连作与轮作对温室土壤中真菌多样性的影响.pdf

第14卷第09期 南方农业 2020年3月 Vol 14 No 09 South China Agriculture Mar 2020 191 191 土壤中的微生物主要通过吸收和转化的途径影响养 分的利用 而造成土壤营养水平低下及产品产量 质量 下降的原因则可能是微生物种群发生了变化 1 产品连 作年限较久会造成土壤中微生物种群结构单一化 从而 造成土壤质量直线下降 土壤 pH发生变化甚至于造成产 品产量大减或者绝收 而造成产品减产的原因则主要是 真菌 如尖孢镰刀菌 疫霉属及炭疽菌属等致病真菌 基于此 从真菌数量 种类等方面 研究连作和轮作对 土壤中真菌多样性的影响 为连作障碍提供理论依据 2 3 1 材料与方法 1 1 时间与地点 试验于 2019年 3 8月在西藏自治区现代农业产业 示范园区温室大棚进行 1 2 试验材料 5个相邻的温室 1 多年未种植白肉灵芝 2 连 作白肉灵芝 2年 3 连作白肉灵芝 2年后轮作种植羊肚菌 4 连作白肉灵芝 3年后轮作种植蒜苗 5 连作白肉灵 芝 3年后换土 试剂盒 E Z N A Soil DNA Kit 1 3 取样及保存 5个温室分别在白肉灵芝未种植及种植后分时间段 采取土壤样品于 20 冷冻保存 1 4 试验方法 1 4 1 土壤微生物基因组 DNA 的提取 称取 0 5 g于 20 保存的土壤样品 按试剂盒的试 验步骤进行微生物总 DNA的提取 DNA样品于 20 保存待用 1 4 2 试验流程 提取样品总 DNA后 根据设计得到真菌 ITS1 ITS2 合成的引物 合并引物接头 进行 PCR扩增 PCR反应体系 含 15 mmol L 1 MgCl 2 的 10 Buffer 10 0 L 2 5 mmol L 1 dNTPs 2 0 L 10 mol L 1 引物 各 5 0 L 5 U L 1 Taq酶 1 0 L DNA模板 4 0 L 灭菌去离子水 73 0 L 总体积 100 L PCR反应条件 94 5 min 94 30 s 55 30 s 72 30 s 30个循环 72 10 min 文库建立 对产物进行纯化 定量和均一化形成测 序文库 建好的文库先进行文库质检 质检合格的文库用 HiSeq PE250进行检测 由联川生物技术公司完成测序 4 1 4 3 数据处理 试验数据均采用 Excel和 SPSS软件进行统计分析 2 结果与分析 2 1 不同连作年限土壤真菌OTU聚类分析 将所有样品的有效序列进行聚类 按照 97 的 序列相似度将这些序列聚类成为OTUs Operational Taxonomic Units 得到每个 Cluster的序列及其代表序 列 即为 OTU 用于统计每个 OTU序列和丰度进行 下游分析 5 由图 1的 Venn图可知 1号温室总 OTUs为 448 2号温室总 OTUs为 1 390 3号温室总 OTUs为 1 211 4号温室总 OTUs为 925 5号温室总 OTUs为 421 5个 样品中共有的 OTUs个数有 143个 其中 2号温室特有 OTUs个数最多 达到 240个 因 5号温室置换土壤过程 中导致数据异常 不再对其进行后续分析 2 2 不同连作年限土壤真菌Alpha多样性分析 Alpha多样性也称为生境内物种多样性 6 包括 Chao1 Observed species Goods coverage Shannon和 收稿日期 2020 01 15 基金项目 西藏白肉灵芝连 轮 作下土壤生物相关性研究 XZ2017ZRG 39 国家食用菌产业技术体系拉萨综合试验站课题 CARS 20 95 科技富民稳边专项 西藏特色食用菌高效栽培技术 示范课题 XZ201901NA05 作者简介 高磊 1987 男 甘肃白银人 硕士 助理研究员 从 事食用菌培养等方向的研究 E mail 1173835491 连作与轮作对温室土壤中真菌多样性的影响 高 磊 西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所 西藏拉萨 850000 摘 要 以不同连 轮 作年限种植白肉灵芝的温室土壤为实验材料 研究不同连 轮 作年限土壤真菌多样 性的变化趋势 通过高通量测序技术并结合相关生物信息学方法 分析土壤中真菌ITS1 ITS2区域的丰富度 多 样性指数以及群落结构 结果表明 连作或轮作后均能够提高微生物群落多样性 子囊菌门 担子菌门及接合 菌门为优势真菌 担子菌门的比例随连作年限的增加而逐渐增加 轮作后丰度降低 关键词 白肉灵芝 真菌 多样性 中图分类号 S154 3 文献标志码 B DOI 10 19415 ki 1673 890 x 2020 09 093 高 磊 连作与轮作对温室土壤中真菌多样性的影响 192 Simpson指数 利用 Alpha多样性分析方法 对土壤样品 中的 OTUs总数和 Chao1指数进行分析 可得出连作土 壤中真菌的多样性变化及数值 7 不同年限连 轮 作 下土壤真菌 Alpha多样性的结果如表 1所示 图1 各温室土壤样品Venn图 表1 土壤样品多样性指数结果表 