马铃薯晚疫病生防细菌的筛选及鉴定.pdf

程 海 洋 魏 有 海 郭 良 芝 等 马 铃 薯 晚 疫 病 生 防 细 菌 的 筛 选 及 鉴 定 江 苏 农 业 科 学 马 铃 薯 晚 疫 病 生 防 细 菌 的 筛 选 及 鉴 定 程海洋 魏有海 郭良芝 程 亮 郭青云 青海大学农林科学院 青海西宁 青海省农业有害生物综合治理重点实验室 青海西宁 农业农村部西宁作物有害生物科学观测实验站 青海西宁 摘 要 为明确从矮火绒草根内分离获得的内生细菌对致马铃薯晚疫病病菌的抑制作用 采用稀释平板法分离矮火 绒草内生细菌 以对峙培养法和打孔法分别测试细菌菌株和发酵液滤液对晚疫病菌丝生长和孢子囊萌发的抑制作用 并对优势菌株进行分子生物学鉴定 结果表明 在分离的 株细菌中 有 株细菌对晚疫病病菌具明显拮抗作用 有 株抑菌率达 以上 其中 和 菌株对致病疫霉的抑菌率较高 分别为 发酵滤液 以 和 的抑菌率较高 分别为 的孢子囊抑制率最高 为 盆栽试验中 细 菌菌株发酵滤液处理能够导致晚疫病病情指数下降 其中 菌株防效最好 达到 低于化学药剂嘧菌酯 的防效 田间试验结果表明 与化学杀菌剂 相比 菌株对晚疫病的平均防效达到 经鉴定 菌株为荧光假单胞菌 该菌株在马铃薯晚疫病防治中有较大潜力 关 键 词 马铃薯晚疫病 致病疫霉 拮抗作用 鉴定 生物防治 内生细菌 中 图 分 类 号 文 献 标 志 码 文 章 编 号 收稿日期 基金项目 国家重点研发计划 编号 青海省农 业有害生物综合治理重点实验室项目 编号 青海省科技成果转化专项 编号 第 二次青藏高原综合科学考察研究项目 编号 作者简介 程海洋 男 河南洛阳人 硕士研究生 从事生物 防治等研究工作 通信作者 程 亮 硕士 研究员 从事生物防治研究工作 马铃薯 属茄科多年生草本植物 粮饲兼用 是 全球第四大重要的粮食作物 仅次于水稻 小麦和 玉米 马铃薯产业已成为我国保障粮食安全和社会 发展的重要支柱 马铃薯晚疫病是由致病疫霉 引起并导致马铃薯茎叶死亡 和块茎腐烂的一种毁灭性真菌病害 常导致马铃薯 严重减产甚至绝收 造成全球重大经济损失 目 前 使用化学杀菌剂是防治马铃薯晚疫病的有效方 法 但频繁使用杀菌剂对环境和人类健康均有 不利影响 易造成病原菌抗 耐 药性越来越强 同时加速了马铃薯晚疫病病菌群体遗传结构生理 分化和变异 青海省是马铃薯的重要产区之一 因此 筛选新的用于防治马铃薯晚疫病的药物 尤 其是具有抗菌作用的生防菌迫在眉睫 内生细菌 是指生活史某一阶段或 全部阶段生活于健康植物组织或器官的细胞间隙 或细胞内的一类细菌 内生细菌具有抑菌 诱导 产生次生代谢物 固氮 溶磷及产吲哚乙酸等多方 面的有益生物功能 增强宿主植物抗病虫害能力及 生长竞争能力等 由于内生细菌作为生防因子具 有巨大优势 因此利用内生细菌对植物病害进行生 物防治已成为研究的热点之一 许多学者通过筛 选拮抗菌或其代谢产物抑制致病疫霉 或利用一 些特定的活性物质抑制致病疫霉 如申芬等报 道拮抗菌发酵液能够显著抑制致病疫霉菌丝生长 能使菌丝体发生畸变 降低孢子囊形成的能力 抑 制孢子囊萌发 阻止休止孢萌发 王梅菊等从油 菜根茎部分离出来的 株枯草芽孢杆菌 可以有效地防治灰葡萄孢 立枯丝核菌 和 油菜黑胫病病菌 等引起的 病害 同时也可以促进寄主油菜的生长 王玉琴 等从高寒草地针茅叶部分离出的 株枯草芽孢杆菌 对马铃薯坏疽病病菌 