壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响

中国农业大学学报，（）壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响董春娟李亮张志刚王玲玲尚庆茂（中国农业科学院蔬菜花卉研究所农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室环渤海湾地区设施蔬菜优质高效生产协同创新中心，北京）摘要为明确壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌群落结构的影响，以添加壳聚糖的草炭、蛭石、珍珠岩为基质，进行黄瓜穴盘育苗试验，测定幼苗生长指标，并采用焦磷酸测序技术测定穴盘苗根际细菌的种群变化。结果表明基质添加壳聚糖可以显著促进黄瓜穴盘苗生长。添加壳聚糖使穴盘苗根际基质中细菌群落的、和指数减小，指数增大，根际细菌群落的丰富度和多样性降低。序列分析表明，黄瓜穴盘苗根际基质中的细菌主要是丛毛单胞菌科属、假单胞菌科纤维弧菌属、黄色杆菌科属和草酸杆菌科属等。添加壳聚糖后，根际细菌如属、纤维弧菌属、根瘤菌属、属、属等的相对丰度显著升高，这些细菌属多具有植物促生潜力；而食酸菌属、属、属、丰祐菌属、纤维单胞菌属等的相对丰度显著降低。可见，基质添加壳聚糖有利于根际有益细菌的选择性富集，改善黄瓜穴盘苗根际微生态环境，促进幼苗生长。关键词黄瓜；壳聚糖；基质；根际细菌；测序中图分类号文章编号（）文献标志码收稿日期基金项目国家自然科学基金项目（）；公益性行业（农业）科研专项经费项目（）；现代农业产业技术体系建设专项资金（）；中国农业科学院科技创新工程（）第一作者董春娟，副研究员，主要从事蔬菜种苗发育调控研究，通讯作者尚庆茂，研究员，主要从事蔬菜种苗发育调控及繁育技术研究，（，），（，），；第期董春娟等壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响壳聚糖（，）是甲壳素脱乙酰基的产物，因其来源广泛、无毒无害、无残留，以及同生物体极好的兼容性，常被用作植物病害抑制剂、种衣剂、植物生长调节剂、农药载体等，在农业上广泛应用，。叶面喷施壳聚糖可以显著促进黄瓜、番茄等植株对营养物质的吸收，提高植株光合能力，促进根系细胞分生，促进植物生长。作为土壤改良剂，壳聚糖可被土壤中微生物分解，活化土壤的和养分，且壳聚糖分子对土壤中微量元素、和等具有螯合效应，可以提高土壤中微量元素的有效态养分。然而，施用壳聚糖是否对植物根际微生态环境有所影响，尚未见报道。植物根际细菌多样性与植物生长发育密切相关。一方面，根际有益细菌可以直接参与土壤营养元素的代谢循环，促进有机质分解，提高养分的有效性，或分泌多种促生长类激素直接促进植物生长，同时根际有益细菌还可以通过竞争营养或侵染位点，合成抗生素类物质或载铁蛋白等机制抑制根际病原细菌的繁殖，协助植物抵御病害，提高植物免疫力。另一方面，根际有害细菌通过分泌毒素、竞争营养物质等抑制植物生长，尤其是一些病原细菌，通过侵染植物的维管束，造成植物水分、养分运输中断，引起植物枯萎、根腐和猝倒等症状。多数根际细菌难以在实验室条件下培养。二代测序技术的兴起，包括焦磷酸测序、等平台为根际细菌探索提供了很好的途径，可以更加高效、准确地反映根际细菌的多样性信息。黄瓜（）种植以育苗移栽为主，且主要采用穴盘育苗方式。基质是穴盘育苗的重要组成部分，由于基质配制不科学、操作不规范等，常造成幼苗根际基质的微生态环境不良，苗期病害时有发生。添加生物活性物质改善基质的生物学特性，为幼苗提供良好的根际环境，对于黄瓜壮苗培育至关重要。本研究采用焦磷酸高通量测序技术分析了基质添加壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌群落结构的影响，旨在从细菌多样性角度丰富壳聚糖的促生机制，为黄瓜穴盘苗根际调控和壮苗培育提供理论依据。