温室序号 Chao1 OTUs总数 1 254 28 448 2 512 69 1 390 3 555 50 1 211 4 436 56 925 由表 1可知 在白肉灵芝生长过程中 轮作及连作 土壤中真菌的 OTUs总数及 Chao1指数均高于未种植灵 芝温室 连作后轮作的品种对温室土壤真菌群落 OTUs 总数及 Chao1指数有一定的影响 通过 Alpha多样性分 析可知 连作与轮作均能够提高微生物群落多样性 2 3 不同连作年限土壤真菌群落门类组成物种分析 2 3 1 不同连作年限土壤真菌物种分类统计 根据物种丰度表 选取丰度最高的 20个物种分类 进行相对丰度计算 获得相对丰度数据 绘制样品丰度 柱状图 便于更直观地进行样品丰度比较 8 9 图 2和图 3中横轴为样品名称 每个样品 3个重复 纵轴代表门及 属的相对丰度 不同颜色对应不同物种 由图 2门级别 柱状图可以看出各温室土壤中占比最高的真菌为子囊门 Ascomycota 其次分别为担子菌门 Basidiomycota 和 接合菌门 Zygomycota 连作增加了担子菌门的相对 丰度 轮作降低了担子菌门的相对丰度 却增加了接合 菌门的相对丰度 由图 3属级别柱状图可以看出 2 3 4 号温室中内生菌属 Phialocephala 含量较多 1号温室 内生菌属含量较少 木霉属 Hypocrea 在各温室土壤 中含量较高 烟色织孢霉属 Plectosphaerella 在 2 4 号温室含量较高 1 3号温室含量较少 透孢黑团壳属 Massarina 在 2 3号温室含量较高 4号含量较少 1号温室没有 灵芝属 Ganoderma 除了 1号温室没有外 在 2 3 4均有存在 3 结论 通过微生物测序技术得出白肉灵芝轮作和连作土壤 样品中真菌的门 属类别及丰度 发现连作或轮作后均 能够提高微生物群落多样性 子囊菌门 担子菌门及接 图2 各样品门级别相对丰度柱状图 高 磊 连作与轮作对温室土壤中真菌多样性的影响 193 合菌门为优势真菌 担子菌门的比例随连作年限的增加 而逐渐增加 轮作后丰度降低 但接合菌门的相对丰度 增大 但是仍有很大一部分类别真菌物种尚未鉴定出 尤其是属级别真菌 所以需要进行进一步的研究探讨和 鉴定 参考文献 1 马琨 张丽 杜茜 等 马铃薯连作栽培对土壤微生物 群落的影响 J 水土保持学报 2010 24 4 229 233 2 周陈 李许 杨明开 等 冬小麦不同生育期土壤微生 物及养分动态变化 J 西北农业学报 2008 17 3 113 116 3 张重义 林文雄 药用植物的化感自毒作用与连作障 碍 J 中国生态农业学报 2009 17 1 189 196 4 Bokulich N A Subramanian S Faith J J et al Quality filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing J Nature methods 2013 10 1 57 59 5 Blaxter M Mann J Chapman T et al Defining operational taxonomic units using DNA barcode data J Philosophical transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences 2005 360 1462 1935 1943 6 Sul W J Cole J R Jesus E C et al Bacterial community comparisons by taxonomy supervised analysis independent of sequence alignment and clustering J Proc Natl Acad Sci USA 2011 108 38 14637 14642 7 Price M N Dehal P S Arkin A P FastTree 2 Approximately Maximum Likelihood Trees for Large Alignments J Plos One 2010 5 5 e9490 8 Xiong W G Wang Y L Sun Y X et al Antibiotic mediated changes in the fecal microbiome of broiler chickens define the incidence of antibiotic resistance genes J Microbiome 2018 6 34 9 Ren L L Zhang R B Rao J et al Transcriptionally Active Lung Microbiome and Its Association with Bacterial Biomass and Host Inflammatory Status J mSystems 2018 3 5 e00199 18 责任编辑 赵中正 图3 各样品属级别相对丰度柱状图