MEAM1和MED两个烟粉虱隐种取食对甘蓝转录组影响的差异.pdf

植物保护学报JournalofPlantProtection 2021 48 6 1380 1386 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2021 2021894 基金项目国家自然科学基金 31371941 31572012 通信作者 Authorsforcorrespondence E mail jiaoxg zhangyoujun 收稿日期 2021 09 22 MEAM1 和MED 两个烟粉虱隐种取食对甘蓝转录组影响的差异胡杰 1 卢靖天 1 付培艺 1 彭宇 1 焦晓国 1 张友军 2 1 湖北大学生命科学学院生物催化与酶工程国家重点实验室武汉430062 2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所北京100081 摘要为绿色防控烟粉虱Bemisia tabaci 提供新策略采用转录组分析MEAM1 和MED 两个烟粉虱隐种取食后甘蓝差异基因表达情况并选取差异表达基因最多的甘蓝苯丙烷类通路上PAL2 C4H 4CL1 和CHI 四个基因进行实时荧光定量PCR 测定结果显示与对照相比 MEAM1 和MED 烟粉虱隐种取食后甘蓝差异表达基因数分别为693 个和1 030 个 GO 功能注释和KEGG 富集分析显示差异表达基因主要集中在苯丙烷类生物合成萜类挥发物合成芥子油苷合成类黄酮生物合成和植物激素信号传导途径等与甘蓝抗虫物质合成相关的通路上虽然MEAM1 与MED 两个烟粉虱隐种均能显著激活植物激素信号传导途径和苯丙烷类合成通路调控的酚类物质合成途径但 MED 烟粉虱隐种与甘蓝互作的差异表达基因数高于MEAM1 烟粉虱隐种 MEAM1 烟粉虱隐种取食甘蓝12h 后甘蓝苯丙烷通路上游PAL2 C4H 和4CL1 三个基因均显著上调而MED 烟粉虱隐种取食后甘蓝苯丙烷通路上PAL2 C4H 4CL1 和CHI 四个基因均变化不显著这4 个差异基因的表达模式与测序结果一致表明测序结果的可信度高关键词烟粉虱转录组分析基因苯丙烷合成通路芥子油苷实时荧光定量PCR DifferencesinthetranscriptomesofBrassicaoleracealeavesinfestedbyMEAM1 andMEDcrypticspeciesoftobaccowhiteflyBemisiatabaci Hu Jie 1 Lu Jingtian 1 Fu Peiyi 1 Peng Yu 1 Jiao Xiaoguo 1 Zhang Youjun 2 1 StateKeyLaboratoryofBiocatalysisandEnzymeEngineering SchoolofLifeSciences HubeiUniversity Wuhan430062 HubeiProvince China 2 InstituteofVegetablesandFlowers ChineseAcademyofAgriculturalSciences Beijing100081 China Abstract In order to provide a novel strategy for green control of tobacco whitefly Bemisia tabaci transcriptome analysis was used to analyze the differentially expressed genes DEGs of cabbage after being infested by MEAM1 and MED cryptic species of B tabaci Four genes PAL2 C4H 4CL1 and CHIinvolvedinthephenylpropanoidbiosynthesispathwaywiththemostDEGswereselectedforquan titative real time PCR qRT PCR to verify the reliability of cabbage transcriptome data The results showed that compared with the control the numbers of DEGs in cabbages after being infested by MEAM1 and MED were 693 and 1 030 respectively GO