草菇液体菌种培养基配方及培养条件的优化.pdf

收稿日期 2019 12 24 基金项目 上海市科技兴农重点攻关项目技术创新类 2019 02 08 00 08 F01119 作者简介 余昌霞 1985 女 硕士 助理研究员 主要研究方向为食用菌栽培 理 E mail ycx41529 163 com 通信作者 E mail 149213508 qq com 上海农业学报 2020 36 5 41 45 http www nyxb sh cn Acta Agriculturae Shanghai DOI 10 15955 j issn1000 3924 2020 05 08 余昌霞 李正鹏 赵妍 等 草菇液体菌种培养基配方及培养条件的优化 J 上海农业学报 2020 36 5 41 45 草菇液体菌种培养基配方及培养条件的优化 余昌霞 李正鹏 赵 妍 查 磊 汪 虹 杨焕玲 陈明杰 郭 倩 上海市农业科学院食用菌研究所 农业部南方食用菌资源利用重点实验室 国家食用菌 程技术研究中心 国家食用菌加 技术研发中心 上海市农业遗传育种重点开放实验室 上海201403 摘 要 以草菇 厂化栽培主栽品种 9715 菌株为研究对象 通过单因素及正交试验对草菇液体菌种的培 养基配方进行优化 在此基础上 进一步对培养条件 培养温度 装液 接种 转速 进行了优化 结果表明 草菇9715 菌株液体菌种优化的配方为 葡萄糖25 g L 酵母浸粉4 g L KH2PO4 1 g L MgSO4 1 g L 最佳培养条 件为 每250 mL摇瓶装液 120 mL 接种 2 培养温度32 转速125 S min 关键词 草菇 液体菌种 配方优化 培养条件 中图分类号 S646 13 文献标志码 A 文章编号 1000 3924 2020 05 041 05 Optimization of cultivation medium and culture conditions for liquid spawn of Volvariella volvacea YU Changxia LI Zhengpeng ZHAO Yan ZHA Lei WANG Hong YANG Huanling CHEN Mingjie GUO Qian Institute of Edible Fungi Shanghai Academy of Agricultural Sciences Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization South Ministry of Agriculture P R China National Engineering Research Center of Edible Fungi National RKey Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai Shanghai 201403 China Abstract Taking the main cultivated stSain 9715 of Volvariella volvacea as the test mateSial the cultivation medium foSmula of liquid spawn was optimized by single factoS and oSthogonal expeSiments Based on the optimized cultivation media foSmulation the mycelial biomass was used as Sesponse value and the oSthogonal matSix method was applied to the optimization of liquid cultuSe conditions incubation tempeSatuSe liquid volume inoculation volume Sotation speed foS V volvacea The Sesults showed that the most suitable foSmula of the liquid spawn of the 9715 stSain was glucose 25 g L yeast extSact 4 g L KH2PO4 1 g L and MgSO4 1 g L the optimal cultuSe conditions foS the liquid spawn weSe liquid volume of 120 mL 250 mL inoculation volume of 2 incubation