百合枯萎病病原菌的分离鉴定及其接种浓度对发病程度的影响.pdf

南 京 农 业 大 学 学 报 2020 43 6 1097 1106 JournalofNanjingAgriculturalUniversity DOI 10 7685 jnau 202001038 收 稿 日 期 2020 01 17 基 金 项 目 国 家 公 益 性 行 业 农 业 科 研 专 项 201503110 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 31972506 江 苏 省 重 点 研 发 计 划 现 代 农 业 项 目 BE2018338 江 苏 省 农 业 科 技 自 主 创 新 资 金 CX 18 3095 作 者 简 介 任 胜 林 硕 士 研 究 生 通 信 作 者 黄 启 为 教 授 研 究 方 向 为 农 业 废 弃 物 资 源 化 与 生 物 有 机 肥 E mail qwhuang 任胜林 梅慧 玲 李 映萱 等 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 的 分 离 鉴 定 及 其 接 种 浓 度 对 发 病 程 度 的 影 响 J 南 京 农 业 大 学 学 报 2020 43 6 1097 1106 RENShenglin MEIHuiling LIYingxuan etal IsolationandidentificationofLilyFusariumwiltpathogenandtheeffectofsporesuspensionconcentra tionontheextentofdisease J JournalofNanjingAgriculturalUniversity 2020 43 6 1097 1106 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 的 分 离 鉴 定 及 其 接 种 浓 度 对 发 病 程 度 的 影 响 任 胜 林 梅 慧 玲 李 映 萱 杜 彭 涛 文 涛 乔 亦 铸 张 赫 麦 远 愉 董 银 霜 李 静 黄 启 为 南 京 农 业 大 学 资 源 与 环 境 科 学 学 院 江 苏 省 固 体 有 机 废 弃 物 资 源 化 高 技 术 研 究 重 点 实 验 室 江 苏 省 有 机 固 体 废 弃 物 资 源 化 协 同 创 新 中 心 国 家 有 机 类 肥 料 工 程 技 术 研 究 中 心 江 苏 南 京210095 摘 要 目 的 江 苏 宜 兴 是 我 国 百 合 生 产 的 传 统 优 势 产 区 百 合 枯 萎 病 是 严 重 阻 碍 百 合 产 业 化 健 康 发 展 的 一 个 关 键 因 子 通 过 分 离 鉴 定 百 合 枯 萎 病 的 致 病 菌 株 接 种 不 同 浓 度 的 病 原 菌 孢 子 悬 液 研 究 百 合 的 发 病 程 度 为 江 苏 宜 兴 百 合 枯 萎 病 的 生 物 防 治 提 供 科 学 基 础 方 法 采 集 宜 兴 百 合 种 植 区 典 型 枯 萎 病 发 病 严 重 的 植 株 及 鳞 茎 分 离 致 病 菌 株 通 过 柯 赫 氏 法 则 回 接 试 验 初 步 确 定 致 病 性 对 致 病 性 强 的 菌 株 进 行DNA 提 取 PCR 扩 增 和 测 序 基 于 病 原 菌rDNA ITS 基 因 序 列 和GenBank 中 已 有 相 关 尖 孢 镰 刀 菌 序 列 应 用MEGA7 0 软 件 构 建 系 统 发 育 树 采 用 刺 伤 百 合 鳞 片 接 种 不 同 浓 度 的 病 原 菌 孢 子 悬 液 与 在 土 壤 中 接 种 不 同 浓 度 病 原 菌 孢 子 悬 液 的 方 法 评 估 不 同 浓 度 孢 子 悬 液 对 百 合 枯 萎 病 发 病 程 度 的 影 响 结 果 从 典 型 枯 萎 病 严 重 发 病 的 植 株 上 共 分 离 得 到4 株 病 原 菌 株 P OF P PF P RF 和P BF 分 离 率 分 别 为25 20 10 和5 柯 赫 氏 法 则 回 接 试 验 表 明 接 种 菌 株P OF P PF 百 合 发 病 率 为100 鳞 片 病 情 指 数 分 别 为92 50 48 25 15 00 30 00 盆 栽 试 验 表 明 接 种 菌 株P OF 的 百 合 植 株 最 先 发 病 初 步 确 定 菌 株P OF 的 致 病 性 最 强 通 过 形 态 学 和 分 子 生 物 学 对 菌 株P OF 的 鉴 定 结 果 表 明 从 典 型 