functional annotation and KEGG enrich ment analysis showed that the DEGs were mainly concentrated in the pathways related to the synthesis of insect resistant substances in cabbage such as phenylpropanoid biosynthesis terpenoid biosynthesis glucosinolate biosynthesis flavonoid biosynthesis and plant hormone signal transduction pathway Al 6 期胡杰等 MEAM1 和MED 两个烟粉虱隐种取食对甘蓝转录组影响的差异 1381 though the plant hormone signal transduction pathway and phenylpropanoid biosynthesis pathway were significantly activated in both MEAM1 and MED the number of DEGs in cabbage infested by MED was higher than that by MEAM1 After cabbage being infested by MEAM1 for 12 h the three genes PAL2 C4H and 4CL1 upstream of the phenylpropanoid biosynthesis pathway in cabbage were signifi cantly up regulated while PAL2 C4H 4CL1 and CHI in cabbage infested by MED did not change sig nificantly TheexpressionpatternsofthesefourDEGsanalyzedbyqRT PCRwereconsistentwiththose bytranscriptomesequencing indicatingthatthetranscriptomedatawerehighlyreliable Key words Bemisia tabaci transcriptome analysis gene phenylpropanoid biosynthesis pathway glu cosinolates quantitativereal timePCR 在与植食性昆虫长期协同进化过程中植物形成了一套有效的防御机制植物抗虫防御机制通常受植物激素信号传导介导 Stahletal 2018 目前已知与植物防御机制有关的信号传导途径主要有茉莉酸 jasmonic acid JA 水杨酸 salicylic acid SA 和乙烯这3 种这些信号转导途径的末端产物作为信号分子激活植物相关防御基因的表达致使下游次生抗虫物质累积和挥发物释放从而使植物表现出对害虫的抗性 Smith et al 2009 Heil Karban 2010 通常认为刺吸式口器害虫侵染诱导寄主植物激活SA 防御途径而咀嚼式口器害虫诱导JA 防御途径二者通常表现为拮抗关系 Wu Baldwin 2010 甘蓝是一类重要的十字花科作物其具有多种抗虫机制除具有十字花科作物特有的抗虫防御体系芥子油苷黑芥子酶系统外张凯鑫等 2017 苯丙烷通路调控合成的酚类物质也是十字花科作物一类重要的次生抗虫物质 War et al 2012 Yang et al 2020 烟粉虱Bemisia tabaci 隶属半翅目粉虱科其寄主十分广泛通过直接取食和传播病毒等方式为害大部分蔬菜和园艺作物 Wang et al 2017 烟粉虱是一个隐存种复合群包括30 多个隐种其中 MEAM1 Middle East Asia Minor 1 和MED Medi terranean 是影响最大的2 个外来入侵烟粉虱隐种 Pan et al 2011 越来越多研究表明烟粉虱能利用JA 与SA 通路的拮抗关系即通过激活SA 通路来抑制承担主要防御任务的JA 通路进而实现对植物防御的操控 Zarate et al 2006 Xu et al 2019 Zhang et al 2019 该机制一定程度上解释了 MEAM1 和MED 烟粉虱隐种在全球的发生和扩散在我国大部分地区 MEAM1 烟粉虱隐种逐渐被 MED 烟粉虱隐种取代取代的原因主要归于MED 