双孢蘑菇对高温胁迫的响应及耐热机理.pdf

Research paper 研究论文 22 June 2021 40 6 1400 1412 Mycosystema ISSN1672 6472 CN11 5180 Q DOI 10 13346 j mycosystema 200386 基金项目 上海市科技兴农项目 沪农科创字 2020 第 1 3 号 Supported by the Shanghai Science and Technology Agriculture Project 202001 3 Corresponding authors E mail hf zjj6688 huichen js Received 2020 12 09 accepted 2021 01 18 菌物学报 Copyright 2021 Institute of Microbiology CAS All rights reserved jwxt Http journals Tel 86 10 64807521 1400 双孢蘑菇对高温胁迫的响应及耐热机理 王倩 黄建春 卜乐男 郝海波 隽加香 肖婷婷 陈辉 张津京 上海市农业科学院食用菌研究所 上海市农业遗传育种重点开放实验室 农业部南方食用菌资源利用重点 实验室 国家食用菌工程技术研究中心 上海 201403 摘 要 本研究以双孢蘑菇 Agaricus bisporus 工厂化菌株 A15 和筛选得到的耐高温菌株 A15 TH 为研究对 象 比较了高温胁迫对两个菌株菌丝生长的影响 并从氧化损伤修复及基础碳代谢 糖酵解途径两个角度 探索双孢蘑菇对高温胁迫的响应及耐热机理 高温胁迫下 对照菌株 A15 的菌丝生长速度降低 菌丝分 叉增加 而耐高温菌株 A15 TH 菌丝生长速度高于 A15 菌丝形态优于对照菌株 表现出对高温具有一定 的耐受性 对两个菌株高温胁迫下氧化损伤及抗氧化酶系统进行研究发现 高温胁迫 30 90min 导致对 照菌株 A15 的三磷酸腺苷 ATP 含量下降 54 4 59 6 线粒体复合物 I II III 活性升高 超氧阴离子 O 2 含量增加了 34 9 71 3 此外高温胁迫降低了超氧化物歧化酶 SOD 的活性 影响了 O 2 的清 除效率 耐高温菌株在受到高温胁迫后的氧化损伤及氧化修复效果与对照菌株不同 一方面体现在正常 状态下维持较低的细胞能量代谢和较高的 ROS 合成量 另一方面抗氧化系统中 sod1 sod2 cat1 与对照 菌株相比有不同程度的上调 SOD 和过氧化氢酶 CAT 活性增强 可以更有效地清除过量的活性氧 减 轻高温对菌丝的氧化损伤 尤其在高温胁迫 120min 时 A15 的线粒体功能及抗氧化系统受到严重损伤 线粒体复合物 I II III 活性和 CAT 活性大幅度下降 但是 A15 TH 线粒体复合体 I III 活性分别增加至正 常状态下的 1 4 倍和 8 9 倍 CAT 活性比对照菌株高 128 维持了正常的线粒体功能及对活性氧的有效清 除 进一步研究发现高温胁迫下 双孢蘑菇菌丝的己糖激酶和丙酮酸激酶活性增加 糖酵解途径加快 耐高温菌株 A15 TH 在正常状态下和高温胁迫下 己糖激酶和丙酮酸激酶的活性均高于对照菌株 A15 具 有更活跃的碳代谢 关键词 双孢蘑菇 高温胁迫 线粒体 氧化损伤修复 糖酵解 引用本文 王倩 黄建春 卜乐男 郝海波 隽加香 肖婷婷 陈辉 张津京 2021 双孢蘑菇对高温胁迫的响应及耐热 机理 菌物学报 40 6 1400 1412 Wang Q Huang JC Bu LN Hao HB Juan JX Xiao TT Chen H Zhang JJ 2021 The response and thermotolerant mechanism of Agaricus bisporus under high temperature stress Mycosystema 40 6 1400 1412 研究论文 22 June 2021 40 6 1400 1412 Mycosystema ISSN1672 6472 CN11 5180 Q 菌物学报 1401 The response and thermotolerant mechanism of Agaricus bisporus under high temperature stress WANG Qian HUANG Jian Chun BU Le Nan HAO Hai Bo JUAN Jia Xiang XIAO Ting Ting CHEN Hui ZHANG Jin Jing Institute of Edible Fungi Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding Key Laboratory of Resources and Utilization of Edible Fungi South Ministry of Agriculture National Engineering Research Center of Edible Fungi Shanghai 201403 China Abstract Industrialized cultivated strain A15 assigned as experimental control and thermotolerant strain A15 TH screened from A15 were used to study the effects of high temperature stress on the growth of mycelia of Agaricus bisporus and the response to heat and thermotolerant