枯 萎 病 严 重 发 病 百 合 植 株 中 所 分 离 的 病 原 菌 为 尖 孢 镰 刀 菌 Fusariumoxysporum 百 合 枯 萎 病 的 病 情 指 数 与 接 种 病 原 菌 孢 子 悬 液 浓 度 相 关 百 合 鳞 片 接 种 试 验 和 盆 栽 试 验 结 果 表 明 土 壤 病 原 菌 浓 度 为10 3 CFU g 1 是 导 致 百 合 植 株 发 病 的 临 界 浓 度 当 土 壤 病 原 菌 浓 度 低 于10 5 CFU g 1 时 病 情 指 数 随 接 种 浓 度 增 加 而 增 加 当 土 壤 病 原 菌 浓 度 高 于 10 5 CFU g 1 时 病 情 指 数 不 再 显 著 增 加 结 论 从 江 苏 宜 兴 百 合 枯 萎 病 的 典 型 发 病 植 株 中 分 离 到4 株 病 原 菌 株 其 中 菌 株 P OF 的 致 病 性 最 强 经 鉴 定 为 尖 孢 镰 刀 菌 百 合 专 化 型 Fusariumoxysporumsp f lilii 导 致 百 合 植 株 发 病 的 临 界 土 壤 病 原 菌 浓 度 为10 3 CFU g 1 关 键 词 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 分 离 孢 子 悬 液 浓 度 病 情 指 数 发 病 率 中 图 分 类 号 S432 4 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000 2030 2020 06 1097 10 Isolationandidentificationoflily F u s a r i u mwiltpathogenandthe effectofsporesuspensionconcentrationontheextentofdisease RENShenglin MEIHuiling LIYingxuan DUPengtao WENTao QIAOYizhu ZHANGHe MAIYuanyu DONGYinshuang LIJing HUANGQiwei CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences JiangsuProvincialKeyLaboratoryforOrganicSolidWasteUtilization JiangsuCollaborativeInnovationCenterforSolidOrganicWasteResourceUtilization NationalEngineeringResearch CenterforOrganic BasedFertilizers NanjingAgriculturalUniversity Nanjing210095 China Abstract Objectives Lily Liliumspp isoneofthedominanttraditionalproductionareasinYixingCity JiangsuProvince China Fusariumwiltisakeystuntingfactorforthehealthydevelopmentoflilyproduction Theisolationandidentificationofthepathogenic strainsoflilyFusariumwiltinYixingCity inoculationofsporesuspensionsofpathogensofdifferentconcentrationsandtherelationship betweenoccurrencedegreeandtheconcentrationofsporesuspensionsofpathogenswerecarriedoutforprovidingscientificbasisin biologicalcontroltechnologyoflilyFusariumwiltinYixing Methods Thepathogenicstrainswereisolatedfromtheplantswithsevere blightdiseaseandbulbsinthelilyfieldofYixing ThepathogenicitywaspreliminarilydeterminedbytheKoch srulebackhaulexperi ment ThehighlypathogenicstrainsweresubjectedtoDNAextraction