烟粉虱隐种对常用杀虫剂的抗性比MEAM1 烟粉虱隐种的高此外 MED 烟粉虱隐种对寄主植物的适应性强于MEAM1 烟粉虱隐种 Yang et al 2020 目前甘蓝是少有的适宜于MEAM1 烟粉虱隐种生长发育而不利于MED 烟粉虱隐种的寄主植物 El baz et al 2012 Cui et al 2017 阐明甘蓝对 MEAM1 和MED 烟粉虱隐种的抗性差异及其机制对烟粉虱的防控具有重要意义近年来转录组技术被广泛用于与植物抗虫相关基因的挖掘和功能验证黄欣蒸等 2020 本研究拟采用转录组测序技术分析MEAM1 和 MED 两个烟粉虱隐种取食后甘蓝差异基因表达并选取差异表达基因最多的甘蓝苯丙烷通路上PAL2 C4H 4CL1 和CHI 四个基因进行实时荧光定量PCR quantification real time PCR qRT PCR 测定以验证转录组数据结果的准确性以期为绿色防控烟粉虱提供新策略 1 材料与方法 1 1 材料供试昆虫和植物 MEAM1 烟粉虱隐种由湖北省农业科学院植保土肥研究所提供 MED 烟粉虱隐种由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供这2 个烟粉虱隐种分别装入养虫笼内置于自然光照温度 25 1 和相对湿度50 70 的温室中饲养用营养生长期的棉花饲喂饲养3 代后用于分子标记鉴定甘蓝品种为京丰1 号种子购于中国农业科学院蔬菜花卉研究所将种子播于直径 15 cm 营养钵中将其置于温室内温室控制条件同上待甘蓝苗长到6 8 叶期后供试棉花品种为中棉所49 由中国农业科学院棉花研究所提供试剂和仪器 Trizol 试剂赛默飞世尔科技中国有限公司 cDNA 合成试剂盒翌圣生物科技上海有限公司其他试剂均为国产分析纯 Nano Drop2000 微量分光光度计赛默飞世尔科技中国有限公司 JXFSTPRP 24 全自动样品快速研磨仪 1382 植物保护学报 48 卷上海净信实业发展有限公司 DYY 6C 型电泳仪北京市六一仪器厂 MonadQuickGel6200 凝胶成像系统莫纳生物科技有限公司 CFXConnect 荧光定量 PCR 仪美国Bio Rad 公司 IlluminaHiSeq TM 4000 高通量测序平台北京百迈客生物科技有限公司微虫笼外周直径3 2cm 高1 5cm 的竹夹式圆柱形塑料笼两底面粘孔径为0 075 mm 的纱网自制长 35 cm 宽35cm 高35cm 纱网孔径为0 125mm 的养虫笼自制 1 2 方法 1 2 1 烟粉虱取食试验及样品采集为保证试验材料的一致性和结果的准确性选取长势一致叶片总面积大致相等的6 8 叶期甘蓝苗进行试验为了防止烟粉虱在叶片间迁飞在每株甘蓝中下部叶片上夹上1 个微虫笼用自制吸虫器随机吸取MEAM1 和MED 烟粉虱隐种成虫各50 头雌雄性比为1 1 置于微虫笼内在室内自然条件下任其自由取食以笼中无烟粉虱为对照每个处理重复4 次每个重复1 株甘蓝接种烟粉虱为害1 d 后取每株甘蓝中下部未接虫的单片叶用于RNA 提取 1 2 2 烟粉虱取食后甘蓝叶片RNA 提取和测序将不同处理的甘蓝叶片迅速置于液氮中利用研磨仪粉碎研磨按照Trizol 试剂说明书提取样品 RNA 使用微量分光光度计和1 琼脂糖凝胶电泳进行RNA 纯度浓度和完整度检测取1 9 OD 260nm OD 280nm 2 0 完整度较好的RNA 样品委托北京百迈客生物科技有限公司进行转录组测定利用Illu minaHiSeq TM 4000 高通量测序平台对测序获得的原始数据进行质量控制即去除原始数据中含有接头的和低质量的reads 得到cleandata 经过测序质量控制各样品Q 30 碱基百分比均不低于90 表示测序质量良好能够满足建库要求可用于后续试验分析 1 2 3 烟粉虱取食后甘蓝叶片的转录组差异分析将cleandata 与甘蓝参考基因组 ftp ftp ensem blgenomes org pub plants release 45 fasta brassica ol eracea dna 进行序列比对获得mapped data 对不同处理样品的表达量进行差异表达分析将倍数变化 fold change FC 2 且阈值错误发现率 false discovery rate FDR 0 01 作为筛选差异基因的标准筛选到的差异基因进行GO 功能注释和KEGG 通路富集分析 GO 功能注释是基于GO 数据库进行的标准生物学注释过程包括生物学过程分子功能和细胞组分3 个方面 KEGG 通路富集分析可以将差异表达基因的通路注释分析提供的整合代谢途径包括碳水化合物核苷和氨基酸等利用 