金针菇黑腐病病原菌的分离与分子鉴定.pdf

DOI 10 13629 j cnki 53 1054 2020 10 025 中国食用菌 2020 39 10 117 119 EDIBLE FU GI OF CHI A C 53 1054 ISS 1003 8310 金针菇黑腐病病原菌的分离与分子鉴定 兰玉菲 张焕利 于清伟 丛倩倩 泰安市农业科学研究院 山东 泰安 271000 摘要 为了明确山东省金针菇 Flammulina velutipes 工厂化厂房内发现的细菌性病害的种类 从感病子实体组 织分离获得病原菌菌株 通过提取其基因组总 D A 并分别扩增病原菌的 16S rD A 和 gyrB 基因 序列分析结果 表明该病原菌为托拉斯假单胞杆菌 Pseudomonas tolaasii 关键词 金针菇 黑腐病 托拉斯假单胞杆菌 中图分类号 646 9 文献标志码 A 文章编号 1003 8310 2020 10 0117 03 I I B k D Flammulina velutipes LAN Y HANG H YU Q w ONG Q q Tai an Academy of Agricultural Sciences Tai an 271000 C ina A In order to identify t e types of acterial diseases found in t e factory uilding of Flammulina velutipes in S andong province acterial strains were isolated from t e diseased fruiting ody T e total genomic D A of t e pat ogen was extracted and t e 16S rD A and gyrB genes of t e pat ogen were amplified Pat ogenicity test and sequence analysis s owed t at t e pat ogen was Pseudomonas tolaasii K w Flammulina velutipes lack rot disease Pseudomonas tolaasii 基金项目 2013年山东省食用菌创新团队病虫害防控与质量控制项目 SDAIT 07 04 2008 年国家现代农业 食用菌 产业体系建设专项 CARS 20 作者简介 兰玉菲 1980 女 博士 高级农艺师 主要从事食 药 用菌遗传多样性分析 新品种选育 驯化栽培 病虫害防控方面研究 E mail lanyufei526 163 com 收稿日期 2020 08 12 金针菇 Flammulina velutipes Fr Singer 是 一种在世界上广泛栽培的重要食用菌之一 营养丰 富 味道鲜美 深受人们喜爱 1 2 近几年 山东省工厂化金针菇发展迅速 主要 栽培种类为白色金针菇 随着栽培规模的不断扩大 和栽培年限的延长 病害发生越发严重 黑腐病是 金针菇工厂化生产中的主要病害之一 给工厂化金 针菇生产带了严重损失 为明确黑腐病病原菌 对 病原菌进行分离和分子鉴定 明确了病原菌的分类 地位 为科学防治提供理论依据 1 材料与方法 1 1 样品采集 供试样品采自济宁工厂化金针菇厂房内 1 2 培养基 A 培养基 蛋白胨 10 g L 1 牛肉膏 3 g L 1 aCl 5 g L 1 琼脂 20 g L 1 LB培养基 胰蛋白胨 10 g L 1 酵母提取物 5 g L 1 aCl 10 g L 1 1 3 病原菌分离和纯化 分别取菌盖和菌柄病健交界处组织进行病原菌 的分离 纯化 方法参照文献 3 1 4 致病性测定 将纯化的菌株在 A 平板上 28 培养 48 后 用无菌水配成细菌悬浮液 约 1 10 8 cfu mL 1 采 用喷雾法接种 分别将 2 mL 细菌悬浮液喷洒在正常 生长的金针菇菌盖和菌柄处 无菌水处理为对照 接种后的金针菇置于 15 菇房内 保持空气相对湿 病虫害防治 度 90 每天观察发病情况 从接种发病的金针菇 菌盖和菌柄上重新分离病原菌并鉴定 1 5 病原菌的分子鉴定 1 5 1 基因组D A 提取 将分离纯化的菌株在 A 培养基上划线 挑取 单菌落于LB培养基中 28 震荡培养过夜 收集菌 体 利用 Solar io 细菌基因组 D A 提取试剂盒提取 致病菌基因组D A 1 5 2 16S rD A 和 gyrB 序列的扩增 以D A 为模板 使用高保真酶 利用引物分别 扩增致病菌的 16S rD A 和 gyrB 序列 引物名称及 序列见表1 1 PCR反应体系 5 uffer 10 L d TP 2 5 mmol L 1 eac 4 L 上游引物 10 mol L 1 1 5 L 下游引物 10 mol L 1 1 5 L 酶 2 5 U L 1 0 5 L 模 板1 L ddH 2 O 补加至50 L 2 扩增16S rD A 基因的反应程序 94 预变性3 min 98 变性10 s 55 退火5 s 72 延伸 100 s 共进行 35个循环 最后 72 延 伸5 min 3 扩增gyrB 基因的反应程序 94 预变性3min 94 变性30s 55 退火30s 72 延伸 1 min 共进行 35个循环 最后 72 延 伸10 min PCR扩增结束后 电泳并切胶回收目的产物送 山东省农业科学院测序中心测序 1 5 3 序列比对及系统进化树构建 将所得D A 序列输入GenBank 进行Blast 检索 采用 D ASTAR D AMA 和 MEGA 6 等软件对所 得的核苷酸序列与GenBank 中收录分离物的相应序 列进行比较和分析 构建系统进化树 2 结果与分析 2 1 病害症状 工厂化金针菇自然发病症状见图1A 图 1B 致病性试验接种菌盖和菌柄后发病症状见图 1C 图 1D 表 1 引物名称及序列 Ta 1 Primer names and sequences 引物序列 5 3 CAGGAAACAGCTATGACCAYGS G G GG AARTTYRA AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 