PCRamplificationandsequencing Thephylogeneticdendrogram南 京 农 业 大 学 学 报 第43 卷 wasconstructedbasedontherDNA ITSgenesequenceofthepathogensandtherelatedFusariumoxysporumsequenceinGenBankby usingMEGA7 0software TheincidenceoflilyFusariumwiltwasevaluatedbyinoculatingexperimentsbothininoculatingpathogen sporesuspensiontothesoilandinwoundedinoculatingpathogensporesuspensionontheplants Results Atotalof4pathogenic strainsofP OF P PF P RFandP BFwereisolatedfromseverelyblightedplants withisolationratesof25 20 10 and5 respectively Theback to backexperimentsofthelawshowedthattheincidenceofP OFandP PFwas100 andthescaleindexwas 92 50 48 25 15 00and30 00 respectively TheresultsofpotexperimentshowedthatthetreatmentoflilyplantsinoculatedwithP OF wasthefirsttodevelopthedisease ThishintedthatthepathogenicityofP OFmightbethestrongest TheidentificationofP OFby morphologyandmolecularbiologyshowedthatthepathogenisolatedfromlilyplantswithseverewiltwasFusariumoxysporum The resultsoflilyscaleinoculationandpotexperimentshowedthattheconcentrationofsoilpathogenat10 3 CFU g 1 wasthecritical concentrationoflilyFusariumwilt Thediseaseindexincreasedwithincreasinginoculationconcentrationwithin10 5 CFU g 1 andno longerincreasedsignificantlyifthepathogenconcentrationinsoilwashigherthan10 5 CFU g 1 ThediseaseindexoflilyFusariumwilt wasrelatedto the concentration of spore suspension of inoculated pathogens Conclusions Four pathogenic strains identified as FusariumoxysporumwereisolatedfromFusariumwiltplantsinYixinglilyfield TheP OFwasthemostpathogenicstrain identifiedas Fusariumoxysporumsp f lilii Thecriticalconcentrationofsoilpathogenwas10 3 CFU g 1 Keywords lily Fusariumwilt pathogenisolation sporesuspensionconcentration diseaseindex incidenceofadisease 百 合 lily 是 单 子 叶 植 物 亚 纲 百 合 科 Liliaceae 百 合 属 Liliumspp 多 年 生 草 本 植 物 1 全 国 各 地 均 有 种 植 主 产 于 湖 南 四 川 河 南 江 苏 浙 江 江 苏 宜 兴 就 是 我 国 百 合 生 产 的 传 统 优 势 产 区 2 百 合 是 具 有 药 用 食 用 观 赏 价 值 的 植 物 3 目 前 正 在 向 规 模 化 产 业 化 和 多 用 高 效 化 的 方 向 发 展 在 百 合 产 业 的 