GraphPad Prism 8 0 软件绘制GO 功能注释分类统计图 1 2 4 烟粉虱取食后甘蓝叶片差异表达基因的验证为了验证测序结果的准确性选取差异表达基因最多的甘蓝苯丙烷通路上PAL2 C4H 4CL1 和 CHI 四个上游基因进行qRT PCR 测定饲喂试验处理试虫数量雌雄比和取样方法同1 2 1 仅是烟粉虱取食12h 后取样参照Trizol 试剂说明书提取甘蓝样品总RNA 使用微量分光光度计和1 琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的纯度和完整性取2 g 质量较好且无基因组污染的总RNA 按照cDNA 合成试剂盒说明书反转录合成cDNA 利用Primer Pre mier5 0 软件及NCBI 数据库序列对这4 个基因的引物进行设计表1 使用CFX Connect 荧光定量 PCR 仪进行qRT PCR 扩增 10 L 反应体系 20 倍稀释的cDNA 模板液2 L 2 SYBR 预混染料Ex Taq II 5 L 100 mol L 上下游引物各 0 4 L ddH 2 O2 2 L 反应条件 95 预变性3min 95 变性30 s 55 退火30 s 72 延伸1 min 40 个循环甘蓝Actin 为内参基因每个处理3 次生物学重复采用2 Ct 法对qRT PCR 数据进行分析获得4 个基因的表达量表1 本研究设计的用于实时荧光定量PCR 检测的基因引物 Table1 Sequencesofspecificprimersdesignedandusedforquantitativereal timePCR 基因Gene PAL2 C4H 4CL1 CHI Actin 正向引物Forwardprimer 5 AGTTCACCGATCATCTAACG 3 5 GCCGTTCCTTAGAGGCTACTTG 3 5 GAGGTGTAAAGTGACGGTTGCTC 3 5 CGGAGAACTGTGTGGCGATA 3 5 CTATTGAGCATGGTGTTGTGAGC 3 反向引物Reverseprimer 5 CTAGCTTCATGTACGAGCTT 3 5 CCTCGTTGATCTCTCCCTTCTGTT 3 5 AGCACCAGATTTCACAACCCTAA 3 5 AGAGCGAAGAGGATGGATGC 3 5 TAGCTGGAGAGTTGAAGGTTTCG 3 1 3 数据分析使用IBM SPSS Statistic 19 0 软件对试验数据进行统计分析采用单因素进行方差分析应用 Tukey sHSD 法进行差异显著性检验 2 结果与分析 2 1 烟粉虱取食后甘蓝转录组差异表达分析与对照相比 MEAM1 烟粉虱隐种取食甘蓝叶片1d 后其差异表达基因有693 个其中467 个上调表达 226 个下调表达 MED 烟粉虱隐种取食甘蓝叶片1d 后其差异表达基因有1030 个其中576 个上调表达 454 个下调表达图1 2 2 烟粉虱取食后甘蓝差异表达基因GO 功能注释仅列出富集显著性最可靠且注释到的差异基因超过30 个的通路图2 MED 与MEAM1 烟粉虱隐种取食1d 后甘蓝差异基因均主要富集到生物学过程和细胞组分这两大类其中在生物学过程中富集到差异基因个数最多的是细胞过程代谢过程和单组织过程在细胞组分中富集到差异基因个数最多的是细胞和细胞组分分子功能中富集到差异基因最多的是催化活性和结合图2 在所有GO 条目中 MED 烟粉虱取食1 d 后甘蓝富集到的差异基因均要多于MEAM1 取食1d 后的甘蓝图2 由此可见与MEAM1 烟粉虱隐种取食相比 MED 烟粉虱隐种取食能够引起甘蓝响应的程度更高二者诱导甘蓝产生的防御响应水平差别较大图1 MEAM1 和MED 烟粉虱隐种取食后甘蓝叶片差异表达基因数 Fig 1 No ofdifferentiallyexpressedgenesofcabbageinfest edbyMEAM1andMEDcrypticspeciesofBemisiatabaci 1 细胞过程 2 代谢过程 3 单组织过程 4 生物调节 5 刺激响应 6 发育过程 7 多细胞生物过程 8 细胞组成或生物发生 9 定位 10 信号转导 11 繁殖过程 12 多组织过程 13 细胞 14 细胞组分 15 细胞器 16 膜 17 膜组分 18 大分子复合体 19 胞外区 20 细胞连接 21 共质体 22 结合 23 催化活性 24 结合 25 核酸结合转录因子活性 26 转运蛋白活性 1 Cellularprocess 2 metabolicprocess 3 single