tempeSatuSe of 32 and Sotation speed of 125 S min Key words Volvariella volvacea Liquid spawn Optimization of cultivation medium foSmula CultuSe conditions 随着食用菌 厂化的发展 食用菌液体菌种在 厂化 产中已被广泛应用 液体菌种因其具有 长 迅速 菌龄整齐 制种简便 使用方便 接种点多 萌发和现蕾快 周期短等优点 受到 厂化 产的青睐 同时可降低 产成本 提高产品质 经济效益显著 1 2 目前 液体菌种已在金针菇 3 4 杏鲍菇 5 蟹味 菇 6 等 厂化企业广泛应用 香菇液体菌种 7 也在逐步普及 草菇是最具中国特色的食用菌品种之一 具有较高的市场知名度 售价一直居高不下 8 其 物学特 性也显示了它是最佳的 厂化栽培品种之一 目前 草菇产业将逐步往 厂化 标准化 规模化和智能化 的方向发展 多年来 草菇 产中仍采用固体制种方式 9 常规的固体菌种是采用棉籽壳菌种 经过原 余昌霞 等 草菇液体菌种培养基配方及培养条件的优化 种 栽培种等复杂的 产环节 以及装瓶 掏瓶 装袋 灭菌 接种等繁琐的程序 存在 产周期长 菌龄不 一致 操作不便等缺点 由于草菇 物学效率较低 因此需要在其制种技术和栽培技术方面进行改进 为适应新形势下的草菇产业大规模发展 草菇液体菌种用于草菇 厂化栽培是发展的趋势之一 本研究 通过正交试验分别对草菇液体菌种培养基配方 培养条件进行优化 为草菇液体菌种应用于 厂化栽培 提供参考 1 材料与方法 1 1 供试菌株 草菇 V volvacea 9715 菌株由上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心提供 1 2 培养基 固体培养基 PDA培养基为美国BD公司 产的合成培养基 称取39 g加水定容至1 L 用于试管和 平板培养菌丝 碳源筛选培养基 g L 碳源20 蛋白胨1 磷酸二氢钾2 硫酸镁0 5 供试碳源为葡萄糖 蔗糖 麦芽 糖 果糖 海藻糖 氮源筛选培养基 g L 氮源2 葡萄糖20 磷酸二氢钾2 硫酸镁0 5 供试氮源为蛋白胨 酵母浸粉 牛肉浸膏 硫酸铵 硝酸钾 培养条件优化培养基 g L 葡萄糖25 酵母浸粉4 磷酸二氢钾1 硫酸镁1 以上所有培养基均在121 下灭菌15 min 1 3 碳 氮源的筛选 将保存的菌种活化 即转接至PDA平板 32 恒温培养3 d可得母种 然后将活化的母种用打孔器 打孔 取一定 的菌块经均质仪打碎后 接入2 以15 mm2菌块 为1 的菌种接种 的菌液于装有 100 mL筛选培养基的250 mL三角瓶中 置于32 转速150 S min摇床上振荡培养5 d 收集菌丝测定菌 丝 物 每处理5 重复 1 4 液体菌种配方优化 根据碳 氮源的单因素筛选试验结果 分别选取较好的碳源 氮源及KH2PO4和MgSO4 设 L9 34 正交试验 对草菇液体菌种的培养基配方进行优化 试验因素及水平如表1所示 接种方法及培养条件 同1 3 通过测定菌丝 物 确定培养基的最佳配方 表1 最佳配方L9 34 正交试验因素水平 Table 1 Factors and levels of the L9 34 orthogonal experiment g L 1 水平因素A葡萄糖B酵母浸粉C磷酸二氢钾 KH 2PO4 D硫酸镁 MgSO4 1 15 1 1 0 5 2 20 2 2 1 3 25 4 4 2 1 5 液体菌种培养条件的确定 经正交试验筛选出草菇液体菌种培养的最佳配方后 再对适宜配方的培养条件进行优化 分别选取 接种 液体装瓶 温度和转速 采用L9 34 正交表确定液体菌种的最佳培养条件 试验因素及水平如 表2所示 通过测定菌丝 物 确定培养基的最佳配方 表2 最佳培养条件L9 34 正交试验因素水平 Table 2 Factors and levels of the L9 34 orthogonal experiment 水平因素A接种 B装瓶 mL C温度 D转速 S min 1 1 1 80 30 100 2 2 100 32 125 3 5 120 34 150 1 6 生物量测定 用无纺布过滤培养结束的液体培养基中的菌丝 再用蒸馏水冲洗2 3次 收集菌丝在烘箱中 60 24 上 海 农 业 学 报 烘 至恒重 用电子分析天平称其 重 1 7 数据分析 测得的数据采用SPSS 19 0进行分析 2 结果与分析 2 1 草菇液体菌种培养基配方的确定 2 1 1 不同碳源对草菇菌丝生长的影响 碳源是构成细胞和代谢产物中碳架来源的营养物质 也是 长繁殖的能 来源 为食用菌菌丝 长 提供重要的营养 由表3可知 草菇菌丝在5种碳源中均能 