材料与方法黄瓜穴盘苗培养供试黄瓜选用“中农号”（），由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育。黄瓜种子经体积分数为的溶液表面消毒，无菌水冲洗遍后，恒温培养箱中催芽。种子萌发后，选择发芽一致的种子播种于装有草炭蛭石珍珠岩（体积比为）混合基质的孔穴盘中，每穴孔一粒种子。草炭购自北京大汉园景有限公司（，德国），草炭，值；蛭石和珍珠岩购自河北灵寿县腾达矿产品加工厂，粒径分别为和。基质中添加壳聚糖（，脱乙酰度，国药集团化学试剂有限公司），以不加壳聚糖的基质作为对照（）。播种后覆盖厚的蛭石，并充分浇水，直至穴盘底部排水孔有水滴出现。育苗试验于年月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所玻璃温室中进行，平均昼夜温度分别为（）（），自然光照强度（约（）和光周期，平均相对湿度。待黄瓜幼苗子叶平展后，每隔使用“花多多”水溶速效复合肥（，）溶液进行追肥，施肥氮（）浓度为，至第一真叶展开后每隔施用“花多多”水溶肥，施用量为穴盘，施肥与灌水交替进行。每个处理设次重复，每重复个穴盘。黄瓜幼苗生长指标测定播种后，每处理每重复随机选取株幼苗，测定株高、茎粗、叶面积、地上部鲜重、根鲜重和根体积等生长指标，测定方法参照高晓旭等。根际基质细菌多样性分析根际基质样品收集与基因组提取播种后，每处理每重复随机选取株黄瓜幼苗，根际基质的收集参照聂艳丽等的方法，抖落根区基质后，用小刷子将根系紧密附着的基质轻轻扫下，收集、混匀，过筛，去除较大的基质块和植物根系组织，将所得基质装入无菌自封袋中，冰箱保存，用于细菌基因组提取。使用公司试剂盒抽提基质基因组，采用大量产物纯化试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）进行纯化。采用琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组，并采用（，）测定浓度。扩增与焦磷酸测序以纯化后的基因组为模板，采用细菌通中国农业大学学报年第卷用引物对的区进行扩增，引物序列分别为（）和（），由上海美吉生物医药科技有限公司合成。同时在引物的端添加序列区分样品。反应体系包括聚合酶（全式金生物技术有限公司，北京）、缓冲液、正向引物（）、反向引物（）、模板，补至。反应程序为预变性，变性，退火，延伸，个循环后，延伸，保持直到反应完成。反应在型仪（，）中进行。每个样品个重复，将同一样品的产物混合后用琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶回收试剂盒（，）切胶回收产物，洗脱。琼脂糖凝胶电泳再次检测、定量。参照电泳初步定量结果，将产物用蓝色荧光定量系统（，）进行检测定量，将各扩增产物等量（）混合，用于测序。测序由上海美吉生物医药科技有限公司使用（，）完成，试剂采用。测序读长为。序列数据分析通过区分各样品的测序数据，并生成不含的各样品测序的有效序列文件。然后对有效序列进行去杂优化，包括保留引物的错配数在个以内的序列；使用软件（）检测接头和修剪末端，去除序列末端的后引物的接头序列、多碱基、尾巴及低质量碱基；使用软件（）去除长度短于，模糊碱基数、序列平均质量的序列。采用软件进行（可操作分类单元，）聚类分析，主要步骤包括合并序列长度和碱基组成完全一致的序列，提取非重复序列；采用的方法（），与数据库（版）中的核糖体序列数据库（、）进行比对；使用（）检测并去除序列；计算比对对齐后的序列间非校正配对距离，使用方法（）按相似度聚类生成。使用稀释曲线（）和曲线表征样品的测序深度，采用程序得出指数和指数表示物种的丰富度，以指数和指数评估样品的物种多样性。为了获得每个的分类学信息，将相似水平下每个中的所有序列进行一致性分析，找出同一个中的不同序列的最近祖先的种属信息作为该的种属信息。所用软件为分类学分析（），算法为。数据统计分析试验结果用次重复的平均值标准差（）表示，采用检验进行差异显著性分析。