organismprocess 4 bio logicalregulation 5 responsetostimulus 6 developmentalprocess 7 multicellularorganismalprocess 8 cellularcompo nent organization or biogenesis 9 localization 10 signaling 11 reproductive process 12 multi organism process 13 cell 14 cell part 15 organelle 16 membrane 17 membrane part 18 macromolecular complex 19 extracellular region 20 celljunction 21 symplast 22 binding 23 catalyticactivity 24 binding 25 nucleicacidbindingtranscriptionfactoractivi ty 26 transporteractivity 图2 MEAM1 和MED 烟粉虱隐种取食后甘蓝叶片差异表达基因的GO 功能注释 Fig 2 GOfunctionalcategoriesofdifferentiallyexpressedgenesinthecabbageleavesinfestedbyMEAM1and MEDcrypticspeciesofBemisiatabaci 2 3 烟粉虱取食后甘蓝差异表达基因的KEGG 分析 KEGG 富集分析结果显示 MEAM1 和MED 烟粉虱隐种取食后甘蓝叶片差异表达基因分别富集到 84 条和87 条通路上其中与作物抗虫性密切相关的通路有苯丙烷类生物合成途径芥子油苷生物合成途径类黄酮生物合成途径萜类挥发物生物合成途 6 期胡杰等 MEAM1 和MED 两个烟粉虱隐种取食对甘蓝转录组影响的差异 1383径和植物激素信号传导途径与对照相比 MEAM1 和MED 烟粉虱隐种取食后甘蓝均引起这些抗虫通路部分标记基因上调 MED 烟粉虱隐种取食后甘蓝注释到与抗虫防御相关通路上的差异表达基因数要远多于MEAM1 烟粉虱隐种取食后表明MED 烟粉虱隐种诱导甘蓝的防御响应更明显表2 表2 MEAM1 和MED 烟粉虱隐种取食后甘蓝叶片抗虫防御相关差异表达基因的KEGG 富集分析 Table2 KEGGenrichmentanalysisofdifferentiallyexpressedgenesinvolvedintheplantdefensepathwayincabbagesinfestedby MEAM1andMEDcrypticspeciesofBemisiatabaci 路径编号 PathwayID ko00900 ko00940 ko00966 ko04075 ko00941 通路描述 Pathwaydescription 萜类挥发物生物合成途径Terpenoidbackbonebiosynthesis 苯丙烷类生物合成途径Phenylpropanoidbiosynthesis 芥子油苷生物合成途径Glucosinolatebiosynthesis 植物激素信号传导途径Planthormonesignaltransduction 类黄酮生物合成途径Flavonoidbiosynthesis 差异表达基因数目 No ofdifferentiallyexpressedgenes MEAM1 取食甘蓝 MEAM1 infestedcabbages 1 12 2 11 3 MED 取食甘蓝 MED infestedcabbages 2 17 3 19 2 2 4 烟粉虱取食后甘蓝叶片差异表达基因的验证 MEAM1 烟粉虱隐种取食12 h 后甘蓝叶片苯丙烷通路上 PAL2 F 2 6 37 223 P 0 001 图3 A C4H F 2 6 19 676 P 0 002 图 3 B 和 4CL1 F 2 6 26 146 P 0 001 图3 C 3 个上游基因的相对表达量均较对照显著上调而CHI 基因 F 2 6 0 550 P 0 604 图3 D 相对表达量较对照无显著变化相反 MED 烟粉虱隐种取食12 h 后甘蓝叶片苯丙烷通路上4 个基因的相对表达量均较对照无显著变化且这4 个差异基因的qRT PCR 结果与测序结果一致图3 表明测序结果可信度高图3 MEAM1 和MED 烟粉虱隐种取食后诱导甘蓝叶片苯丙烷通路相关基因PAL2 A C4H B 4CL1 C 和CHI D 的表达 Fig 3 