''红颜''草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆与表达分析.pdf

收稿日期 2019 01 15 基金项目 上海市农业基础性研究项目 沪农科攻字 2014 第7 2 2号 上海市科委农业科技重点攻关项目 16391901400 作者简介 吕文远 1993 女 在读硕士 主要从事草莓分子遗传学研究 E mail lvwenyuan1003 126 com 通信作者 E mail kduan936 126 com 上海农业学报 2020 36 6 1 5 http www nyxb sh cn Acta Agriculturae Shanghai DOI 10 15955 j issn1000 3924 2020 06 01 吕文远 张丽勍 高清华 等 红颜 草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆与表达分析 J 上海农业学报 2020 36 6 1 5 红颜 草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆与表达分析 吕文远1 2 张丽勍2 高清华2 段 可2 1上海海洋大学水产与生命学院 上海201306 2上海市农业科学院林木果树研究所 上海201403 摘 要 以 红颜 草莓果实为材料 经RNA提取后反转录获得草莓果糖激酶基因FaFRK3全长序列 并对 其进行生物信息学分析和表达分析 结果表明 草莓FaFRK3基因完整读码框ORF长1 158 bp 编码386个氨基 酸 其编码蛋白的等电点和相对分子质量分别为5 04和94 292 57 ku 草莓FaFRK3基因与其他植物的FRK基 因相似度较高 FaFRK3基因编码蛋白属于pfkB糖激酶家族 实时荧光定量PCR发现 FaFRK3基因在 红颜 草莓不同器官的表达量相差较大 其中在种子中的相对表达量最高 在茎中的相对表达量最低 该基因在不同 发育时期的相对表达量也存在差异 随着草莓果实成熟 FaFRK3基因相对表达量逐渐降低 关键词 红颜 果糖激酶基因 基因克隆 表达分析 中图分类号 S668 4 文献标志码 A 文章编号 1000 3924 2020 06 001 05 Cloning and expression analysis of fructokinase gene FaFRK3 from Benihoppe strawberry L Wenyuan1 2 ZHANG Liqing2 GAO Qinghua2 DUAN Ke2 1 College of Fisheries and Life Sciences Shanghai Ocean University Shanghai 201306 China 2 Forest and Fruit Tree Research Institute Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai 201403 China Abstract Using Benihoppe strawberry fruit as material the full length sequence of strawberry fructokinase gene FaFRK3 was obtained by RNA extraction and reverse transcription and its bioinformatics and expression analysis were carried out The results showed that the ORF of FaFRK3 gene was 1 158 bp and encoded 386 amino acids The isoelectric point and relative molecular mass of the protein were 5 04 and 94 292 57 ku respectively The FaFRK3 gene of strawberry was similar to that of other plants The protein encoded by FaFRK3 gene belonged to the pfkB glycokinase family Real time fluorescent quantitative PCR showed that the expression of FaFRK3 gene in different organs of Benihoppe strawberry was quite different The relative expression level of FaFRK3 gene in seed was the highest and that in stem was the lowest The relative expression of FaFRK3 gene also changed in different developmental stages With the ripening of strawberry fruit the relative expression of FaFRK3 gene decreased gradually Key words Benihoppe Fructokinase gene Gene cloning Expression analysis 草莓果实中的可溶性糖主要有3种 蔗糖 葡萄糖 果糖 其中果糖甜度最高 红颜 草莓果实中果糖含 量相对较高 1 植物光合作用主要产物是蔗糖 蔗糖和尿苷 5 二磷酸二钠盐 UDP 在蔗糖合酶 Sucrose Synthase SS EC2 4 1 13 的作用下水解为果糖和尿苷二磷酸葡萄糖 UDPG 该过程是可逆的 2 果糖在 果糖激酶 Fructokinase FRK