甜瓜细菌性果斑病带菌种子的处理方法研究.pdf

收稿日期 2019 02 21 作者简介 李菊芬 1982 女 硕士 助理研究员 研究方向为西瓜甜瓜遗传育种 E mail lijufen 1010 163 com Tel 021 34675053 通信作者 E mail maguobin2006 163 com 上海农业学报 2020 36 6 44 48 http www nyxb sh cn Acta Agriculturae Shanghai DOI 10 15955 j issn1000 3924 2020 06 09 李菊芬 林涛 马国斌 甜瓜细菌性果斑病带菌种子的处理方法研究 J 上海农业学报 2020 36 6 44 48 甜瓜细菌性果斑病带菌种子的处理方法研究 李菊芬 林 涛 马国斌 上海市农业科学院设施园艺研究所 上海市设施园艺技术重点实验室 上海201106 摘 要 以携带细菌性果斑病菌 Acidovoras avenae subsp citrulli 的甜瓜种子为材料 分别进行70 75 80 干热灭菌 包衣剂 卫福Vitavax 70 干热灭菌 包衣剂5种方式的处理 并利用特异引物 BX L1 BX S R2 对细菌性果斑病菌进行PCR检测 以期探索一种既不影响种子发芽率 又能有效杀灭种带细菌性果斑 病菌的最佳处理方式 结果表明 除70 干热灭菌 包衣剂处理外 其他4种处理的种子均能检测到279 bp的 目的条带 实时定量PCR结果显示 5种处理的种子细菌性果斑病菌带菌量均有不同程度的降低 其中以70 干热灭菌 包衣剂处理效果最佳 活菌分离结果表明 只能从70 干热灭菌的种子上分离到细菌性果斑病菌 种子发芽试验结果显示 75 和80 干热处理对种子发芽势和发芽率有一定影响 其他处理均无影响 关键词 甜瓜 细菌性果斑病菌 种子处理 中图分类号 S436 5 文献标志码 A 文章编号 1000 3924 2020 06 044 05 Study on the treatment methods of melon seed with bacterial fruit blotch BFB LI Jufen LIN Tao MA Guobin Protected Horticultural Research Institute Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology Shanghai 201106 China Abstract In order to explore a kind of best treatment method which does not affect the seed germination rate but also can effectively kill the BFB pathogen Acidovoras avenae subsp citrulli muskmelon seeds carrying BFB pathogen were treated with 5 methods namely 70 75 80 dry heat sterilization coating agent Vitavax 70 dry heat sterilization coating agent and the specific primers BX L1 BX S R2 were used to detect BFB pathogen The results showed that the 279 bp target band could be detected in all the treatments except 70 dry heat sterilization coating agent treatment Quantitative real time PCR results showed that the amount of BFB pathogen in the 5 treatments decreased in different degrees and the best treatment was 70 dry heat sterilization coating agent The living pathogen isolation results showed that BFB pathogen could only be isolated from seeds sterilized by dry heat at 70 The seed germination results showed that 75 and 80 dry heat treatment had effects on seed germination potential and germination rate while other treatments had no effects Key words Melon Acidovoras avenae subsp citrulli Seed treatment 细菌性果斑病 Bacteiral fruit blotch 简称BFB 是一种严重危害葫芦科植物的世界性病害 1 3 是影响 瓜类生产的主要病害之一 其病原为嗜酸菌属西瓜种 Acidovoras citrulli 4 5 由于细菌性果斑病菌是典 型的种传细菌性病害 6 7 如不及时进行检测和灭菌处理 