长 但以葡萄糖为碳源时 菌丝 物 达到 最高 并显著高于其他碳源 表明葡萄糖可作为 草菇9715 菌株液体菌种的最适碳源 表3 不同碳源对草菇菌丝生长的影响 Table 3 Effect of different carbon source on the mycelial growth of V volvacea g 碳源每100 mL菌丝 物 重碳源每100 mL菌丝 物 重 葡萄糖0 146 9 0 006 7 a果糖0 054 6 0 005 4 c 蔗糖0 134 4 0 003 3 b海藻糖0 136 5 0 006 9 b 麦芽糖0 053 1 0 003 1 c 注 数据为 平均数 标准差 n 5 同行不同小写字母为P 0 05的差异显著性 2 1 2 不同氮源对草菇菌丝生长的影响 氮源是食用菌细胞合成蛋白质和核酸的主要原料 在深层发酵中起着重要作用 由表4可知 草菇 9715 在酵母浸粉 牛肉浸膏和蛋白胨中均能很好的 长 而在硝酸钾和硫酸铵中 长较差 表明草菇利 用无机氮的效果不佳 其中以酵母浸粉为氮源时 菌丝 物 最大 极显著优于其他氮源 表明酵母浸粉 可作为 草菇9715 菌株液体菌种的最适氮源 表4 不同氮源对草菇菌丝生长的影响 Table 4 Effect of different nitrogen source on the mycelial growth of V volvacea g 氮源每100 mL菌丝 物 重氮源每100 mL菌丝 物 重 蛋白胨0 231 4 0 006 8 B硝酸钾0 029 1 0 003 3 D 酵母浸粉0 347 8 0 028 2 A硫酸铵0 075 8 0 007 5 C 牛肉浸膏0 234 0 0 015 7 B 注 数据为 平均数 标准差 n 5 同行不同大写字母为P RB RD RC 极差越大起的作用越大 4 因素中对菌丝 物 的影响大小依次为 葡萄糖 A 酵母浸粉 B MgSO4 D KH2PO4 C 其中MgSO4和KH2PO4的影响较小 根据方差分析结果 表6 葡萄糖对菌丝 物 的影响最为显著 在试验设 范围内 优化得到的最佳配方为A3B3C1D2 这与正交试验表中出现 34 余昌霞 等 草菇液体菌种培养基配方及培养条件的优化 的最大值组合A2B3C1D2不一致 经验证 以组合A3B3C1D2培养的草菇液体每100 mL菌种菌丝体 重达 到 0 507 9 0 022 9 g 优于A2B3C1D2 即适合 草菇9715 菌株液体培养的最佳培养基配方为 葡萄糖 25 g L 酵母浸粉4 g L KH2PO41 g L MgSO41 g L 表6 配方正交试验结果方差分析 Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment result of cultivation medium 变异来源自由度平方和均方F显著性 葡萄糖2 0 076 0 038 26 924 酵母浸粉2 0 025 0 013 8 957 磷酸二氢钾2 0 000 0 000 0 176 硫酸镁2 0 023 0 012 8 204 误差27 0 069 0 001 总和35 1 206 2 2 草菇液体菌种培养条件的确定 根据2 1中优化得到的培养基组合作为基本培养基 选择液体装瓶 等作为基本因子 进行L9 34 正交试验 结果如表7 不同处理菌丝 物 有一定差异 由极差分析结果可以看出 RD RC RA RB 4 因素对草菇液体菌种菌丝 物 的影响依次为 转速 D 温度 C 接种 A 装液 B 通过 方差分析 四因素中 转速和温度的影响较为显著 其中转速的作用最为显著 表8 在试验设 范围内 优化得到的最佳培养条件为A2B3C1D2 即接种 2 装瓶 120 mL 温度32 转速125 S min 表7 最佳培养条件L9 34 正交试验设计及结果 Table 7 Results of the L9 34 orthogonal experiment of optimal culture conditions 序号A B C D每100mL菌丝 物 重 g 1 1 1 1 1 0 164 4 0 021 0 2 1 2 2 2 0 387 9 0 042 2 3 1 3 3 3 0 305 4 0 042 1 4 2 1 2 3 0 344 6 0 017 1 5 2 2 3 1 0 149 5 0 010 7 6 2 3 1 2 0 602 2 0 084 7 7 3 1 3 2 0 475 1 0 071 0 8 3 2 1 3 0 488 7 0 017 0 9 3 3 2 1 0 121 8 0 020 2 K1 0 285 9 0 328 1 0 418 4 0 145 2 K2 0 