马铃薯炭疽病病菌 和马铃薯枯萎病病菌 具有明显的拮抗作用 同时具有产吲 哚 乙酸 和溶磷等能力 崔月贞等从 东祁连山高寒草地牧草分离出的 株内生细菌 韦 江苏农业科学 年第 卷第 期 氏芽孢杆菌 解淀 粉芽孢杆菌 和枯草芽 孢杆菌 对马铃薯晚疫病的抑菌 率分别为 且 和 具有固氮和产 的生物学功能 本研究从采集自祁连高寒草地矮火绒草根部 样品中分离筛选对马铃薯晚疫病有抑制效果的内 生细菌菌株 并对其进行 序列鉴定 以期 为生防菌剂的研发提供菌株资源 也为植物内生细 菌防治马铃薯晚疫病的生物防治开发应用等提供 理论依据 材 料 与 方 法 试验材料 病原菌 致病疫霉 菌株 由笔 者所在实验室保存 培养基 大豆酪蛋白琼脂 培养基 胰 蛋白胨 大豆蛋白胨 氯化钠 蒸 馏水 琼脂 值为 理 查德合成琼脂 培养基 黑麦 催芽露白后 使用 番茄汁 琼脂 蒸馏 水 液体培养基 胰蛋白胨 酵母提取物 蒸馏水 值为 固体培养基 胰蛋白胨 酵母提取物 琼脂 蒸馏 水 值为 内生细菌分离纯化 按胥婷等的方法 分离矮火绒草根内生细菌 用无菌水洗净矮火绒草根部泥土后 滤纸吸干表面 水分 称取 根 于无菌室内 用 乙醇 次氯酸钠 乙醇 依 次对根表面进行消毒 最后用无菌水洗涤 次 吸取 最后 次洗涤的无菌水 涂布 培养基平 板 培养 无菌落长出说明表面消毒合格 表面消毒后 用无菌滤纸吸干根部表面的水分 再 用无菌剪刀剪碎后置于无菌研钵中 加入少量灭菌 的石英砂和 无菌水充分研磨 得到 的菌 悬液 梯度稀释分别得到 浓度的 菌悬液 各取 菌悬液涂布于 培养基平 板上 培养 每个梯度做 次重复 培养 根据菌落形态 颜色 透明度等特征挑取不同的 细菌菌落分离纯化 纯化 代后 得到单菌落进 行转管并室温保存 生防内生细菌筛选 平板拮抗活性测定 将分离获得的细菌菌 株接种到 固态培养基上 活化培养基 后 采用对峙培养法筛选拮抗细菌 将细菌菌株转 接到 培养基与经 培养基活化的致病疫霉对 峙培养 观察菌株是否对致病疫霉菌丝生长有抑制 效果 以十字交叉法测量抑菌带 并计算抑菌率 以未接细菌菌株的 培养基为对照 选择具有明 显抑菌带的菌株 转接到 培养基上培养 保存 备用 抑菌率 对照菌落直径 处菌菌落直径 对照菌落直径 内生细菌发酵滤液的抑菌活性测定 内生 细菌发酵滤液的制备 将离体对致病疫霉的抑菌率 大于 的菌株经 固体培养基斜面活化后 接 环于盛 液体培养基的 三角瓶中 振荡培养 制成种子液 再按 的接种量 转接至 液体培养基的 三角瓶中 扩大培养 得到菌液原液 将上述培养得 到的菌液经 离心 并经细菌过 滤器 除菌后得到发酵滤液 内生细菌发酵滤液对致病疫霉菌丝生长的影 响 采用打孔法测试菌株无菌代谢液的抑菌作用 取 的发酵滤液加入孔中 直径为 以 灭菌的空白 液体培养基为对照 每个处理 次 重复 抑菌率统计方法同 节 内生细菌发酵滤液对致病疫霉孢子囊萌发的 抑制作用 参照张铉哲等的方法 将马铃薯晚疫 病病菌制成孢子囊悬浮液 浓度调至在 倍显 微镜下每个视野 个孢子囊 将孢子囊悬浮 液与发酵滤液按 的体积比混匀 每个处理吸取 液体滴于干净凹玻片上 于 培养 观察孢子囊萌发情况 芽管长于孢子囊直径视为萌 发 每个处理 次重复 每个重复以视野中所见到 的孢子囊数为准 统计萌发抑制率 温室盆栽防效测定 试验于 年在青海省农林科学院植物保护 所温室中进行 马铃薯下寨 品种放在阴暗潮湿 