发 展 过 程 中 土 传 病 害 引 起 的 连 作 障 碍 是 影 响 百 合 产 量 和 品 质 的 关 键 技 术 问 题 而 百 合 枯 萎 病 是 连 作 障 碍 引 起 的 最 重 要 病 害 可 造 成 不 同 程 度 的 产 量 和 质 量 损 失 4 百 合 枯 萎 病 也 称 为 百 合 茎 腐 病 根 腐 病 是 一 种 由 土 传 真 菌 引 发 的 一 类 严 重 土 传 病 害 百 合 枯 萎 病 的 病 原 菌 主 要 为 尖 孢 镰 刀 菌 百 合 专 化 型 Fusariumoxysporumsp f lilii 还 有 茄 腐 皮 镰 刀 菌 Fusarium solani 和 串 珠 镰 刀 菌 Fusariummoniliform 5 其 中 由 尖 孢 镰 刀 菌 引 起 的 百 合 枯 萎 病 是 最 严 重 的 病 害 病 原 菌 主 要 从 百 合 肉 质 根 或 鳞 茎 盘 基 部 的 伤 口 侵 入 然 后 鳞 茎 从 基 盘 处 腐 烂 和 剥 落 被 病 原 菌 侵 染 的 植 株 生 长 缓 慢 不 能 向 上 运 输 养 分 同 时 叶 子 从 基 盘 处 逐 渐 变 黄 和 脱 落 造 成 肉 质 根 和 鳞 茎 盘 基 变 褐 腐 烂 6 8 在 贮 存 和 运 输 过 程 中 镰 刀 菌 还 会 持 续 影 响 百 合 植 株 致 使 大 量 鳞 茎 发 生 腐 烂 坏 死 9 枯 萎 病 是 百 合 病 害 中 最 严 重 造 成 经 济 损 失 最 大 的 病 害 之 一 准 确 快 速 地 鉴 定 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 对 于 进 一 步 明 确 该 病 的 发 病 机 制 研 发 百 合 枯 萎 病 的 防 控 技 术 促 进 百 合 产 业 的 健 康 发 展 都 具 有 重 要 意 义 百 合 枯 萎 病 的 发 生 与 诸 多 因 素 相 关 例 如 百 合 品 种 的 抗 性 百 合 生 长 时 期 环 境 条 件 湿 度 和 温 度 等 以 及 土 壤 中 病 原 菌 的 状 态 等 10 外 界 环 境 条 件 相 对 稳 定 时 作 物 土 壤 病 害 的 发 病 率 以 及 发 病 程 度 与 土 壤 中 病 原 菌 数 量 呈 正 相 关 关 系 9 11 然 而 在 相 对 稳 定 的 环 境 中 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 接 种 浓 度 对 百 合 发 病 程 度 的 影 响 还 鲜 有 报 道 本 研 究 对 江 苏 宜 兴 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 进 行 分 离 及 鉴 定 研 究 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 数 量 与 百 合 发 病 的 关 系 旨 在 为 江 苏 宜 兴 百 合 枯 萎 病 的 生 物 防 治 提 供 科 学 依 据 1 材 料 与 方 法 1 1 试 验 材 料 1 1 1 供 试 百 合 植 株 从 江 苏 省 宜 兴 市 柯 铭 生 态 园 百 合 种 植 基 地 采 集10 株 严 重 发 病 的 具 有 典 型 枯 萎 病 症 状 的 百 合 植 株 品 种 为 宜 兴 百 合 分 类 学 定 名 为 卷 丹 LiliumlancifoliumThunb 1 1 2 培 养 基 配 方 PDA 培 养 基 20 马 铃 薯 浸 出 液1000mL 200g 马 铃 薯 煮 沸15min 定 容 至1000 mL 葡 萄 糖20g 琼 脂18g 尖 孢 镰 刀 菌 的 选 择 性 培 养 基 KH 2 PO 4 1 0g KCl0 5g MgSO 4 7H 2 O0 5g Fe Na EDTA0 01g L 天 门 冬 酰 胺2 0g D 半 乳 糖20 0g 蒸 馏 水1000mL 抗 生 素 类 物 质 二 硝 基 苯 75 可 湿 性 粉 剂 1 0g 牛 胆 汁0 5g Na 2 B 4 O 7 10H 2 O1 0g 硫 酸 链 霉 素0 3g 培 养 基 用10 体 积 分 数 磷 酸 调 节pH 值 至3 8 0 2 配 制 参 照 文 献 12 13 1 2 试 验 方 法 1 2 1 病 原 菌 的 分 离 和 纯 化 选 择 发 病 百 合 的 根 茎 鳞 茎 作 为 分 离 材 料 从 其 病 健 交 界 处 切 取1cm 1cm 的 小 