扩增序列 引物名称 UP1E 16S rD A 27F TACGGYTACCTTGTTACGACTT 1429R gyrB APrU TGTAAACGACGGCCAGTGC GGRT CYTTYTCYTGRCA 图 1 黑腐病对金针菇的为害症状 Fig 1 Symptom of Black rot disease caused y Pseudomonas tolaasii on Flammulina velutipes 如图 1A 图 1B所示 该病害一般从菌柄基部 瓶口周围 发病 初期呈黄褐色至黑褐色 并可延 菌柄往上侵染幼小菇蕾 导致其萎蔫死亡 亦可直 接侵染菌盖 呈现凹陷病斑 初期黄色 后期颜色 逐渐加深 最后萎焉死亡 2 2 致病性测定 分别从菌盖和菌柄分离获得20 个菌落形态一致 的单菌落进行致病性测定 其中16个菌落接种后 3天后菌盖和菌柄出现明显的黑褐色病斑和腐烂症 状 症状与工厂化金针菇自然发病症状相同 图 1C 和图 1D 而喷洒无菌水的对照子实体生长正常 说明分离的 16个单菌落均为金针菇黑腐病的致病 菌 其余 4个单菌落接种后未出现症状 通过初步 接种鉴定为非致病菌 2 3 病原菌的序列测定与分析 利用 Solar io 细菌基因组 D A 提取试剂盒提取 致病菌基因组 D A 以 D A 为模板 使用高保真 酶 利用表 1的引物分别扩增3个致病菌的 16S r D A 和 gyrB 基因 PCR 扩增结束后 电泳并切胶 回收目的产物送测序公司测序 分别得到长度约为 1 400 p 的 16S rD A 基因和 900 p 的 gyrB 基因 分别基于 ITS和 gyrB 基因序列构建的 J 系统发育 树见图 2和图3 从图 2和图 3可知 同源性比对结果表明分离 的 3个致病菌的 16S rD A 基因与 GenBank 中托拉 斯假单胞杆菌 Pseudomonas tolaasii 的分离物的同 源性最高 核苷酸一致率最高为 100 gyrB 基因与 GenBank 中 Pseudomonas tolaasii 分离物 AB039423 同源性最高 核苷酸一致率为 100 进一步基于 ITS和 gyrB 2个基因序列构建系统进化树 结果表 明 引起金针菇黑腐病的致病菌与 GenBank 中托拉 斯假单胞杆菌 Pseudomonas tolaasii 的分离物聚为 一簇 组内核苷酸一致率均高达 100 因此分子鉴 定病原菌为 P tolaasii 3 讨论 通过致病性试验筛选出引起金针菇黑腐病的病 原菌 进一步扩增病原菌的 ITS和 gyrB 2个基因并 构建系统进化树 结果表明引起金针菇黑腐病的病 原菌与 GenBank 中托拉斯假单胞杆菌 P tolaasii 的分离物聚为一簇 组内核苷酸一致率均高达 100 因此确定病原菌为 P tolaasii 前人研究结果 表明托拉斯假单胞杆菌 P tolaasii 可以危害平菇 Pleurotus ostreatus 金针菇 双孢菇 Agaricus bis porus 杏鲍菇 Pleurotus eryngi 香菇 Lentinula edodes 等多种食用菌并造成巨大的经济损失 4 6 本研究在国内外已有研究基础上 基于 ITS和 gyrB 2个基因对工厂化金针菇黑腐病病原进行了分子鉴 定 明确其病原为 P tolaasii 为该病害的防治和抗 病品种的选育研究奠定理论基础 参考文献 1 Smiderle FR Car onero ER Sassaki GL et al C aracteri a tion of a eterogalactan some nutritional values of t e edi le mus room Flammulina velutipes J Food C emistry 2008 108 1 329 333 2 Cai H Liu X C en Z Isolation purification and identification of nine c emical compounds from Flammulina velutipes fruit ing odies J Food C emistry 2013 141 3 2873 2879 3 方中达 植病研究方法 J 第 3版 北京 中国农业出版 社 1998 122 145 4 Lee HI C a JS Cloning of a D A fragment specific to Pseu domonas tolaasii causing acterial rown lotc disease of oyster mus room Pleurotus ostreatus J Korean Journal of Plant Pat ology 1998 14 177 183 5 Han HS J une CS C eong JC et al Occurrence of lack rot of cultivated mus rooms Flammulina velutipes caused y Pseudomonas tolaasii in Korea J European Journal of Plant Pat ology 2012 133 527 535 6 Tsuneda A Suyama K Murakami S et al Occurrence of Pseudomonas tolaasii on fruiting odies of Lentimula edodes formed uercus logs J Mycoscience 1995 36 283 288 图 2 基于 ITS基因序列构建的 J 系统发育树 Fig 2 P ylogenetic tree ased on ITS sequences and constructed using t e neig or joining met od 图 3 基于 gyrB 基因序列构建的 J 系统发育树 Fig 3 P ylogenetic tree ased on gyrB sequences and constructed using t e neig or joining met od 兰玉菲等 金针菇黑腐病病原菌的分离与分子鉴定