处催芽 将芽眼带薯块切下 每盆 块 每个处理种 植 盆马铃薯植株 待其长至 片叶时 分别 喷施内生细菌发酵滤液和嘧菌酯 以清水为对照 每株马铃薯植株喷施 后进行晚疫 病病原菌接种 接种方法参照徐生军等的方法 江苏农业科学 年第 卷第 期 用无菌水将晚疫病病菌培养平板上的游动孢子囊 洗下 经灭菌纱布过滤后制成孢子囊悬浮液 用血 球计数板将孢子囊数调为 个 置于 冰箱中 后取出 采用喷雾法接种 接种后 调查病害情况 计算病情指数和防治效果 盆 栽试验以叶片为单位进行调查 病情分级标准按方 中达的方法 级 叶片无病斑 级 病斑面积 占整个叶片面积的比例 级 病斑面积占整 个叶片面积的 级 病斑面积占整个叶 片面积的 级 病斑面积占整个叶片面 积的 级 病斑面积占整个叶片面积的 比例 病情指数 各级病叶数 相对级数值 调查总叶数 最高级数值 田间晚疫病防效测定 年田间试验设置在青海省农林科学院马 铃薯试验田 采用液体发酵法制备内生菌株发酵 液 过滤获得发酵滤液 试验小区面积为 共 设置 个处理 处理 分别为 发酵滤液 处理 为 嘧菌酯悬浮剂 处 理 为清水对照 每个处理重复 次 随机区组排 列 田间出现中心病株时进行病情指数的基数调 查并施药 之后每隔 施药 次 共施药 次 每 次施药前进行病情指数的调查 并于施药后 再 次进行调查 每个小区分别进行 点取样 每点选 株 计算病情指数及发病率 统计分析确定防治 效果 田间试验以整株为单位进行调查 病情分级 参照方树民等的方法 级 叶片无任何症状 级 叶片上有个别病斑 级 以下叶片有病斑 级 叶片上有病斑 级 以上叶片上 有病斑 级 几乎整株枯死 病情指数 病情级别 各级病株数 调查总株数 最高级数值 防治效果 式中 表示对照组的药前病情指数 表示对 照组的药后病情指数 表示药剂处理组的药前 病情指数 表示药剂处理组的药后病情指数 采用 软件 应用 新复极差法 对 试验数据进行差异显著性分析 菌株 鉴定 本试验采用分子生物学鉴定菌株 使用 生工生物工程 上海 股份有限公司的 柱式试剂 盒提取内生细菌基因组 方法参照试剂盒说明书 利 用 对通用引物 和 进行 扩增 引物 由生工生物工程 上海 股份有限公司合成 序列如 下 反应体系 模板 上 下引物各 双蒸水 扩增条件 预变性 进行 个循环 延伸 保存 扩增片段用 生工生物工程 上海 股份有限公司的 产物回 收试剂盒纯化后 与 载体 连接过 夜 转化至大肠杆菌感受态细胞 阳性克隆经菌落 验证正确后 提取质粒 由生工生物工程 上 海 股份有限公司完成碱基序列测定 将测序获得 的 通过与 中核酸数据库进行 分析并利用 软件构建系统发育树 确 定 的分类地位 结 果 与 分 析 矮火绒草根内生细菌的分离结果及其抑制 作用 采集矮火绒草根组织 采用平板稀释法 共分 离获得 株内生细菌 编号分别为 大部分菌株在 培养基上迅速生长 大多菌落表 现为湿润状 乳白色 不规则 扁平 光滑 少数菌落 边缘褶皱 微黄色 将分离获得的 株内生细菌分 别于经 活化培养的致病疫霉菌株在 平板 上对峙培养 由表 可知 能够抑制致病疫霉生长 的菌株共有 株 其中 抑菌率达到 以上的 有 株 菌株 以 菌株的抑制作用最强 抑菌率达到 在表现抑菌作用较强的菌株中 和 菌株与致病疫霉之间形成的抑菌带不明显 而 抑菌率为 和 抑菌率为 菌株形成的抑菌带十分明显 内生细菌发酵滤液的抑菌活性测定 