mechanism were explored on the basis of oxidative damage repair and basic carbon metabolism glycolysis It was found that under high temperature stress the growth rate of mycelia of A15 decreased and hyphal bifurcation increased However the growth rate of mycelia of A15 TH was higher than that of A15 and the hyphal morphology was normal and superior to that of A15 manifesting A15 TH was tolerant to high temperature stress The oxidative damage and antioxidant enzyme system of the two strains were compared under high temperature stress The results showed that the ATP content reduced by 54 4 59 6 the activities of mitochondrial complex I II and III increased and the superoxide anion O 2 content increased by 34 9 71 3 under 30 90min heat stress for A15 In addition high temperature stress reduced the superoxide dismutase activity thus affected the clearance efficiency of O 2 of A15 A15 TH showed low energy metabolism and high O 2 synthesis under normal conditions and the expressions of sod1 sod2 and cat1 genes were up regulated as compared with the control strain A15 under high temperature stress Moreover the activities of superoxide dismutase and catalase enhanced which could remove excess O 2 more effectively and reduced the oxidative damage to mycelia Under 120min heat stress the mitochondrial function and antioxidant system of A15 were severely damaged and the activities of mitochondrial complex I II III and CAT decreased significantly On the contrary under such a heat stress A15 TH showed normal mitochondrial function and efficient removal of excess O 2 manifesting that mitochondrial complex I and III activities increased to 1 4 and 8 9 times respectively as compared with the normal state while CAT activity was 128 higher than that of A15 Under high temperature stress the activity of hexokinase and pyruvate kinase increased and the glycolytic pathway accelerated In comparison with A15 A15 TH showed higher activity of hexokinase and pyruvate kinase under both normal condition and high temperature stress indicating more active carbon metabolism Key words Agaricus bisporus high temperature stress mitochondria oxidative damage repair glycolysis 王倩 等 双孢蘑菇对高温胁迫的响应及耐热机理 Research paper 菌物学报 1402 线粒体是细胞中重要的能量代谢场所 为生物体正常生命活动提供必要的能量和中 间代谢产物 线粒体电子传递链不仅能产生能 量物质三磷酸腺苷 adenosine triphosphate ATP 还是细胞内活性氧 reactive oxygen species ROS 的重要来源 刘树森 2008 逆境胁迫会引起呼吸代谢的紊乱 Vanhoudt et al 2011 Tulah B Morphology of mycelia under fluorescence microscope 40 C Mycelial