块 组 织 先 在75 乙 醇 中 浸3min 以 除 去 气 泡 无 菌 水 冲 洗3 次 再 用5 次 氯 酸 钠 浸 泡5min 进 8 9 0 1 第6 期 任 胜 林 等 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 的 分 离 鉴 定 及 其 接 种 浓 度 对 发 病 程 度 的 影 响 行 表 面 消 毒 用 无 菌 水 冲 洗7 次 用 灭 菌 滤 纸 吸 干 表 面 水 分 然 后 以 五 点 法 将 组 织 转 移 在PDA 培 养 基 上 置 于28 培 养 箱 中 培 养 待 长 出 菌 丝 后 挑 取 部 分 菌 丝 接 种 在PDA 平 板 上 经3 次 纯 化 后 根 据 菌 落 颜 色 和 形 态 进 行 分 类 编 号 采 用 稀 释 法 进 行 单 孢 分 离 和 培 养 1 2 2 回 接 试 验 根 据 柯 赫 法 则 Koch srule 为 验 证 分 离 纯 化 得 到 的4 株 病 原 菌 菌 株 的 致 病 性 进 行 回 接 试 验 回 接 试 验 采 用 鳞 片 接 种 法 14 和 盆 栽 试 验 鳞 片 接 种 法 试 验 于2018 年10 月10 日 25 日 在 实 验 室 进 行 盆 栽 试 验 于2019 年4 月15 日 6 月15 日 在 温 室 内 进 行 鳞 片 接 种 法 选 取 健 康 的 百 合 鳞 茎 片 用75 的 乙 醇 表 面 消 毒 无 菌 水 冲 洗5 次 用 灭 菌 牙 签 在 健 康 百 合 鳞 片 上 刺 孔 将 带 有 培 养 基 的 菌 饼 贴 在 孔 上 以 刺 孔 但 不 贴 菌 饼 的 鳞 片 作 为 对 照 将 百 合 鳞 片 放 置 于 28 培 养 箱 内 培 养 菌 饼 制 备 将 分 离 的 菌 株 P RF P BF P PF P OF 在PDA 平 板 上 培 养 培 养 至 菌 落 铺 满 整 个 平 板 使 用 直 径 为5mm 的 菌 饼 打 孔 器 将 长 满 病 原 菌 的 平 板 制 备 成 多 个 直 径 为5mm 的 菌 饼 备 用 设 置5 个 处 理 1 接 种 菌 株P RF 的 菌 饼 简 称P RF 2 接 种 菌 株P BF 的 菌 饼 简 称P BF 3 接 种 菌 株P PF 的 菌 饼 简 称P PF 4 接 种 菌 株P OF 的 菌 饼 简 称P OF 5 未 接 病 原 菌 的 菌 饼 CK 每 个 处 理 重 复4 次 5 片 健 康 百 合 鳞 片 组 成1 次 重 复 每 片 鳞 片 上 接2 个 菌 饼 即5 片 健 康 百 合 鳞 片 上 的10 个 菌 饼 组 成1 次 重 复 未 接 菌 饼 作 为 对 照 盆 栽 试 验 共 设 置5 个 处 理 1 对 照 CK T1 无 菌 水 2 菌 株P RF 的 孢 子 悬 液 T2 3 菌 株P BF 的 孢 子 悬 液 T3 4 菌 株P PF 的 孢 子 悬 液 T4 5 菌 株P OF 的 孢 子 悬 液 T5 每 处 理 重 复9 次 菌 株 孢 子 悬 液 制 备 用 直 径5mm 的 无 菌 打 孔 器 分 别 取 分 离 纯 化 后 不 同 菌 株 的 菌 丝 块 分 别 接 种 至 液 体PDA 培 养 基 28 摇 床 振 荡 培 养5 7d 后 将 培 养 液 用4 层 无 菌 纱 布 过 滤 8000r min 1 离 心10min 收 集 孢 子 加 无 菌 水 重 悬 制 成 每 毫 升 孢 子 数 量 为10 8 的 孢 子 悬 液 待 用 盆 栽 试 验 每 盆 装1kg 水 稻 土 经 检 测 无 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 每 盆 定 植1 株 健 康 百 合 苗 待 百 合 苗 成 活 后 采 用 针 刺 伤 根 法 接 种 除 对 照 接 无 菌 水 外 其 他 处 理 分 别 接 种 不 同 菌 株 的 孢 子 悬 液 接 种 量 1mL 常 规 管 理 1 2 3 病 原 菌 的 形 态 学 鉴 定 将 分 离 纯 化 的 枯 萎 病 病 原 菌 菌 株 接 种 到PDA 平 板 上 采 用 稀 释 法 进 行 单 孢 分 离 和 培 养 15 28 培 养5d 后 观 察 菌 落 形 态 在 显 微 镜 下 观 察 菌 丝 分 生 孢 子 的 形 态 以 及 生 长 情 况 根 据 菌 落 直 径 大 型 分 生 孢 子 的 形 态 及 产 生 方 式 有 无 小 型 分 生 孢 子 及 产 生 方 式 有 无 厚 