365 5 0 342 0 0 284 8 0 488 4 K3 0 361 8 0 343 1 0 310 0 0 379 6 R 0 079 6 0 015 0 0 133 6 0 343 2 表8 培养条件正交试验结果方差分析 Table 8 Variance analysis of orthogonal experiment result of culture conditions 变异来源自由度平方和均方F显著性 接种 2 0 061 0 030 15 744 装液 2 0 002 0 001 0 550 温度2 0 151 0 076 39 337 转速2 0 923 0 461 239 925 误差36 0 069 0 002 总和44 1 206 3 结论与讨论 草菇液体菌种 长的影响因素较多 如 长所需的营养物质 培养温度 接种 等 液体菌种培养基 的优化对菌丝 长产 重要的影响 特别是碳 氮源的种类及浓度的选择优化 任海霞等 10 研究表明 液 体培养条件下 适宜草菇菌丝 长的最佳碳源是淀粉 最佳氮源是蛋白胨 最佳碳氮比是10 1 最佳淀粉 浓度是3 0 草菇菌丝 长的最适温度为30 最适pH为7 0 张萍等 11 研究了不同碳源 氮源及无 机盐对 草菇V110 液体培养菌丝 长的影响 结果表明草菇液体培养较适宜的碳源是蔗糖 氮源是蛋白 胨 酵母膏和牛肉膏 无机盐是KH2PO4 杜姝莲等 12 研究表明 草菇V238 菌株液体菌种较适宜的葡 44 上 海 农 业 学 报 萄糖浓度为1 1 5 最佳 长温度为33 转速为200 S min 接种 为5 本研究通过单因素筛 选试验 以菌丝 物 作为评价指标 13 14 确定了 草菇9715 液体菌种最适碳源为葡萄糖 最适氮源为 酵母浸粉 结果表明 草菇菌丝既可以利用单糖也可以利用双糖物质的碳源 且葡萄糖的效果较好 可能 是因为小分子碳源可被直接吸收利用 在培养前期可使菌种快速定植 而大分子的碳源需要通过菌丝体 分泌的胞外酶水解为葡萄糖后才被利用 以酵母浸粉为氮源 因其是酵母细胞经过破壁之后的水提取 其营养成分更加丰富而更利于菌丝 长所需 正交试验在研究多因素多水平的试验中具有高效 快速等优点 是目前常用的优化培养基的方法之 一 本试验进一步通过正交试验 对适合 草菇9715 菌丝 长的液体培养基配方及培养条件进行了优 化 经试验得到 草菇9715 液体菌种的最佳配方为葡萄糖25 g L 酵母浸粉4 g L KH2PO4 1 g L MgSO4 1 g L 最佳培养条件为接种 2 装瓶 120 mL 温度32 转速125 S min 此时草菇液体每100 mL菌 种的菌丝 物 可达 0 602 2 0 084 7 g 本研究结果与前人研究结果有相似之处 也有不同之处 其 原因可能是试验选用的菌种不同或培养基的物料配比差异导致的 本研究可为草菇 厂化液体菌种的 应用提供科学依据 并加快草菇 厂化栽培的进程 参 考 文 献 1 戴建清 曾志恒 食用菌液体菌种研究现状及发展趋势 J 中国食用菌 2012 31 5 1 3 2 郭静利 刘旭 食用菌液体和固体制种技术比较经济效益分析 J 中国农业科学 2011 44 4 835 841 3 谭一罗 苏文英 王朝晖 等 厂化金针菇菌株液体培养基的筛选和优化 J 食品与发酵科技 2019 55 1 35 37 43 4 黄竹青 郑剑玲 邓铁宏 等 白色金针菇液体菌种制备及 厂化 产应用初探 J 微 物学杂志 2013 33 2 75 79 5 王涛 谭琦 李玉 等 杏鲍菇液体菌种应用 艺参数的优化 J 上海农业学报 2019 35 1 33 37 6 王迎鑫 蟹味菇 厂化栽培稳定性研究 D 重庆 西南大学 2014 7 周峰 李巧珍 杨仁智 等 香菇液体菌种与固体菌种的 产成本和使用效果分析 J 食药用菌 2017 25 3 199 202 204 8 汤倩倩 孙占刚 俞美莲 等 上海市食用菌产业发展现状及对策研究 J 中国食用菌 2019 38 1 80 84 88 9 张丽蓉 草菇菌种质 控制技术研究 D 福州 福建农林大学 2011 10 任海霞 杨鹏 曲玲 等 草菇液体菌种培养条件优化研究 J 山东农业科学 2014 46 2 58 60 11 张萍 蒋小满 卜庆梅 等 不同营养条件对草菇液体培养的影响 J 江苏农业科学 2005 5 97 99 12 杜姝莲 全卫丰 刘广建 草菇液体菌种最佳 长因子试验 J 食用菌 2004 1 16 18 13 李维焕 于兰兰 韩峰 等 2种食用菌液体菌种发酵终点的质 变化检测方法 J 中国酿造 2010 11 160 162 14 林增祥 付永前 曾宪贤 食用菌液体菌种发酵终点的简便检测方法 J 中国食用菌 2006 25 4 25 26 责任编辑 张睿 54