内生细菌发酵滤液对致病疫霉菌丝生长的 影响 将抑菌率达到 以上的 个菌株分别扩 大培养后离心过滤得到其发酵滤液 由图 可知 供试 个菌株的发酵滤液对致病疫霉菌丝的抑制率 均在 以上 较菌株对峙培养抑菌率有所下降 分别为 江苏农业科学 年第 卷第 期 表 内 生 细 菌 菌 株 对 致 病 疫 霉 的 抑 制 作 用 供试菌株 抑菌率 供试菌株 抑菌率 注 不同小写字母表示在 水平上差异显著 下表同 其中 菌株降幅最大 为 百分 点 其次为 菌株 降幅为 百分点 其他 菌株对峙与发酵滤液之间幅差在 以内 相对较 稳定 综合评价 菌株的抑菌率最高 其次是 菌株 菌 株的抑菌率最低 为 经对峙平板观察发现 受 个菌株发酵滤液抑 制的致病疫霉菌落变小 菌丝致密 生长速率降低 显微镜检发现 发酵滤液导致致病疫霉菌丝畸变 菌丝无法正常伸展 菌丝尖端呈现球形的畸变 内生细菌发酵滤液对致病疫霉孢子囊萌发 的抑制作用 将 株内生细菌发酵滤液和致病疫霉 的孢子囊悬浮液混合后发现 无菌发酵滤液均可强 烈抑制致病疫霉孢子囊的萌发 抑制率达到 图 显微镜检发现 发酵滤液 引起致病疫霉孢子囊形态发生畸变 多为外壁破 裂 中空结构 内含物分隔于两极 空孢子囊类型 温室盆栽防效测定 由表 可知 致病疫霉游动孢子接种 后 清 水对照组病情指数达到 而生防菌 处理组马铃薯 晚疫病病情指数显著降低 防治效果分别达到了 阳性对照嘧菌酯的病情指数仅为 防治效果达到 各处理组的病情指数与对 照相比达到显著性差异 嘧菌酯处理与各个内生菌 处理组的防效达到显著性差异 显著高于内生菌株 处理组 表 内 生 细 菌 对 马 铃 薯 晚 疫 病 的 盆 栽 防 效 处理 病情指数 防效 嘧菌酯 田间防效测定 由表 可知 连续喷施 次生防菌剂 处理 化学药剂 对马铃薯晚疫病的防治效果最好 平均 防效可达 其次为处理 菌株 平 均防效达 防效最差的为处理 菌 株 平均防效仅为 内生菌株的鉴定 用引物 进行 扩增 扩增获得约 的片段 将所得序列与 数据库中 其他细菌 基因序列进行比对 分析其分 类地位 发现该菌的 与假单胞菌序列有 很高的同源性 构建 序列系统发育树 发现 菌株与荧光假单胞菌 聚在一个群组里 图 初步确定 为荧光假单胞菌 结 论 与 讨 论 植物内生细菌分布于宿主植物的不同部位 由 于其生存环境相对封闭 因此其生长发育不易受外 界不良环境的干扰 这一生境优势使其在植物病害 防治中拥有比根围 叶围细菌更大的应用空间 利用内生细菌及其代谢产物抑制植物病害已有许 多研究 目前用于防治植物病害的内生细菌种类主 江苏农业科学 年第 卷第 期 表 不 同 药 剂 处 理 对 马 铃 薯 晚 疫 病 的 防 治 效 果 处理 编号 药前 病情指数 第 次施药后 第 次施药后 第 次施药后 病情指数 防治效果 病情指数 防治效果 病情指数 防治效果 平均防效 要以芽孢杆菌属和假单胞杆菌属为主 有文献 报道 荧光假单胞杆菌的一些菌株已在食品 和环 境保护 等领域展现出很大潜力 在马铃薯晚疫病 防治方面 等研究发现 株荧光假单胞杆 菌 产生的表面活性剂既能使马 铃薯致病疫霉的游动孢子裂解 也能诱导马铃薯对 致病疫霉产生抗性 等对荧光假单胞杆 菌 菌株对致病疫霉具有强烈 的抑制作用 抑制率可达 以上 本试验从 矮火绒草根中分离筛选致病疫霉拮抗细菌 株细 菌中有 株有一定的抑菌作用 其中活体菌株 和 