种子生产经营者和瓜农将面临遭受经济损失的 风险 建立快速 准确的检测方法和行之有效的灭菌处理方法是防控此病的重要手段 目前 PCR技 术 8 13 血清学检测技术 14 已广泛应用于细菌性果斑病菌的检测 但在种子处理方面尚缺乏有效的防治 药剂 15 本试验以在新疆繁育的携带瓜类细菌性果斑病菌的甜瓜种子为材料 分别进行70 75 上 海 农 业 学 报 80 干热灭菌 包衣和70 干热灭菌 包衣5种不同的灭菌处理 采用本实验室前期建立的PCR体系 和实时定量PCR方法分别对处理后的甜瓜种子带菌情况进行检测 并在此基础上进行活菌分离鉴定 旨 在探索一种既不影响种子发芽率 又能有效杀灭种带细菌性果斑病菌的最佳处理方式 为甜瓜种子的生 产和流通提供技术参考 1 材料与方法 1 1 材料 供试甜瓜 Cucumis melo L 种子 在新疆繁育的携带瓜类细菌性果斑病菌的 东方蜜1号 甜瓜种 子 供试菌株 由中国农业科学院郑州果树所提供的细菌性果斑病标准菌株 Acidovoras avenae subsp citrulli 1 2 方法 1 2 1 带菌种子的不同处理方法 将带菌的供试甜瓜种子随机分成6组 每组2 kg 以其中1组种子为对照 CK 其他5组分别进行如 下5种不同处理 处理1 40 处理2 d 50 处理1 d 70 处理3 d 50 处理1 d 40 处理1 d 处 理2 40 处理2 d 50 处理1 d 75 处理3 d 50 处理1 d 40 处理1 d 处理3 40 处理2 d 50 处理1 d 80 处理3 d 50 处理1 d 40 处理1 d 处理4 包衣处理 包衣剂为卫福 有效成分 为萎锈灵200 g L 福美双200 g L 处理5 处理1 处理4 1 2 2 PCR检测 5种处理和对照各取300粒种子放入灭菌三角瓶中 加入30 mL无菌双蒸水 置于28 下200 r min 振荡培养3 h 取1 L悬浮液作为PCR模板 选用特异引物BX L1 BX S R2 BX L1 5 CAGCTGGGAG CGATCTTCAT 3 BX S R2 5 GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA 3 9 进行PCR扩增 引物由上海生工生 物工程股份有限公司合成 每种处理3个重复 普通PCR所需试剂均购于天根生化技术有限公司 PCR反应体系 25 L 10 buffer 2 5 L MgCl2 2 mmol L dNTPs 0 2 mmol L Taq DNA聚合酶1 U 正反 向引物各0 2 mol L 模板为1 L浸提液 无菌三蒸水补齐 扩增条件 95 3 min 94 35 s 60 35 s 72 45 s 35个循环 72 7 min PCR仪为BIO Rad T100TM Thermal Cycler 扩增产物经1 琼 脂糖凝胶电泳 Goldview染液染色后 于紫外凝胶成像系统 Tanon 3500 下观察并拍照 1 2 3 实时定量PCR检测 荧光染料为Takara公司的SYBR green定量PCR染料 仪器为Bio Rad CFX96TM Real Time PCR System 反应体系按照Takara SYBR Premix Ex TaqTM说明书进行 扩增程序采用Bio Rad CFX荧光定量 PCR仪默认程序 即 95 30 s 95 5 s 60 30 s 40个循环 每个循环结束时收集荧光信号 每个反 应设置3个重复 以对照作为参比 采用相对定量 CT法 的方法计算出各处理与CK的CT值之差 CT 以2 CT计算所得的值即为各处理的相对带菌量 1 2 4 活菌分离检测 取CK和各处理种子的悬浮液100 L 于KB固体培养基上均匀涂板 置于28 恒温培养箱中倒置 培养48 h 观察菌落生长情况 每处理设3皿重复 1 2 4 1 选择性KB平板的制备及涂板 选择性KB培养基 蛋白胨20 g L 丙三醇10 mL L MgSO4 7H2O 1 5 g L K2HPO4 1 5 g L 琼脂 15 g L pH调至7 0 121 灭菌20 min 冷却至50 时加入氨苄青霉素20 mg L 新生霉素5 mg L 放线 菌酮25 mg L 取CK和5种处理种子的悬浮液100 L 于选择性KB培养基上均匀涂板 置于28 温箱 中恒温倒置培养48 h 观察菌落生长情况 1 2 4 2 总菌落DNA提取及PCR检测 用无菌水冲洗选择性KB培养基表面上分离培养的所有细菌菌落 离心浓缩 提取细菌的基因组 DNA 16 并以此为模板 进行PCR扩增验证 反应体系及扩增程序同1 2 2 1 2 4 3 不同浓度细菌性果斑病菌悬浮液的制备及涂板 挑取细菌性果斑病标准菌株于液体KB培养基中 28 振荡培养过夜 离心收集菌体 1 mL无菌水 54 李菊芬 等 甜瓜细菌性果斑病带菌种子的处理方法研究 吹打至悬浮状态 根据OD600值分别配成2 104 cfu mL 2 103 cfu mL 2 102 cfu mL 3个浓度梯度 分别 在选择性KB培养基和KB培养基上进行涂板 每个浓度重复3皿 观察选择性KB培养基对细菌性果斑 病菌生长的影响 1 2 5 不同处理对种子发芽的影响 取CK和不同处理种子各100粒 浸泡12 h 置于28 恒温培养箱中催芽24 h 统计发芽率 根长 以 此判定各处理对种子发芽的影响 3次重复 2 结果与分析 2 1 PCR与实时定量PCR检测 PCR检测结果显示 图1 CK和处理1 