growth rate 2 2 高温胁迫下双孢蘑菇氧化损伤及抗氧化 系统响应 线粒体不仅是 ATP 合成的场所 同时也 是生成 ROS 的主要部位 在线粒体中 电子 传递链的复合物 I 和复合物 III 是 ROS 产生的 主要位点 Chen et al 2003 Nohl et al 2004 Navarro B Mitochondrial complex I activity C Mitochondrial complex II activity D Mitochondrial complex III activity E Superoxide anion content F Hydrogen peroxide content 对照菌株 A15 在高温胁迫 30 60 90min 时 ATP 的含量由正常状态的 0 13 mol g 鲜重 降低至 0 05 0 06 mol g 降低了 54 4 59 6 图 2A 线粒体复合物 I II III 活性呈增加 或者先降低再增加的趋势 图 2B 2D 在正常 的氧化还原循环中 A15 每克菌丝产生 6 9nmol 的超氧阴离子自由基 O 2 热激 30min 后 超氧阴离子含量迅速上升至 11 8nmol 随 着 王倩 等 双孢蘑菇对高温胁迫的响应及耐热机理 Research paper 菌物学报 1406 高温处理时间的延长 菌丝抗氧化系统启 动 O 2 含量逐渐降低 但仍未能恢复至正 常水平 图 2E 这说明热激后线粒体呼吸 链 ATP 合成和活性氧生成的平衡被打破 机 体产生应激反应 在高温胁迫 120min 时 对照菌株线粒体复合物 I II III 活性的降低 可能与高温胁迫导致线粒体功能障碍有关 耐高温菌株 A15 TH 在没有受到高温胁迫的 正常状态下 ATP 的含量仅为照菌株 10 左 右 超氧阴离子 O 2 的含量比对照菌株高 30 7 受到高温胁迫时 耐高温菌株 ATP 合成量增加 同时超氧阴离子含量并没有 在生物体内累积 在高温胁迫 30 60 90min 时 图 2B 2D 耐高温菌株线粒体复合物 I III 活性与对照菌株并没有显著差异 至 高温胁迫 120min 时 A15 TH 的线粒体复合 物 I III 活性并没有像对照菌株一样出现大 幅度降低 线粒体复合体 III 活性反而大幅 度增加 说明耐高温菌株的线粒体仍在进 行正常的应激响应 高温胁迫下 对照菌 株和耐高温菌株的过氧化氢 H 2 O 2 含量 都呈现先增加 30 90min 后降低 120min 的趋势 但并不显著 且同样的温度处理 时间下 耐高温菌株的 H 2 O 2 含量均高于出 发菌株 高温处理 120min 时呈显著差异 图 2F 为缓解超氧阴离子 O 2 和过氧化氢 H 2 O 2 积累造成的伤害 双孢蘑菇抗氧化系统启动 并发挥作用 在抗氧化过程中 超氧化物歧 化酶 SOD 和过氧化氢酶 CAT 是两种最 有效的抗氧化酶 Elstner 1982 Madasamy et al 2014 Chakravarthy et al 2016 Wang et al 2017c 超氧化物歧化酶 SOD 催化 O 2 变 成 H 2 O 2 和分子氧 过氧化氢酶 CAT 将 H 2 O 2 分解为氧气和水 从而减轻了超氧自由基和 过氧化氢对细胞的伤害 图 3A 表明 高温胁迫下 对照菌株 A15 图3 高温胁迫对双孢蘑菇超氧化物歧化酶活性及 超氧化物歧化酶基因相对表达量的影响 不同 小写字母表示差异显著性 P 0 05 A 超氧化物 歧化酶活性 B 超氧化物歧化酶基因 1 相对表达 量 C 超氧化物歧化酶基因 2 相对表达量 Fig 3 Effects of heat stress on the superoxide dismutase activity and on the relative expression of sod genes of Agaricus bisporus Different lowercase letters indicate a significant difference at P 0 05 A Superoxide dismutase activity B The sod1 gene relative expression ratio C The sod2 gene relative expression ratio 研究论文 22 June 2021 40 6 1400 1412 Mycosystema ISSN1672 6472 CN11 5180 Q 菌物学报 1407 的超氧化物歧化酶 SOD 的酶活性受到抑 制 酶活性降低了 28 3 33 6 而耐高温 菌株 A15 TH 在不同的热处理时间下 均能保 持较高的 SOD 活性 有利于 O 2 的去除 缓 解氧化损伤 进一步比较了超氧化物歧化酶 基因相对表达量 图 3B 3C 高温胁迫下 对照菌株 A15 和耐高温菌株 A15 TH 的 sod1 和 sod2 相对表达量随热处理时间的延长均 出现先下调后又上调的趋势 热胁迫对 sod1 基因相对表达量的影响 更为显著 热处理 30 90min 时 基因相对表达量下调了 51 57 热处理 120min 略有上调 热胁迫 90min 对 sod2 基因相对表达量影响最为显著 下调 了约 40 耐高温菌株 A15 TH 在正常状态下 及热胁迫时 sod1 和 sod2 的基因相对表达量 稍高于对照菌株 但差异不显著 图 4 比较了高温胁迫下 双孢蘑菇菌株 过氧化氢酶和 cat 基因相对表达量的变化 对照菌株的过氧化氢酶 CAT 活性随处理时 间的延长先上升 30 90min 后降低 120min 图4 高温胁迫对双孢蘑菇过氧化氢酶活性及过氧化氢酶基因相对表达量的影响 不同小写字母表示差 异显著性 P 0 05 