EC2 7 1 4 的作用下进一步磷酸化生成6 磷酸果糖 己糖激酶 Hexokinase HK EC 2 7 1 1 主要磷酸化葡萄糖 果糖激酶主要磷酸化果糖 3 FRK在果糖代谢过程中具有十分重要的 作用 已知的FRKs是碳水化合物嘌呤激酶家族的成员 被称为磷酸果糖激酶B pfkB 家族 4 该家族与植 物中的果糖代谢合成途径密切相关 对FRK基因表达的研究有助于揭示植物中果糖的代谢与合成 吕文远 等 红颜 草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆与表达分析 马铃薯 5 鳄梨 6 大麦 7 豌豆 8 9 水稻 10 和柑橘 11 等作物中的FRK基因均已被分离出来 甘蔗 中有7个与果糖激酶相关的基因 ScFRK1 ScFRK7 其中ScFRK1和ScFRK5是主效基因 ScFRK1基因 表达量最高 ScFRK5基因次之 ScFRK4基因在赤霉素的胁迫下表达量明显上升 12 在拟南芥中 果糖激 酶AtFEK1和AtFRK2基因对果糖具有较高特异性 13 在日本梨果实中 随着果糖含量的增加 果糖激酶 的活性会持续下降 14 Qin等 15 在枇杷中分离出果糖激酶EjFRK基因 通过动态监测EjFRK基因转录 本和FRK酶活性的变化 发现EjFRK基因在果实发育早期的表达水平较高 成熟期表达水平较低 与 FRK酶活性的变化趋势相似 而FRK酶活性的变化与果实发育进程方向相反 高FRK酶活性不利于枇杷 果实果糖积累 赵建华等 16 从 宁杞1号 枸杞果实中分离得到LbFRK7基因 发现该基因在枸杞果实的 发育过程中对果糖转化具有一定的作用 特别是在果实成熟过程中对果糖含量的升高具有重要作用 Yang等 17 研究发现 苹果的茎尖和幼果中 MdFRK2基因的表达非常高 草莓果实糖分积累研究较多 但有关草莓果实甜度控制重要的果糖代谢和果糖激酶基因的研究尚未见报道 本试验以 红颜 草莓果 实为材料 克隆和分离获得草莓果实中FaFRK3基因的cDNA全长序列 并对 红颜 植株不同器官以及草 莓果实发育各个时期的FaFRK3基因的表达进行分析 以期为后续基因功能分析和果实甜度遗传控制奠 定基础 1 材料与方法 1 1 植物材料及试剂 选取2017年10月种植于上海市农业科学院庄行试验站塑料大棚中生长状况良好的草莓品种 红 颜 Fragaria ananassa Duchesne Benihoppe 为试验材料 分别选取绿果期 G 果实绿色 瘦果紧密 聚合 白果期 W 果实白色膨大 瘦果不再紧密聚合 转色期 T 果实着色面积达25 50 成熟期 R 果实完全着色成熟 4个发育阶段的草莓果实 以及 红颜 植株的根 短缩茎 叶 花 种子5个器官 每个时期的果实设置3次生物学重复 随机选取同一时期的10个果实混为一组 共3组进行液氮磨样 存 放于 80 冰箱中备用 所用载体为入门载体pDONR221 大肠杆菌TOP10和根癌农杆菌GV3101购于上海唯地生物技术有 限公司 质粒小抽试剂盒和DNA纯化试剂盒购于天根生化科技有限公司 植物RNA提取试剂盒为E Z N A Plant RNA Kit 美国OMEGA公司 SYBR Green 荧光染料购于上海生工生物工程股份有限公司 反转录试剂盒购于大连TaKaRa公司 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成 1 2 试验方法 1 2 1 FaFRK3基因全长cDNA的克隆 利用E Z N A Plant RNA试剂盒从 红颜 草莓果实中提取RNA 利用Oligo软件进行FaFRK3基因 CDS引物 FaFRK3 F和FaFRK3 R 设计 表1 使用MLV反转录酶 RNase Inhibitor进行反转录 得到单 链cDNA PCR反应体系为 25 L 2 Es Taq MasterMix Dye 上下游引物各2 L 1 L cDNA 加水至 50 L体系 PCR反应程序 98 预变性5 min 98 变性30 s 62 退火30 s 72 延伸2 min 共30 个循环 72 延伸5 min 扩增后的PCR产物使用胶回收试剂盒回收得到FaFRK3基因的目的片段 连 接到pDONR221入门载体上 18 重组载体转入TOP10大肠杆菌感受态细胞中 菌液检测呈阳性的单克隆 送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序 表1 试验所用引物 Table 1 Primers used in the experiment 引物名称序列 5 3 Tm 目的片段长度 bp EF1 F TGGATTTGAGGGTGACAACATGA EF1 R GTATACATCCTGAAGTGGTAGACGGAGG FaFRK3 F ATGGGGAGAAACCGAACCACCCACCTC FaFRK3 R TGGTTTAAGGTCCACTGTTCGAATTG FaFRK3 qRT F GAATGTAGCAGGACATGAAC FaFRK3 qRT R CGAATTGGCTCCTCATAGAC 55 145 62 1 158 55 195 1 2 2 生物信息学分析 通过Pfam分析得到果糖激酶保守结构域pfkB PF00294 24 氨基酸序列 将该序列在GDR https 2 上 海 农 业 学 报 www rosaceae org 中进行BLAST分析 得到草莓中基因序列mrna07897 1 v1 0 hybrid BLAST分析表 明 该基因序列与FRK3基因一致性最高 因此将其命名为FaFRK3 使用MEGA5构建Neighbor Joining 系统进化树 bootstrap重复次数为1 000次 图2 利用ProtParam http web expaasy org protparam 对 FaFRK3蛋白进行蛋白质性质分析 通过DNAMAN进行序列相似性分析 利用HMMER http www hmmer org 对基因序列结构域和功能进行分析 