垣 孢 子 及 产 生 方 式 等 为 主 要 形 态 根 据 镰 刀 菌 属 真 菌 鉴 定 手 册 尖 孢 镰 刀 菌 生 物 学 及 其 生 物 防 治 等 的 方 法 进 行 鉴 定 1 2 4 病 原 菌 的 分 子 生 物 学 鉴 定 18SrDNA 鉴 定 使 用 土 壤DNA 提 取 试 剂 盒 DNeasyPowerSoilKit 提 取 真 菌 总DNA 以 提 取 的 病 原 菌 基 因 组 总DNA 作 模 板 PCR 扩 增ITS internaltranscribedspacer 核 酸 片 段 ITS 引 物 ITS1 5 TCCGTAGGTAACCTGGGG 3 ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 引 物 由 南 京 金 斯 瑞 生 物 技 术 有 限公 司 合 成 PCR 反 应 体 系 25 L 引 物ITS1 ITS40 5 L dNTP 2 5mmol L 1 2 5 L 10 PCRBuffer 含MgCl 2 25mmol L 1 2 5 L DNA 模 板1 L TaqDNA 酶 5U L 1 0 5 L ddH 2 O 17 5 L 扩 增 条 件 94 5min 94 30s 54 30s 72 30s 35 个 循 环 72 10min 4 10min PCR 产 物 经 纯 化 后 测 序 将18SrDNA 基 因 序 列 与GenBank 数 据 库 中 的 已 有 序 列 进 行 比 对 分 析 并 用 MEGA7 0 软 件 进 行 序 列 分 析 并 构 建 系 统 发 育 树 确 定 该 菌 株 的 分 类 地 位 1 2 5 不 同 浓 度 病 原 菌 孢 子 悬 液 对 百 合 枯 萎 病 的 影 响 采 用 鳞 片 接 种 法 和 盆 栽 试 验 进 行 鳞 片 接 种 方 法 同1 2 2 节 2018 年11 月20 日 12 月5 日 在 实 验 室 进 行 鳞 片 接 种 法 试 验 2019 年4 月15 日 6 月15 日 在 温 室 内 进 行 盆 栽 试 验 孢 子 悬 液 制 备 用 直 径5mm 的 无 菌 打 孔 器 取 分 离 菌 株P OF 的 菌 丝 块 接 种 到 液 体PDA 培 养 基 中 28 摇 床 振 荡 培 养5 7d 后 将 培 养 液 用4 层 无 菌 纱 布 过 滤 8000r min 1 离 心10min 收 集 孢 子 加 无 菌 水 重 悬 制 成 每 毫 升 孢 子 数 量 为10 8 的 孢 子 悬 液 鳞 片 接 种 法 试 验 设9 个 处 理 1 对 照 CK 鳞 片 接 种 无 菌 水 2 T1 处 理 鳞 片 接 种10 1 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 悬 液 3 T2 处 理 鳞 片 接 种10 2 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 悬 液 4 T3 处 理 鳞 片 接 种10 3 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 悬 液 5 T4 处 理 鳞 片 接 种10 4 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 悬 液 6 T5 处 理 鳞 片 接 种10 5 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 悬 液 7 T6 处 理 鳞 片 接 种10 6 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 悬 液 8 T7 处 理 鳞 片 接 种10 7 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 悬 液 9 T8 处 理 鳞 片 接 种10 8 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 悬 液 9 9 0 1南 京 农 业 大 学 学 报 第43 卷 选 取 健 康 的 百 合 鳞 片 用 灭 菌 牙 签 在 鳞 片 上 刺 孔 制 备 菌 株P OF 悬 液 浓 度 分 别 为10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 和10 8 CFU mL 1 分 别 向 百 合 刺 伤 处 注 射100 L 不 同 浓 度 