A 过氧化氢酶活性 B 过氧化氢酶基因 1 相对表达量 C 过氧化氢酶基因 2 相 对表达量 D 过氧化氢酶基因 3 相对表达量 Fig 4 Effects of heat stress on the catalase activity and on the relative expression of catalase genes of Agaricus bisporus Different lowercase letters indicate a significant difference at P 0 05 A Catalase activity B The cat1 gene relative expression ratio C The cat2 gene relative expression ratio D The cat3 gene relative expression ratio 王倩 等 双孢蘑菇对高温胁迫的响应及耐热机理 Research paper 菌物学报 1408 图 4A 这可能是由于热处理 120min 对照 菌株造成了严重的损伤 导致后期 CAT 活性 的降低 不同热处理时间下 耐高温菌株 A15 TH 的 CAT 活性均高于对照菌株 尤其在 120min 的处理中 耐高温菌株的 CAT 活性比 对照菌株高 128 说明耐高温菌株的抗氧 化系统对活性氧有较强的 清除能力 高温胁 迫下 对照菌株和耐高温菌株的 3 个 cat 基 因相对表达量有不同的变化趋势 由图 4B 可知 高温胁迫 30min 时 对照菌株 cat1 相对表达量降低了 54 4 延长高温胁迫时 间 cat1 缓慢回升至没有经过热胁迫的正常 水平 耐高温菌株 A15 TH 在受到热胁迫 30min 后 cat1 相对表达量显著上调至未受 到胁迫状态下的 1 5 倍 在热胁迫作用 60min 和 90min 时维持在较高水平 至热胁迫作用 120min 时出现更大幅度的上调 较正常状态 下提高了 149 2 所有热胁迫处理中 耐高 温菌株的 cat1 相对表达量均高于对照菌株 cat2 和 cat3 相对表达量随热胁迫时间的延 长分别出现先下调再上调和先上调再下调 的趋势 对照菌株和耐高温菌株没有显著差 异 图 4C 4D 2 3 高温胁迫下双孢蘑菇糖酵解途径关键酶 活性变化 对高温胁迫下双孢蘑菇基础碳代谢 糖酵解途径中的关键酶进行了测定 受到高 温胁迫后 对照菌株 A15 己糖激酶 HK 和丙 酮酸激酶 PK 活性增加 热处理 90 120min 酶活性较正常状态分别增加约 120 和 130 结果显著 耐高温菌株 A15 TH 在正常状态下 己糖激酶和丙酮酸激酶 的活性显著高于对 照菌株 受到热胁迫后 酶活性也维持在高 水平 始终高于对照菌株 热胁迫 120min HK 和 PK 活性比对照菌株分别高 124 和 73 图 5 图5 高温胁迫对双孢蘑菇菌丝己糖激酶和丙酮酸 激酶活性的影响 不同小写字母表示差异显著 性 P 0 05 A 己糖激酶活性 B 丙酮酸激酶 活性 Fig 5 Effects of heat stress on the hexokinase and pyruvate kinase enzyme activities of Agaricus bisporus Different lowercase letters indicate a significant difference at P 0 05 A HK activity B PK activity 3 讨论 在本研究中 高温胁迫对双孢蘑菇菌丝 影响最直观的表现是菌丝生长速度降低 同 时菌丝形态发生改变 菌丝分叉增加 高温 胁迫对其他食用菌菌丝也有类似的影响 刘 秀明等 2015 2017 发现高温胁迫下白灵 侧耳和刺芹侧耳菌丝生长速度显著降低 因 此本研究通过比较高温胁迫下双孢蘑菇菌丝 生长速度筛选到了耐高温菌株 A15 TH 在此 研究论文 22 June 2021 40 6 1400 1412 Mycosystema ISSN1672 6472 CN11 5180 Q 菌物学报 1409 基础上 对双孢蘑菇菌丝在高温胁迫下的氧 化损伤及氧化应激机制进行了初步探索 生物体在正常情况下 线粒体的 ATP 合成 和 ROS 生成处于动态平衡 共同维持机体的 生长发育 ROS 的产生和清除发挥重要的生理 功能 而线粒体呼吸链产生的 O 2 和 H 2 O 2 是生 物体内最大数量 ROS 的恒定来源 刘树森 2008 在本研究中 对照菌株受到高温胁迫 30 90min 时 ATP 含量下降 54 4 59 6 线 粒体复合物 I II III 活性迅速升高 O 2 含量 增加至正常状态下的 1 35 1 71 倍 这些结 果表明高温胁迫下线粒体出现功能障碍 这 与高温对小鼠 Song et al 2016 鱼 Banh et al 2016 植物 Rikhvanov et al 2014 糙 皮侧耳 闫志宇 2020 等线粒体造成功能损 伤的相关研究结果一致 在没有受到热胁迫 的状态下 耐高温菌株 ATP 含量仅为对照组 的 10 O 2 的含量比对照菌株高 30 7 这 说明耐高温菌株的线粒体功能可能发生突 变 在正常状态下维持较低的细胞能量代谢 和较高的 ROS 合成量 在植物研究中发现 ROS 除了作为强氧化剂攻击植物体内的细胞 膜或蛋白分子造成氧化伤害之外 还可以作 为信号分子介导植物对各种外界刺激产生胁 迫响应 Miller et al 2008 在本研究中 正 常状态下耐高温菌株较高的 ROS 含量是否介 导了其他信号通路进行高温胁迫前的防御工 作还有待进一步研究 受到热胁迫后 耐高 温菌株 ATP 含量增加 这与对照菌株刚好相 反 进一步证明耐高温菌株线粒体 ATP 合成 和 ROS 