利用ProtScale http web expasy org protscale 对 FaFRK3蛋白进行亲疏水性分析 1 2 3 FaFRK3基因表达分析 使用Oligo软件进行实时荧光定量分析引物 FaFRK3 RT F FaFRK3 RT R 设计 表1 内参引物为 EF1 参照吕文远等 19 定量方法对FaFRK3基因进行实时荧光定量分析 3次生物学重复 采用2 CT 方法进行数据处理 2 结果与分析 2 1 红颜 草莓FaFRK3基因克隆分析 利用Oligo软件设计的引物 FaFRK3 F R 进行PCR扩增 获得目的基因 图1 FaFRK3基因含有一 个1 158 bp的开放阅读框 ORF 编码有386个氨基酸 其编码蛋白理论等电点和相对分子质量分别为 5 04和94 292 57 ku FaFRK3蛋白分子式为C3757H6241N1275O1611S270 脂肪酸系数为20 47 不稳定系数为 39 46 是一个稳定的蛋白 属于pfkB糖激酶家族 通过DNAMAN进行序列比对显示 其与FRK蛋白氨 基酸序列相似性较高 其中与月季的FRK蛋白氨基酸序列相似性最高 图2 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 1158bp FaFRK3 FaFRK3 CK M 1158bp 注 FaFRK3为目的基因条带 CK为空白对照 M为Marker 图1 红颜 草莓FaFRK3基因PCR扩增电泳 Fig 1 PCR amplification and electrophoresis of Benihoppe strawberry FaFRK3 gene 100 100 100 100 99 99 0 5 草 莓 mrna07897 1 v1 0 hybrid 月 季 XP 024157436 1 水 蜜 桃 XP 007205340 1 枣 XP 015873836 1 番 木 瓜 XP 021909927 1 柑 橘 XP 006425063 1 番 茄 XP 004241162 1 南 瓜 XP 022964857 1 拟 南 芥 AT1G06020 1 猕 猴 桃 PSR86166 1 图2 植物果糖激酶家族基因系统进化树 Fig 2 Phylogenetic tree of fructosekinase family gene in plant 2 2 FaFRK3蛋白结构分析 对测序所得基因序列结构域和功能进行分析 利用SignalP工具进行信号肽预测显示 该基因含有一 个信号肽 位置为1 27碱基 分值为0 450 图3 利用ProtScale进行亲疏水性分析表明 FaFRK3蛋白 大部分氨基酸属于疏水性氨基酸 图4 说明蛋白质结构稳定 2 3 FaFRK3基因定量表达分析 由定量分析结果可以看出 FaFRK3基因在 红颜 草莓茎中的相对表达量最低 在种子中的相对表达 3 吕文远 等 红颜 草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆与表达分析 量最高 图5 FaFRK3基因在 红颜 草莓果实绿果期表达量最高 随后逐渐降低 成熟期FaFRK3基因 表达量最低 图6 信 号 肽 位 置 C score ATGGGGAGAAACCGAACCACCCACCTCACTTCCTCCCCTCGCCGCTGCCTGATTGCCGGACACTACTGCC S score Y score 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 位 置 分 值 10 20 30 40 50 60 700 图3 红颜 草莓FaFRK3蛋白信号肽预测 Fig 3 Signal peptide prediction of FaFRK protein in Benihoppe strawberry 2 5 2 0 1 5 1 0 0 5 0 0 5 1 0 位 置 分 值 200 400 600 8000 1 000 1 200 图4 红颜 草莓FaFRK3蛋白亲疏水性分析 Fig 4 Hydrophobicity analysis of FaFRK3 protein in Benihoppe strawberry 器官 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 相 对 表 达 量 根 茎 叶 果 种子 图5 红颜 草莓不同器官中FaFRK3基因定量分析 Fig 5 Quantitative analysis of FaFRK3 gene in different organs of Benihoppe strawberry 发育时期 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 相 对 表 达 量 绿果期 白果期 转色期 成熟期 图6 红颜 草莓不同发育时期FaFRK3基因定量分析 Fig 6 Quantitative analysis of FaFRK3 gene in different developmental stages of Benihoppe strawberry 3 结论与讨论 植物中的FRK基因对植物的果糖积累具有明显的影响 草莓果实中的FaFRK3蛋白氨基酸序列与 月季 Rosachinensis XP 024157436 1 中的氨基酸序列相似率高达90 16 与水蜜桃 Prunus persica XP 007205340 1 枣 Ziziphus jujuba XP 015873836 1 番木瓜 Carica papaya XP 021909927 1 克里曼丁 橘 Citrus clementina XP 006425063 1 等植物也高度同源 氨基酸序列比对分析表明 FaFRK3蛋白具有 pfkB糖激酶家族的明显特征 属于pfkB糖激酶家族 提示FaFRK3基因是 红颜 草莓果实中果糖激酶蛋 白的关键编码基因之一 定量表达分析发现 