4均可扩增出特异性目的条带 279 bp 但条带亮度有所差 异 其中CK最亮 处理4 包衣处理 的条带亮度最淡 处理5 70 高温处理 包衣处理 未扩增出目的 条带 实时定量PCR检测结果显示 图2 与CK相比 处理1 4的种子相对带菌量均有不同程度的降低 且呈递减趋势 处理4的种子相对带菌量降幅最为明显 处理5基本检测不到带菌 500bp 200bp M CKCK 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 M DL2000 Ladder 1 5 处理1 5 图1 5种不同处理带菌甜瓜种子的PCR检测结果 Fig 1 PCR detection of melon seeds carrying pathogens treated with 5 different treatments 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 处 理 细 菌 性 果 斑 病 菌 相 对 含 量 1 2 3 4 5CK 处理 细 菌 性 果 斑 病 菌 相 对 含 量 图2 5种不同处理带菌甜瓜种子的实时定量PCR检测结果 Fig 2 Quantitative real time PCR results of melon seeds carrying pathogens treated with 5 different treatments 上述结果表明 带菌甜瓜种子经5种处理后 种子带菌量均有所下降 其中以70 高温 包衣处理 的杀菌效果最佳 CK 1 2 3 4 5 CK 1 2 3 4 5 A B 1 5 处理1 5 图3 不同处理的种子悬浮液在KB A 和选择性KB B 培养基上的涂板结果 Fig 3 Suspension incubation results of different treatment seeds on KB medium A and selective KB medium B 2 2 活菌分离检测 2 2 1 KB和选择性KB培养基的涂板及总菌落DNA的PCR检测 不同处理的种子悬浮液在KB培养基上涂板 经28 恒温培养48 h后 各处理和CK均有菌落长出 其 中以CK长出的菌落最为密集 处理1次之 处理2 5的菌落总数虽相对较少 但杂菌生长旺盛 图3A 由 于杂菌量过多 且生长速度较细菌性果斑病菌快 严重影响了总菌落DNA的PCR检测结果 因此 选用优 64 上 海 农 业 学 报 化的选择性KB培养基进行后续试验 500bp 250bp M Ac CK CK CK 1 1 1 M DL2000 Ladder Ac 细菌性果斑病菌 1 处理1 图4 CK和处理1种子中分离的细菌性果斑病菌的PCR检测 Fig 4 PCR detection of Acidovoras avenae subsp citrulli isolated from the melon seeds of CK and treatment 1 选择性KB培养基的涂板结果表明 图3B 只 有CK和处理1有菌落长出 处理2 5均无菌落长 出 提取CK和处理1的总菌落DNA进行PCR检 测表明 图4 二者均能扩增出目的条带 279 bp 2 2 2 选择性KB培养基对果斑病菌生长的影响 将细菌性果斑病菌标准菌株悬浮液稀释成2 104 cfu mL至2 102cfu mL 3个10倍浓度梯度 分 别在KB和选择性KB培养基上涂板 结果表明 细 菌性果斑病病菌在KB和选择性KB培养基上长出 的菌落生长速度一致 数量相当 且菌落数目呈梯 度变化 说明选择性KB培养基对细菌性果斑病标 准菌株的生长无影响 图5 A B 从左到右依次为2 104 2 102 cfu mL 图5 不同稀释浓度的细菌性果斑病菌在选择性KB A 和KB培养基 B 上的生长情况 Fig 5 Growth of Acidovoras avenae subsp citrulli on selective KB medium A and KB medium B with different dilutions 2 3 不同处理对种子萌发的影响 由表1可知 处理3对种子发芽率的影响较为明显 发芽率仅为87 CK和其他4种处理的发芽率 均在90 以上 处理1和处理4的种子平均根长较CK增长显著 处理5与CK无显著差异 而处理2和 处理3的种子根长生长却受到明显抑制 表1 不同处理对种子发芽的影响 Table 1 Effects of different treatments on seed germination 处理总数 粒发芽数 粒发芽率 平均根长 mm CK 100 97 97 7 69 2 27 c 处理1 100 96 96 8 76 2 24 d 处理2 100 91 91 3 86 1 16 b 处理3 100 87 87 2 12 0 60 a 处理4 100 95 95 9 79 2 55 e 处理5 100 94 94 7 18 2 15 c 注 同列不同字母代表差异显著 P 0 05 3 结论与讨论 PCR和实时定量PCR检测结果表明 除处理5外 CK和处理1 4均能检测到细菌性果斑病菌 但带 菌程度不同 带菌量呈递减趋势 用选择性KB培养基进行涂板 可在很大程度上抑制杂菌的生长 但对 细菌性果斑病菌的生长无明显影响 活菌分离试验表明 只有CK和处理1的种子上能分离到细菌性果 斑病菌 发芽试验表明 只有处理2和处理3对种子的萌发和生长有抑制作用 