生成的平衡机制与对照菌株不同 且 O 2 含量并没有在菌丝中积累而是维持在稳 定状态 表明耐高温菌株对 O 2 有更好的清除 能力 酶活分析表明 高温胁迫下 对照菌株 的抗氧化酶系统受到影响 表现在菌丝 CAT 活性增加 但 SOD 活性降低 这可能影响了 O 2 的去除效率 而耐高温菌株的 SOD 活性始 终维持在较高水平 与对照菌株有显著差异 此外 在热胁迫 120min 时 对照菌株的抗氧 化系统遭受严重破坏 CAT 活性下降 但是 耐高温菌株的 CAT 活性不仅没有降低 反而 出现大幅度增加 比对照菌株活性高 128 证明该菌株可以更有效地清除过量的活性 氧 减轻高温对菌丝的氧化损伤 对抗氧化 酶基因表达进行研究发现 对照菌株和耐高 温菌株 sod1 sod2 基因的相对表达量在热胁 迫下均出现了先下调再上调的趋势 sod1 对 高温处理更敏感 变化幅度更大 此外 耐 高温菌株的 sod 基因相对表达量高于对照菌 株 但是不显著 猜测两个 sod 基因的协同 表达对稳定耐高温菌株的酶活起到了一定的 作用 对照菌株和耐高温菌株的 3 个 cat 基 因相对表达量随高温胁迫时间的延长有不同 的变化趋势 其中耐高温菌株 cat1 相对表达 量显著高于对照菌株 与酶活结果最一致 说明 cat1 可能在高温胁迫中发挥了主要作用 cat2 和 cat3 分别出现了先下调再上调以及先 上调再下调两种截然不同的变化 且 A15 TH 和 A15 没有显著差异 这可能因为不同的同 工酶 CAT 在发育和胁迫中发挥的作用不同 这一点在植物 Du et al 2008 以及在糙皮侧 耳 Wang et al 2017a 过氧化氢酶基因特征 分析及功能研究中都有报道 己糖激酶和丙酮酸激酶是糖酵解途径的 关键酶和限速酶 高温胁迫下 双孢蘑菇菌 丝的己糖激酶和丙酮酸激酶活性增加 这说 明糖酵解途径加快 闫志宇 2020 研究发 现 糙皮侧耳高温胁迫下糖酵解途径和三羧 酸循环两大核心碳代谢途径加快 这与我们 的研究结果一致 他还提出加入海藻糖可以 下调糖酵解关键酶的基因表达 调控核心碳 代谢流提高糙皮侧耳的菌丝耐热性 而在我 们的研究中耐高温菌株在正常状态下和热胁 王倩 等 双孢蘑菇对高温胁迫的响应及耐热机理 Research paper 菌物学报 1410 迫下 己糖激酶和丙酮酸激酶的活性均高于 对照菌株 说明耐高温菌株具有更活跃的碳 代谢 生物体的代谢网络是十分复杂的 同 时生物体在进化过程中演化形成了多种响应 环境压力的策略 除了抗氧化系统的响应和 代谢途径的响应之外 还包括信号转导系统 响应 Shiraishi et al 2018 转录因子响应 Cortijo et al 2017 激素响应 Wang et al 2018 防御蛋白响应 Jacob et al 2017 Wang et al 2017b 细胞壁和细胞膜的响应 Kitichantaropas et al 2016 等 关于双孢 蘑菇菌株在高温胁迫下响应机制还需要从不 同的角度加以研究和探索 REFERENCES Banh S Wiens L Sotiri E Treberg JR 2016 Mitochondrial reactive oxygen species production by fish muscle mitochondria potential role in acute heat induced oxidative stress Comparative Biochemistry and Physiology Part B Biochemistry and Molecular Biology 191 99 107 Chakravarthy N Aravindan K Kalaimani N Alavandi SV Poornima M Santiago TC 2016 Intracellular copper zinc superoxide dismutase icCuZnSOD from Asian seabass Lates calcarifer molecular cloning characterization and gene expression with reference to Vibrio anguillarum infection Developmental and Comparative Immunology 36 751 755 Chen Q Vazquez EJ Moghaddas S Hoppel CL Lesnefsky EJ 2003 Production of reactive oxygen species by mitochondria central role of complex III Journal of Biological Chemistry 278 36027 36031 Cortijo S Charoensawan V Brestovitsky A Buning R Ravarani C Rhodes D Noort JV Jaeger KE Wigge PA 2017 Transcriptional regulation of the ambient temperature response by H2A Z nucleosomes and HSF1 transcription factors in Arabidopsis Molecular Plant 10 10 1258 1273 Du YY Wang PC Chen J Song CP 2008 Comprehensive functional analysis of the catalase gene family in Arabidopsis thaliana Journal of Integrative