病 原 菌 孢 子 悬 液 对 照 注 射100 L 无 菌 水 每 个 处 理 重 复6 次 每 次 重 复 含6 片 健 康 百 合 鳞 片 百 合 鳞 片 置 于28 培 养 箱 内 培 养 盆 栽 试 验 设6 个 处 理 1 对 照 CK 无 菌 水 2 T22 处 理 接 种10 2 CFU g 1 病 原 菌 的 土 壤 处 理 3 T33 处 理 接 种10 3 CFU g 1 病 原 菌 的 土 壤 处 理 4 T44 处 理 接 种10 4 CFU g 1 病 原 菌 的 土 壤 处 理 5 T55 处 理 接 种10 5 CFU g 1 病 原 菌 的 土 壤 处 理 6 T66 处 理 接 种10 6 CFU g 1 病 原 菌 的 土 壤 处 理 盆 栽 试 验 每 盆 装1kg 水 稻 土 经 检 测 无 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 除 对 照 外 其 他 处 理 分 别 接 种 菌 株 P OF 的 孢 子 悬 液 每 盆 总 液 体 量 相 同 不 够 部 分 用 无 菌 水 补 充 采 用 稀 释 涂 布 控 制 各 处 理 土 壤 病 原 菌 浓 度 分 别 为10 2 10 3 10 4 10 5 和10 6 CFU g 1 平 衡2 3d 再 选 择8 10cm 高 的 健 康 百 合 苗 定 植 每 盆 定 植 1 株 每 处 理 重 复9 次 常 规 水 肥 管 理 1 3 测 定 项 目 1 3 1 鳞 片 及 盆 栽 试 验 病 情 指 数 diseaseseverityindex DSI 的 统 计 接 种 不 同 浓 度 的 病 原 菌 孢 子 悬 液 后 10d 后 记 录 发 病 症 状 测 量 每 个 发 病 百 合 鳞 片 的 病 斑 直 径 d 计 算 病 斑 占 鳞 片 面 积 比 例 将 鳞 片 发 病 级 数 划 分 为5 级 0 级 鳞 片 健 康 无 病 斑 现 象 1 级 病 斑 侵 染 面 积 约 占 百 合 鳞 片 面 积0 10 2 级 病 斑 侵 染 面 积 约 占 百 合 鳞 片 面 积10 20 3 级 病 斑 直 侵 染 面 积 约 占 百 合 鳞 片 面 积20 30 4 级 病 斑 侵 染 面 积 约 占 百 合 鳞 片 面 积30 以 上 接 种 不 同 浓 度 的 病 原 菌 孢 子 悬 液 后 当 第1 株 病 株 出 现 后 每 隔5d 调 查 发 病 情 况 病 情 严 重 度 分 为 4 级 0 级 为 健 康 植 株 1 级 为1 至2 片 叶 片 变 黄 萎 蔫 2 级 为3 片 以 上 至 全 株1 3 叶 片 变 黄 萎 蔫 茎 轻 微 腐 烂 3 级 为 全 株 叶 片1 2 至3 4 变 黄 萎 蔫 茎 中 度 腐 烂 4 级 为3 4 以 上 或 全 株 叶 片 变 黄 萎 蔫 茎 严 重 腐 烂 病 情 指 数 DSI 100 病 害 发 病 级 数 该 级 别 的 植 株 数 供 试 植 株 或 鳞 片 数 总 植 株 或 鳞 片 数 1 3 2 统 计 发 病 率 鳞 片 接 种 不 同 浓 度 的 病 原 菌 孢 子 悬 液 试 验 10d 后 统 计 发 病 率 观 察 百 合 鳞 片 刺 伤 接 种 孢 子 悬 液 部 位 是 否 出 现 褐 色 病 斑 发 病 率 处 理 发 病 株 数 处 理 重 复 次 数 100 盆 栽 试 验 百 合 移 苗 后 每 天 观 察 百 合 生 长 情 况 至 植 株 发 病 严 重 时 记 录 发 病 植 株 数 1 4 数 据 分 析 采 用Excel2016 和SPSS24 软 件 进 行 数 据 统 计 和 显 著 性 水 平 检 验 2 结 果 与 分 析 2 1 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 菌 株 的 分 离 从 严 重 发 病 的 典 型 枯 萎 病 症 状 的10 株 百 合 植 株 上 分 离 得 到4 株 病 原 菌 菌 株 分 别 编 号 为P OF P PF P RF P BF 其 他 病 原 菌 未 分 离 成 功 分 离 结 果 见 表1 表1 宜 兴 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 菌 株 分 离 Table1 Isolationof F u s a r i u mwiltpathogensinYixing 菌 株 Strain 分 离 部 位 Separationsite 组 织 块 数 