综合试验结果 处理5 70 高温 包衣 既不影响种子发芽 又可有效杀灭细菌性果斑病菌 效果最佳 另外 虽然处理2 4的种子PCR和荧光定量PCR检测结果均显示阳性 但均未分离到活的细菌性 果斑病菌 究其原因 可能是带菌种子经过这3种方式处理后 其携带的细菌性果斑病菌已被杀灭 但仍 存在不同程度的DNA残留 PCR和荧光定量PCR以残留的DNA为模板进行扩增 所以呈现阳性结果 因此 在种子细菌性果斑病菌的检验检疫过程中 除了常规的PCR检测或者血清学检测方法外 还应进行 活菌分离或生长法来检测种子的带菌情况 这样检测的结果才更加准确可靠 74 李菊芬 等 甜瓜细菌性果斑病带菌种子的处理方法研究 参 考 文 献 1 LATIN R X Bacterial fruit blotch of watermelon The hypothetical exam question becomes reality J Plant Disease 1995 79 8 761 765 2 O BRIEN R G MARTIN H L Bacterial blotch of melons caused by strains of Acidovorax avenae subsp citrulli J Australian Journal of Experimental Agriculture 1999 39 4 479 485 3 LANGSTOND B J WALCOTT R R GITAITIS R D et al First report of a fruit rot of pumpkin caused by Acidivorax avenae subsp citrulli in Georgia J Plant Disease 1999 83 2 199 4 SCHAAD N W G SOWELL J R GOTH RW et al Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp citrullis subsp nov J International Journal of Systematic Bacteriology 1978 28 1 117 125 5 WILLEMS A GOOR M THIELEMANS S et al Transfer of several phytopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax avenae subsp nov comb nov Acidovorax avenae subsp citrulli Acidovorax avenae subsp cattleyae and Acidovorax avenae subsp konjaci J International Journal of Systematic Bacteriology 1992 42 1 107 119 6 赵廷昌 王建荣 孙福在 等 哈密瓜细菌性果斑病综合治理指南 J 植保技术与推广 2003 23 4 17 18 7 RANE K K LATIN R X Bacterial fruit blotch of watermelon association of the pathogen with seed J Plant Disease 1992 76 5 509 512 8 WALCOTT R R GITAITIS R D CASTRO A C Role of blossoms in watermelon seed infestation by Acidovorax avenae subsp Citrulli J Phytopathology 2003 93 5 528 534 9 BAHAR O EFRAT M HADAR E et al New subspecies specific polymerase chain reaction based assay for the detection of Acidovorax avenae subsp citrulli J Plant Pathology 2008 57 4 754 763 10 回文广 赵廷昌 Schaad N W 等 哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的建立 J 中国农业科学 2007 40 11 2495 2501 11 田艳丽 胥婧 赵玉强 等 利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌 J 江苏农业科学 2010 26 3 512 516 12 任毓忠 李晖 李国英 等 哈密瓜细菌性果斑病种子带菌的PCR检测 J 新疆农业科学 2004 41 5 329 332 13 冯建军 许勇 李建强 等 免疫凝聚试纸条和TaqMan探针实时荧光PCR检测西瓜细菌性果斑病菌比较研究 J 植物病理学报 2006 36 2 102 108 14 王政 胡俊 哈密瓜细菌性果斑病种子带菌血清学检测技术的初探 J 内蒙古农业大学学报 2005 26 3 20 23 15 蔡馥宇 关巍 乔培 等 瓜类细菌性果斑病研究新进展 J 中国瓜菜 2017 30 11 1 5 16 卢圣栋 现代分子生物学实验技术 M 2版 北京 中国协和医科大学出版社 1999 34 36 责任编辑 闫其涛 84