RelativeexpressionlevelsofPAL2 A C4H B 4CL1 C andCHI D genesinvolvedinthephenylpropanoidpathwayin cabbageleavesinfestedbyMEAM1andMEDcrypticspeciesofBemisiatabaci 图中数据均为平均数标准误同色柱上不同小写字母表示经Tukey s HSD 法检验在P 0 05 水平差异显著 Data are mean SE DifferentlowercaselettersonthesamebarsindicatesignificantdifferenceatP 0 05levelbyTukey sHSDtest 1384 植物保护学报 48 卷3 讨论本研究通过转录组数据分析发现 MEAM1 和 MED 烟粉虱隐种取食均能诱导甘蓝产生防御响应主要体现在有较多的差异表达基因被注释到苯丙烷通路控制的多酚合成类黄酮合成和萜类挥发物合成等与植物抗虫机制相关的调控通路上目前普遍认为刺吸式口器害虫取食能激活寄主植物SA 信号传导途径而有效抑制JA 信号传导途径两者通常表现为拮抗关系 Zhang et al 2009 但是本研究发现MEAM1 和MED 烟粉虱隐种取食均能导致JA 信号通路上的部分关键标记基因上调而SA 信号通路标记基因无显著变化 Florencio Ortiz et al 2020 研究结果也发现刺吸式害虫蚜虫取食辣椒后其叶片内JA 含量在各个时间点均显著上调而 SA 含量无明显变化 Kantetal 2008 研究发现有些二斑叶螨Tetranychus urticae 品系的取食甚至能同时抑制JA 与SA 信号通路 Maronetal 2019 认为害虫取食所诱导的寄主植物防御信号通路具有害虫种的特异性和寄主植物种的特异性由此可见 JA 与SA 信号通路的运作机制十分复杂受多种因素的影响尚无普遍适用的模式苯丙烷类合成通路调控合成的酚类物质是一类重要的植物次生抗虫代谢产物 Dixon et al 2002 War et al 2012 本研究结果发现甘蓝被MEAM1 烟粉虱隐种取食12h 后苯丙烷通路多酚合成 3 个相关基因表达显著上调而甘蓝被MED 烟粉虱隐种取食后苯丙烷通路上4 个基因与未被取食的甘蓝均没有显著变化可见 MEAM1 烟粉虱隐种取食诱导甘蓝总酚的累积使寄主质量恶化导致MEAM1 烟粉虱隐种回避在前期取食过的甘蓝上取食和产卵未发表数据甘蓝对MEAM1 和MED 烟粉虱的抗性存在明显差异如相较于MED 烟粉虱隐种 MEAM1 烟粉虱隐种在甘蓝上存活率和生殖率更高发育历期也更短 Cui et al 2017 Liu et al 2012 通过刺探电位技术发现 MEAM1 烟粉虱隐种比MED 烟粉虱隐种更适于在甘蓝上取食本研究的GO 功能注释图显示在所有GO 条目中MED 烟粉虱隐种取食后甘蓝差异表达基因数要显著多于MEAM1 烟粉虱隐种取食后的 KEGG 富集分析还发现MED 烟粉虱隐种取食后甘蓝注释到与抗虫防御相关的通路上的差异表达基因数量要远多于MEAM1 取食后的由此可见MEAM1 与MED 烟粉虱隐种取食诱导甘蓝产生的防御响应水平差异较大且相较于MEAM1 烟粉虱隐种 MED 烟粉虱隐种取食引起甘蓝响应的水平更高证明了甘蓝作为寄主植物对MED 烟粉虱的抗性强于对MEAM1 烟粉虱的抗性 Cui et al 2017 也报道MEAM1 烟粉虱隐种比MED 烟粉虱隐种能够更好地操控甘蓝寄主营养物质含量和诱导防御响应与本研究结果一致而关于2 个烟粉虱隐种取食后甘蓝抗性存在差异的原因有多种合理解释行为学观点认为在取食甘蓝时MEAM1 和MED 两个烟粉虱隐种口针刺探行为的差异使得MED 烟粉虱隐种更易与芥子油苷黑芥子酶系统催化水解产生的异硫氰酸酯硫氰酸酯和腈类等有毒产物接触进而导致甘蓝对 MED 烟粉虱隐种抗性高于 MEAM1 烟粉虱隐种 Huetal 2020 代谢观点认为MEAM1 烟粉虱隐种体内的脱硫酯酶活性强于 MED 烟粉虱隐种能将甘蓝的芥子油苷高效转化为无毒的产物 Ren et al 2021 此外 MEAM1 烟粉虱隐种能通过转葡萄糖基作用来代谢脂肪族和吲哚族芥子油苷降低其被黑芥子酶活化的中毒风险 Malkaetal 2020 MED 烟粉虱隐种是否有类似解毒机制以及MEAM1 烟粉虱隐种的转葡萄糖基作用是否强于MED 烟粉虱隐种还需进一步研究相反 Yangetal 2020 和Lietal 2021 研究结果表明甘蓝芥子油苷的种类和含量对烟粉虱的取食和产卵无显著影响烟粉虱的取食和产卵选择性可能受不同基因型甘蓝