赤霉素高产菌株筛选及发酵条件优化.pdf

北 方 园 艺 研究简报 第一作者简介 李春玲 女 本科 助理研究员 现 主要从事微生物发酵菌种选育等研究工作 责任作者 张萍 女 本科 工程师 现主要从事微 生物发酵等研究工作 收稿日期 赤霉素高产菌株筛选及发酵条件优化 李 春 玲 牛 春 张 萍 宁夏泰瑞制药股份有限公司 宁夏 银川 摘 要 以 株产赤霉素的藤仓赤霉菌 为出发菌株 对其脂肪 酶活性 制霉素抗性 固态发酵效率进行了比较分析 以期选育出赤霉素发酵生产的优良菌 株 结果表明 筛选出 株遗传稳定性好 生产效率高的菌株 其 发酵效价分别为 干基 该研究结果对赤霉素固态发酵生产的实现具 有重要意义 关键词 赤霉素 发酵菌株 藤仓赤霉菌 固态发酵 发酵条件 中图分类号 文献标识码 文章编号 赤霉素 简称 是一种广泛 存在的植物激素 为四环二萜类化合物 研究者已 鉴定出 类化合物有 多种 其中 具有较强的生物活性 被开发成 多种植物生长调节剂 广泛应用于农业 林业等生 产领域 市场前景十分广阔 生产方式主 要包括植物提取法 化学合成法和微生物发酵法 种方法 植物提取法是指从植物组织中分离提 纯 由于植物组织中 含量极低 致使该方 法成本很高 生产效率很低 化学合成法是指采用 系列化学反应生成 该方法过程复杂 成本高 且易造成环境污染 微生物发酵法是通过微生物 细胞发酵生产 该方法具有周期短 效率高等 优点 是工业大规模生产 通用的方法 目前用于发酵生产 的微生物主要是藤 仓赤霉菌 藤仓赤霉菌产 能力是发酵生产最关键的因素 等 等 等 通过诱变的方 法 选育出系列高产的藤仓赤霉菌菌株 世纪 年代 国内 发酵生产的开创者 九二零菌 种选育协作组 筛选出高产变种 成为当时 国内工业化生产上主要菌株 余卿等 利用原 生质体紫外诱变技术获得高产菌株 其产量提高 近 李武军等 利用融合重组诱变技术将菌 株产量提高了近 张金儿等 王卫等 对 藤仓赤霉菌也进行了筛选研究 并获得了较理想 的结果 合适的发酵条件是发酵生产的保障 当 前 生产多采用液体发酵法 但该法存在浓缩 工艺复 杂 成 本 高 等 局 限 严重制约其扩大生 产 近年来的研究表明 固态发酵法生产 较液态发酵效率更高 且成本更低 是 发酵 生产更为理想的方式 总体而言 筛选高产的藤 仓赤霉菌和优化发酵条件 是提高 生产效 率 降低生产成本的有效途径 鉴于此 该研究对 引进的 株产 菌株的生长特性 发酵效率 进行比较分析 筛选出优良菌株 同时对优良菌株 固态发酵体系进行了初步探索 以期为实现 高效发酵生产奠定基础 材料与方法 试验材料 供试菌株为 株产赤霉素的藤仓赤霉菌 由宁夏泰瑞制药股份有 限公司技术中心引进保存 和制霉素购自 公司 其它试剂均为国产分析纯 恒温大幅振荡摇床 武汉科学仪器 厂 恒温培养箱 江苏杰瑞尔电器有限公 司 高效液相色谱系统 活化斜面培养 基 马铃薯粉 葡萄糖 蒸 馏 水 琼 脂 自 然 种 子 培 养 基 马 铃 薯 粉 葡 萄 糖 蒸馏水 脂肪 酶筛选培养基 马铃薯粉 葡萄糖 豆油 琼脂 制霉素抗性筛选 培 养 基 马 铃 薯 粉 葡 萄 糖 蒸馏水 琼脂 灭菌冷却后添加 制霉素 固态发酵培养基 三角 瓶 号培养基为麸皮 玉米淀粉 玉米粉 玉米 芯 豆油 蒸馏水 号培养基为麸皮 玉 米淀 粉 玉 米 粉 玉 米 秸 秆 豆 油 蒸 馏 水 号培养基为麸皮 玉米粉 棉籽壳 玉米秸 秆 豆油 蒸馏水 试验方法 菌种活化 将菌种从 保藏室取出 恢复至室温 用接种 环分别挑取菌丝 接种于活化平板上 培养 