促生菌对油菜和黄瓜幼苗早期株高的生 长普遍具有显著的促进效果 其增幅分别为 25 45 111 96 和4 45 18 22 以DD 69最 佳 促生菌D Y 6 与D Y 7 菌株对油菜幼苗早期根系 生长具有一定促进效果 DD 79 DY 111 菌促生 效果均不显著 促生菌DD 69与DY 111 对黄瓜幼 苗早期根系生长具有一定促进效果 且与CK 和其 他菌株差异显著 促生菌对油菜幼苗早期鲜质量 的影响差异不显著 但促生菌D Y 6 和DD 79对黄 瓜幼苗早期鲜质量具有显著促生效果 3 结论与讨论 本研究通过选择性培养基分离等传统微生物 技术对稻 稻轮作与稻 油轮作制度下耕层水 稻土壤中的促生细菌进行了分离与筛选工作 结果表明稻 稻轮作耕层土壤中分离获得194个 菌株 其中含固氮菌35株 解磷菌3 株 稻 油 轮作耕层土壤中分离获得208个菌株 其中含固 氮菌38株 解磷菌35株 复合验证结果显示 兼具固氮 解磷以及较强生长素分泌能力的促 生菌株共6 株 分别为DD 69 DD 79 D Y 6 D Y 7 DY 111 DY 112 其IAA 分泌浓度为 10 09 12 59 g mL 经人工气候箱培育试验发 现 获得的6 株复合型促生菌普遍对油菜和黄瓜 早期幼苗株高生长具有一定的促生效果 尤其是 有利于幼苗株高的生长 根际促生菌 PGPR 是一类根际环境友好 型微生物 具有改善土壤理化性质 提高土壤 肥力 抑制病虫害发生等重要农业利用属性 11 颜色越透明 解磷能力越强 图1 解磷菌平板筛选结果 阿须贝培养基 无N 培养基 能够同时在无氮培养基和阿须贝培养基上生长的菌株为固氮菌 生长越旺盛 固氮能力越强 图2 固氮菌平板筛选结果 表2 产IAA能力检测结果 部分菌株 IAA高产菌株编号 浓度 g mL DD 69 10 13 DD 79 10 09 DY 6 11 26 DY 7 10 58 DY 111 11 12 DY 112 12 59 19 Vegetables 2020 6 试验研究 对复合型高效促生菌的筛选是获得这类有益微生 物的必然途径 本研究以稻 稻 稻 油等不同 轮作制度的耕层水稻土壤为筛选材料 通过传统 微生物分离技术 对其中的固氮菌 解磷菌以及 生长素代谢菌等可培养功能细菌进行了分离与筛 选 并经复筛与盆栽试验对获得的6 株复合型促 生菌株的促生效果予以了明确 这与前人 11 有关 固氮 解磷菌促进作物生长的试验结果一致 本 研究中6 株促生菌虽对油菜幼苗和黄瓜幼苗的早 期生长具有一定促进效果 但对根系的促生效果 普遍不够显著 DD 69和DY 111 除外 这可能 与接种剂量以及容重等土壤理化性状有关 12 此 外 本研究结果还显示出稻 油轮作制度下耕层 水稻土壤中的可分离细菌以及具有固氮 解磷 产IAA 能力促生菌可筛选数量明显高于稻 稻轮 作制度的种植土壤 从根际有益微生物的角度佐 证了稻 油轮作制度对作物根际土壤生态环境的 积极作用 参考文献 1 KLOEPPER J W SCHORTH M KLOEPPER J et al Plant growth promoting rhizobacteria in radishes C proceedings of the 4th international conference on plant pathogenic bacteria Tours Gilbert Clarey 1978 879 882 2 林凡 王正芳 宋末 等 联合固氮菌的应用效益与增产 机理 J 中国农学通报 1998 14 3 32 34 3 刘淑琮 冯断 于洁 植物根际促生菌的研究进展及其环 境作用 J 湖北农业科学 2009 48 11 2882 2287 4 田宏 张德罡 姚拓 土壤联合固氮菌的研究进展 J 草 原与草坪 2004 2 3 7 5 田婧 李邵 马宁 等 植物根际促生菌作用机理研究进 展 J 安徽农业科学 2016 44 10 1 2 39 6 GLICK B R The enhancement of plant growth by free living bacteria J Canadian Journal of Microbiology 1995 41 2 109 117 7 KASIM W A OSMAN M E OMAR M N et al Control of drought stress in wheat using plant growth promoting bacteria J Journal of Plant Growth Regulation 2013 32 1 122 130 8 RADHAKRISHNAN R SHIM K B LEE B W et al IAA producing Penicillium sp NICS01 triggers plant growth and suppresses Fusarium sp induced oxidative stress in sesame Sesamum indicum L J Journal of Microbiology Biotechnology 2013 23 856 863 9 谢慧 谭太龙 罗晴 等 油菜产业发展现状及面临的机 遇 J 作物研究 2018 32 5 87 92 10 GLICKMANN E DESSAUX Y A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria J Applied and Environmental Microbiology 1995 61 2 793 796 11 姚拓 蒲小鹏 张德罡 等 高寒地区燕麦根际联合固氮 菌研究 固氮菌对燕麦生长的影响及其固氮量测定 J 草业学报 2004 13 5 101 110 12 李丽丽 郎敬 杨洪一 等 大豆根际解磷细菌的分离及 筛选 J 湖北农业科学 2014 53 13 13 15 蔬 表3 促生菌对油菜 黄瓜幼苗生长的促进效果 处理 油菜幼苗 黄瓜幼苗 株高 cm 根长 cm 单株鲜质量 g 株高 cm 根长 cm 单株鲜质量 g CK 3 93d 1 53ab 0 13a 2 47c 1 39b 0 58b DD 69 8 33a 1 43ab 0 17a 2 92a 1 77a 0 70ab DD 79 6 17b 1 77ab 0 18a 2 73a 1 55b 0 72a DY 6 4 93c 2 57a 0 19a 2 64b 1 46b 0 79a DY 7 7 17ab 2 40a 0 24a 2 88a 1 48b 0 66b DY 111 7 27ab 1 80ab 0 20a 2 75a 1 84a 0 70ab DY 112 6 03b 1 13b 0 18a 2 58bc 1 57b 0 64b 注 同列不同小写字母表示在0 05水平上差异显著