Plant Biology 50 10 1318 1326 Elstner EF 1982 Oxygen activation and oxygen toxicity Annual Review of Plant Physiology 33 1 73 96 Gill SS Tuteja N 2010 Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants Plant Physiology and Biochemistry 48 12 909 930 Hao HB Huang JC Wang Q Juan JX Xiao TT Song XX Chen H Zhang JJ 2021 Effects of heat stress on the differential expression of antioxidant enzymes and heat shock protein genes of Agaricus bisporus Mycosystema 40 2 1 9 in Chinese Jacob P Hirt H Bendahmane A 2017 The heat shock protein chaperone network and multiple stress resistance Plant Biotechnology Journal 15 4 405 414 Kitichantaropas Y Boonchird C Sugiyama M Kaneko Y Harashima S Auesukaree C 2016 Cellular mechanisms contributing to multiple stress tolerance in Saccharomyces cerevisiae strains with potential use in high temperature ethanol fermentation AMB Express 6 1 1 14 Liu SS 2008 Mitochodrial respiration chain and reaction oxygen species Chinese Bulletin Life Sciences 20 4 519 527 in Chinese Liu XM Wu XL Chen Q Qiu ZH Zhang JX Huang CY 2017 Effects of heat stress on Pleurotus eryngii mycelial growth and its resistance to Trichoderma asperellum Mycosystema 36 11 1566 1574 in Chinese Liu XM Wu XL Zhang JX Huang CY 2015 Heat stress response of cultivated Pleurotus eryngii var tuoliensis germplasms Mycosystema 34 4 640 646 in Chinese 研究论文 22 June 2021 40 6 1400 1412 Mycosystema ISSN1672 6472 CN11 5180 Q 菌物学报 1411 Madasamy T Pandiaraj M Balamurugan M Bhargava K Sethy NK Karunakaran C 2014 Copper zinc superoxide dismutase and nitrate reductase coimmobilized bienzymatic biosensor for the simultaneous determination of nitrite and nitrate Biosensors and Bioelectronics 52 209 215 Miller G Shulaev V Mittler R 2008 Reactive oxygen signaling and abiotic stress Physiologia Plantarum 133 3 481 489 Miller G Suzuki N Ciftci Yilmaz S Mittler R 2010 Reactive oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity stresses Plant Cell Environment 33 4 453 467 Navarro A Boveris A 2007 The mitochondrial energy transduction system and the aging process American Journal of Physiology Cell Physiology 292 2 C670 C686 Nohl H Gille L Staniek K 2004 The mystery of reactive oxygen species derived from cell respiration Acta Biochimica Polonica 51 1 223 229 Rikhvanov EG Fedoseeva IV Pyatrikas DV Borovskii GB Voinikov VK 2014 Role of mitochondria in the operation of calcium signaling system in heat stressed plants Russian Journal of Plant Physiology 61 2 141 153 Rodrig