保存待用 细胞悬液制备 将培养好的菌丝无菌过滤后 分别置于装有 无菌水的三角瓶 规格 瓶底有钢 珠 粒 中 摇床振荡 培养 破碎菌丝 用蒸馏水稀释 倍 制 成细胞悬液备用 脂肪酶活性筛选 参照李祖义等 的方法 并做适当改进 吸 取不同菌株的细胞悬液 分别涂布在脂肪酶筛选 培养基上 培养 比较不同菌株培养基 观察变色圈 每个菌株涂布 皿 重复 次 制霉素抗性筛选 吸 取 不 同 菌 株 的 细 胞 悬 液 分 别 涂 布 含 制霉素于抗性培养基上 培 养 比较不同菌株的生长情况 每个菌株涂布 皿 重复 次 种子制备 刮取斜 面 菌 丝 将 菌 丝 过 滤 后 置 于 装 有 无菌水的三角瓶 规格 瓶底有钢 珠 粒 中 摇床振荡 培养 固态发酵培养基种类和发酵时间的筛选 以 接种量 将种子液分别接种到 装 有 不 同 种 类 固 态 培 养 基 的 三 角 瓶 中 发酵培养 后 每隔 取样 次 测定样品中赤霉素的含量 每个菌株接种 瓶 重复 次 赤霉素含量测定 参照冯耀基等 的方法 并做适当改进 称 取烘干后的固体发酵料 于研钵中研碎 将粉 末置 于 烧 杯 中 加 入 甲 醇 溶 液 超声 布氏漏斗抽滤 滤渣按 上述操作重新提取 次 然后将所得的滤液合 并 旋转蒸发仪在 条件下减压浓缩至 液相条件 柱 流动相 为乙腈 水 流速为 柱 温为室温 以测得的 含量与固体发酵料的 比值作为固体发酵效价 并以此评价发酵效果 数据分析 采用 软件进行数据统计和作图 结果与分析 菌株脂肪酶活性分析 株菌株经活化及细胞悬液制备后 分别涂 布脂肪酶活性筛选平板 对菌株变色圈进行比较 分析 其 脂 肪 酶 活 性 由 表 可 知 编 号 和 的 株菌株具有较明显的水解带 表明其具有较 高的脂肪酶活性 且这 株菌株的菌落直径较 大 表明其生长速率较快 可作为出发菌株 菌株制霉素抗性分析 将上述 株菌株的细胞悬液分别涂布制霉 素 抗 性 平 板 对 其 进 行 分 析 发 现 编 号 和 的 株菌株在抗性培养基上形成的 菌落数较多 个 皿 且菌 落 直 径 较 大 北 方 园 艺 月 上 表明其具有较强的制霉素抗性 固态发酵培养基种类和发酵时间的筛选 以 和 为发酵生产菌株 进 表 菌株脂肪酶活性分析 菌株编号 水解带明显程度 菌落直径 注 表示菌落边缘水解圈十分明显 表示菌落边缘水解圈 明显 表示菌落边缘水解圈不明显 表 菌株制霉素抗性分析 菌株编号 菌落数 个 皿 菌落直径 普通培养基 抗性培养基 普通培养基 抗性培养基 注 表示菌株在培养基上未形成明显菌落 抗性培养基上的菌落 直径大于 的菌株视为制霉素抗性较强的菌株 行发酵试验 对培养基种类和发酵时间进行筛选 由图 可知 在 种培养基中 号培养 基 随着发酵时间的延长 这 株菌株的发酵效 价均呈现逐渐升高的趋势 当发酵时间达到 效价趋于稳定 升高不明显 在 号培养基中发酵 菌株 效价分别达到 和 较 和 明显要高 在 号培 养 基 中 发 酵 菌 株 效价较 号培养基有 所 降 低 分 别 为 和 在 号培养基中 发酵 菌株 效价 较 号培养基也有所降低 分别为 和 结果表明 菌株 具有较高发酵效价 且在 种不同 培养基中显示出较好的适应性 图 不同菌株在 号培养基中 不同发酵时间的发酵效价 图 不同菌株在 号培养基中 不同发酵时间的发酵效价 第 期 北 方 园 艺 图 不同菌株在 号培养基中 不同发酵时间的发酵效价 菌株遗传稳定性分析 将 分别进行传代 培养 传代 次 以 号培养基为发酵培养基 对 每代菌株的发酵效价进行分析 由图 