Numberoforganizationblocks 感 染 菌 块 数 Numberofinfectedbacteria 分 离 率 Separationrate P OF 鳞 片Scales 20 5 25 P PF 鳞 片Scales 20 4 20 P RF 鳞 片Scales 20 2 10 P BF 鳞 片Scales 20 1 5 2 2 病 原 菌 回 接 试 验 刺 伤 接 菌 后 的 百 合 鳞 片 发 病 症 状 与 田 间 发 病 症 状 相 同 回 接 分 离 的4 株 病 原 菌 株 的 百 合 鳞 片 刺 伤 口 出 现 褐 色 病 斑 同 时 向 周 围 蔓 延 图1 接 种 不 同 病 原 菌 的 百 合 鳞 片 的 病 情 指 数 显 著 高 于 未 回 接 病 原 菌 的 百 合 鳞 片 回 接P OF 病 原 菌 处 理 的 病 情 指 数 显 著 高 于 菌 株P RF P BF P PF 同 时 回 接 菌 株P OF 和P PF 的 百 合 鳞 片 发 病 率 高 达100 表2 除 对 照 外 接 种 百 合 枯 萎 病4 个 菌 株13d 后 百 合 植 株 开 始 发 病 最 先 发 病 的 是 接 种 菌 株P OF 的 处 理 其 他 依 次 分 别 为 接 种 菌 株P PF P BF P RF 的 处 理 以 上 结 果 表 明 菌 株P OF P PF P BF 和P RF 均 是 导 致 宜 兴 百 合 枯 萎 病 的 病 原 菌 其 中 菌 株P OF 的 致 病 性 最 强 后 续 相 关 研 究 均 以 此 菌 株 为 基 础 展 开 0 0 1 1 第6 期 任 胜 林 等 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 的 分 离 鉴 定 及 其 接 种 浓 度 对 发 病 程 度 的 影 响 图1 病 原 菌 回 接 试 验 Fig 1 Pathogenicbacteriabackgraftingtest 接 种 第8 天 照 片 温 度28 湿 度 为 室 内 湿 度 Onday8afterinoculation temperatureis28 humidityisindoorhumidity 表2 回 接 病 原 菌 对 百 合 枯 萎 病 发 病 病 情 指 数 和 发 病 率 的 影 响 Table2 Effectofpathogenonthediseaseindexandincidenceoflily F u s a r i u mwilt 处 理 Treatment 鳞 片 接 种 试 验Scaleinoculationexperiment 病 情 指 数 Diseaseindex 发 病 率 Incidence 盆 栽 回 接 试 验Pottedbackconnectionexperiment 发 病 率 Incidence 最 初 发 病 出 现 时 间 Timeofinitialonset CK 0 P OF 92 50 2 89 a 100 100 接 种 后14d 14dafterinoculation P PF 48 25 6 29 b 100 100 接 种 后16d 16dafterinoculation P BF 30 00 14 14 c 85 100 接 种 后17d 17dafterinoculation P RF 15 00 4 08 d 60 100 接 种 后18d 18dafterinoculation 注 同 列 不 同 小 写 字 母 表 示 同 列 间 差 异 显 著 P 0 05 下 同 Note Thedifferentlowercaselettersindicatesignificantdifferenceinthesamecolumnat0 05level Thesameasfollows 2 3 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 菌 株P OF 的 显 微 镜 观 察 将 分 离 得 到 的 菌 株P OF 接 种 于PDA 平 板 上 28 培 养5d 后 观 察 其 菌 落 形 态 由 图2 可 见 菌 株 在PDA 培 养 基 上 菌 落 呈 圆 形 其 菌 丝 具 有 条 纹 气 生 菌 丝 呈 白 色 絮 状 或 绒 毛 状 初 期 菌 落 呈 白 色 菌 落 中 央 呈 淡 紫 色 背 面 带 有 淡 紫 色 的 色 素 图2 A B 菌 株 菌 落 繁 茂 气 生 菌 丝 丰 厚 采 用 插 片 法 显 微 400 观 察 病 原 菌 菌 丝