FaFRK3基因在 红颜 草莓果实不同发育时期的表达量差 别较大 并且在不同器官中相对表达量明显不同 随着 红颜 草莓果实的成熟 FaFRK3基因的相对表达 量明显减少 这与枸杞中的LbFRK7基因 16 和杨梅中的MrFRK2基因 20 表达趋势分析结果一致 参 考 文 献 1 王贵元 夏仁学 吴强盛 果实中糖分的积累与代谢研究进展 J 北方园艺 2007 3 56 58 2 李丽娜 孔建强 植物蔗糖合酶的结构 功能及应用 J 中国生物化学与分子生物学报 2015 31 9 904 913 3 GRANOT D Role of tomato hexose kinases J Functional Plant Biology 2007 34 6 564 570 4 RIGGS J W CAVALES P C CHAPIRO S M et al Identification and biochemical characterization of the fructokinase gene family in Arabidopsis thaliana J BMC Plant Biology 2017 17 83 5 SMITH S B TAYLOR M A BURCH L R et al Primary structure and characterization of a cDNA clone of fructokinase from potato Solanum tuberosum L cv record J Plant physiology 1993 102 3 1043 6 COPELAND L TANNER G J Hexose kinases of avocado J Physiologia Plantarum 1988 74 3 531 536 4 上 海 农 业 学 报 7 BAYSDORFER C KREMER D F SICHER R C Partial purification and characterization of fructokinase activity from barley leaves J Journal of Plant Physiology 1989 134 2 156 161 8 COPELAND L STONE S R TURNER J F Kinetic studies of fructokinase I of pea seeds J Archives of Biochemistry and Biophysics 1984 233 2 748 760 9 TURNER J F HARRISON D D COPELAND L Fructokinase fraction IV of pea seeds J Plant Physiology 1977 60 5 666 669 10 JIANG H DIAN W LIU F et al Isolation and characterization of two fructokinase cDNA clones from rice J Phytochemistry 2003 62 1 47 52 11 QIN Q P ZHANG S L CHEN J W et al Isolation and expression analysis of fructokinase genes from citrus J Acta Botanica Sinica 2004 46 12 1408 1415 12 陈毅鸿 甘蔗果糖激酶基因家族基因组演化及功能研究 D 福州 福建师范大学 2016 13 GONZALI S PISTELLI L DE BELLIS L et al Characterization of two fructokinases J Plant Science 2001 160 6 1107 1114 14 SUZUKI Y ODANAKA S KAMAYAMA Y Fructose content and fructose related enzyme activity during the fruit development of apple and Japanese pear J Journal of the Japanese Society for Horticultural Science 2001 70 1 16 20 15 QIN Q P CUI Y Y ZHANG L L et al Isolation and induced expression of a fructokinase gene from loquat J Russian Journal of Plant Physiology 2014 61 3 289 297 16 赵建华 尹跃 李浩霞 等 枸杞果糖激酶基因LbFRK7的克隆及表达分析 J 西北植物学报 2018 38 5 816 822 17 YANG J ZHU L CUI W et al Increased activity of MdFRK2 a high affinity fructokinase leads to upregulation of sorbitol metabolism and downregulation of sucrose metabolism in apple leaves J Horticulture Research 2018 5 71 18 郭姗姗 张蒙 单卫星 基于Gateway技术的植物表达载体的构建 J 西北农林科技大学学报 自然科版 2010 38 11 161 166 172 19 吕文远 张玲 王延秀 等 草莓蔗糖转运基因FaSUT5对 申阳 草莓果实糖分积累的影响 J 江西农业学报 2018 30 8 16 20 20 陈馨 施丽愉 邵佳蓉 等 杨梅果糖激酶基因MrFRK2的克隆及在成熟期果实中的表达分析 J 园艺学报 2016 43 8 1585 1592 责任编辑 闫其涛 5