可知 发酵 后 菌株 各 代的效价均在 无明显变化 结果表明 发酵效价具 有较好的遗传稳定性 图 菌株发酵效价遗传稳定性分析 图 菌株发酵效价遗传稳定性分析 讨论与结论 作为一种植物激素 具有多种十分重要 的生物学作用 在农业 林业 酿造 畜牧业等方面 应用广泛 目前 在国内主要依靠液体深 层发酵方式进行规模化生产 发酵效价长期处在 左右 导致生产成本一直偏高 严重阻碍 了 扩大生产和进一步的推广应用 菌株 的效价是发酵生产的保障 高产菌株的选育是提 高 生产效率的根本途径 学者们通过诱变手 段筛选效价提高的突变菌株 而科学合理的指标 是对这些菌株开展筛选的关键 生产的发 酵菌株主要包括藤仓赤霉菌 和串珠镰刀菌 其 中藤仓赤霉菌应用较为成熟 大量研究表明 脂 肪酶活性和制霉素抗性是 高产藤仓赤霉菌 菌株定向筛选的重要指标 为此 该研究 首先以脂肪酶活性 制霉素抗性作为指标 对引进 的 株产 藤仓赤霉菌菌株进行了比较筛 选 筛选出具有较高脂肪酶活性和制霉素抗性的 候选菌株 该选择筛选方法与王卫等 廖海兵 等 相一致 发酵方式及条件的优化是提高 生产效 率的有效方法 当前 液体发酵法存在诸多局限 比较而言 固态发酵法较液态法具有明显优势 是 未来 发酵生产的理想方式 但国内鲜见应用 生产的报道 为此 在完成菌株初筛的基础 上 该研究对初筛菌株适宜固态发酵培养基和发 酵时间进行了初步探索 发现 菌株在组分为麸皮 玉米淀粉 玉米粉 玉米芯 豆油 蒸馏水的培养基中 发酵 效 价分别达到 和 这与 等 的研究报道相当 之后 发 酵效价 增 长 并 不 明 显 这 与 刘 凤 莉 等 王 卫 等 的研究结果类似 比较而言 在组分为麸 皮 玉米淀粉 玉米粉 玉米秸秆 豆油 蒸馏水的 培养基和组分为麸皮 玉米粉 棉籽壳 玉米秸秆 豆 油 蒸 馏 水 的 培 养 基 中 菌 株 发 酵 效 价 均 有 所 降 低 但 是 这 种培养基中添加了玉米秸秆 棉籽壳等低价值 的农业生产残余物 对降低 发酵生产成本具 有重要意义 有关 菌 北 方 园 艺 月 上 株中试生产试验正在进行之中 菌株的优良特性 和生产效率在规模化生产中的实际表现还有待进 一步验证 参考文献 母洪娜 杨秀莲 王良桂 赤霉素在农林业生产中的应用研 究进展 江苏农业科学 彭辉 施天穹 聂志奎 等 微生物发酵产赤霉素的研究进展 化工进展 江澜 马有胜 邱昭辉 赤霉素的固态分批补料发酵与传统 的液态发酵比较试验 渝州大学学报 武文竹 陈俊英 白净 等 赤霉素高产菌株选育及其固态发 酵研究进展 河南农业科学 余卿 覃红 汪育同 等 赤霉素产生菌 菌株原生质体 的形成再生和紫外光对原生质体诱变条件的研究 微生物学 杂志 李武军 郑幼霞 赤霉素生产菌 藤仓赤霉菌融合重组的研 究 微生物学报 张金儿 朱江萍 刘义雄 等 从氯霉素抗性突变株筛选赤霉 素高产菌株 中国抗生素杂志 王卫 李忠海 黎继烈 等 以脂肪酶为指标筛选赤霉素高产 菌株的研究 工业微生物 李祖义 朱明华 冯青 等 胞外脂酶活力的检测法 微生 物学通报 冯耀基 黎少映 兰红军 等 高效液相色谱法测定蔬菜中的 赤霉素 和 微量元素与健 康 研 究 王卫 郭珺 曾柏全 等 利用制霉菌素抗性筛选赤霉素高产 菌株的研究 北方园艺 廖海兵 雷文 徐永华 利用制霉菌素抗性筛选赤霉素高产 菌株 农业科学 刘风莉 白净 李攀 等 赤霉素固态发酵培养基的研究 广东化工 王卫 黎继烈 黄卫文 等 利用特比萘芬抗性筛选赤霉素高 产菌株及相关发酵特性的研究 微生物学通报 第 期 北 方 园 艺