的抑菌率最高 分别为 而无菌代谢液以 和 菌株的抑 菌率最高 分别为 综合菌株和 无菌代谢液的抑菌率 以 菌株的抑菌作用最 为稳定 抑菌率均在 以上 经初步鉴定 对致 病疫霉抑制能力较强的菌株 为荧光假单胞 杆菌 这与蒋继志等报道的结果 相一致 目前 很多在平板上对致病疫霉有拮抗作用的 菌株 当用于盆栽或田间防治时 防治效果减弱或 无防治效果 等施用假单胞菌 和 的菌悬液 对马铃 薯晚疫病的防治效果分别为 李双 东等施用枯草芽孢杆菌 的菌悬液和无菌体 发酵液 对马铃薯晚疫病的防治效果分别为 胡军华等将假单胞菌 的发酵液先喷于马铃薯叶片上再接种马铃薯晚疫 病菌 马铃薯苗不发病或发病很轻 在本研究盆栽 江苏农业科学 年第 卷第 期 试验中 个菌株处理与对照相比 马铃薯晚疫病病 情指数均有不同程度的下降 说明 个菌株对马铃 薯晚疫病有很好的抑菌活性 其中以菌株 的 防效最高 为 略低于化学农药嘧菌酯的防 效 田间试验中 菌株 的平均 防效为 嘧菌酯的平均防效为 说 明该菌株在马铃薯晚疫病的生物防治中具有应用 潜力 综上 喷施内生细菌有助于马铃薯抵抗晚疫病 病菌的侵染 提高马铃薯的抗病能力 在田间试验 中也具有良好的防治效果 未来可通过内生细菌与 化学杀菌剂联合使用 以减少晚疫病病菌的侵染 达到防病增收的效果 关于内生细菌在大田生产 中的应用 仍需大量试验 其作用机制也需更深入 的研究 参 考 文 献 谢从华 马铃薯产业的现状与发展 华中农业大学学报 社 会科学版 田荟遥 蒋继志 侯 宁 等 马铃薯致病疫霉生理小种鉴别寄主 的组培条件优化及部分生理小种的鉴定 河北农业大学学 报 李成斌 张红霞 李 岩 等 年北方 省 区 致病 疫霉抗药性监测及与嘧菌酯交互抗性 河北农业大学学报 方珍娟 张晓霞 马立安 植物内生菌研究进展 长江大学学 报 自然版 申 芬 蒋继志 侯 宁 等 种拮抗菌复合发酵对致病疫霉 的抑制及离体防病作用研究 河北农业大学学报 王梅菊 刘 晨 吴明德 等 油菜内生细菌多样性分析及菌株 生防潜力评估 中国油料作物学报 王玉琴 杨成德 王 颖 等 针茅内生细菌菌株 的鉴 定及其生物学功能 微生物学通报 崔月贞 杨小利 杨成德 等 拮抗马铃薯晚疫病菌的高寒草地 牧草内生细菌的鉴定及其生物功能测定 植物保护学报 胥 婷 杨丽强 宋 宇 等 不同草原类型针茅根部可培养内 生细菌群落结构及其功能 生态学杂志 张铉哲 李媛媛 李 璐 等 抗病诱导剂与杀菌剂混合处理对 马铃薯晚疫病的防治效果 中国蔬菜 徐生军 姚亮亮 李新新 等 黑龙江省和吉林省马铃薯晚疫病 菌对氟啶胺和甲霜灵的敏感性变化 植物保护 方中达 植病研究方法 版 北京 中国农业出版 社 方树民 翁定河 徐大东 等 马铃薯品种对晚疫病的抗性评价 福建农业科技 蒋继志 郭俊亭 李丽艳 致病疫霉拮抗真菌研究进展 河 北大学学报 自然科学版 王 侨 秦正山 袁 涛 等 两种假单胞杆菌协同发酵产脂肪 酶优化和酶性质研究 酿酒科技 魏荷芬 韩保安 王田野 等 一株荧光假单胞杆菌的分离鉴定 与反硝化特性 微生物学通报 蒋继志 梁延银 王怀远 等 致病疫霉拮抗荧光假单胞杆菌的 筛选及离体防病作用 河北农业大学学报 李双东 曹克强 枯草芽孢杆菌 对马铃薯晚疫病菌的 抑菌作用及防病效果 安徽农业科学 胡军华 周泽杨 蓝希钳 等 假单胞菌 菌株对致病疫霉 的作用 西南农业学报 江苏农业科学 年第 卷第 期