结果与分析壳聚糖对黄瓜穴盘苗生长发育的影响基质添加壳聚糖对黄瓜幼苗出苗率及出苗速率没有显著影响。但播种后时幼苗株高、地上部鲜重以及第二真叶面积等参数显著高于对照（表），可见，基质添加壳聚糖可以促进黄瓜穴盘苗的生长。焦磷酸测序数据的统计分析采用焦磷酸测序法分析不同基质样品的细菌多样性，如表所示，共获得条有效序列，序列平均长度为，按照质量控制原则对有效序列进行筛选，筛选后的优化序列共条，优化序列平均长度为，每个样品得到的优化序列数量为条。经比对，共有条序列可以比对到数据库中，占优质序列的。在相似度水平，共获得个，对照样品中数量分别为、和条，添加壳聚糖的基质中数量略低，分别为、和条。第期董春娟等壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响表壳聚糖对黄瓜穴盘苗生长发育的影响样品株高茎粗地上部鲜重第一真叶面积第二真叶面积根鲜重根体积壳聚糖注，表示在和水平与对照相比差异显著。下同。表黄瓜穴盘苗各根际基质样品测序数据量统计样品有效序列优化序列匹配的序列数量（）（）（）（）（）（）（）（）壳聚糖（）（）（）（）总计注括号内数字表示优化序列占有效序列的百分比；括号内数字表示匹配的序列占优化序列的百分比；聚类的相似度水平为。；稀释曲线可以反映样品的测序深度，如图所示，在的相似度水平下，不同根际基质样品的稀释曲线趋于平坦，但均未达到饱和，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的，该测序深度能基本完整反映细菌群落多样性。曲线利用各样品的测序量在不同测序深度时的指数构建曲线，当曲线趋于平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。由图可知，所有样品的指数均达到平台期，进一步说明所有样品的测序深度均能反映根际细菌多样性信息。添加壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响将各样品测序获得的优质序列用于评价基质细菌多样性，如表所示。和指数用于估图不同根际基质样品的稀释曲线和曲线（相似水平）（）中国农业大学学报年第卷计样品中物种总数，可以反映样品的物种丰富度。添加壳聚糖的基质中和指数显著降低（），表明基质添加壳聚糖可以降低黄瓜根际基质中细菌的丰富度。和指数反映样品中微生物多样性。值越大，表明群落多样性越高；与之相反，指数值越小，表明群落多样性越高。如表所示，添加壳聚糖后，指数减小，指数增大，表明根际细菌群落多样性水平降低。可见，基质添加壳聚糖可以引起黄瓜穴盘苗根际细菌群落丰富度和多样性水平降低。表壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际基质样品的细菌多样性的影响样品丰富度指数多样性指数对照壳聚糖基质添加壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌群落结构的影响利用序列信息对黄瓜穴盘苗的根际细菌群落组成进行分析。在科分类水平，在对照和添加壳聚糖的根际基质样品中，分别鉴定到和个科，种样品中共有的科有个。其中相对丰度大于的已知细菌科有个，如图所示。对照样品主要的细菌有丛毛单胞菌科（，）、黄单胞菌科（，）、假单胞菌科（，）、柄杆菌科（，）、草酸杆菌科（，）和红螺菌科（，）。添加壳聚糖后，根际基质中主要细菌为丛毛单胞菌科（）、假单胞菌科（）、黄单胞菌科（）、柄杆菌科（）、微杆菌科（，）、红螺菌科（）和根瘤菌科（，）。其中丛毛单胞菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、鞘脂单胞菌科、鞘脂杆菌科（）、微单胞菌科（）等的相对丰度显著升高，而黄单胞菌科、草酸杆菌科、酸杆菌科（）、丰祐菌科（）等的相对丰度显著降低（图）。在属分类水平，所有序列共分为个属，其中对照根际基质样品中共鉴定到个属，添加壳聚糖的基质中较低，只有个属。相对丰度大于的已知细菌属共个，如图所示。对照根际基质样品中，属（）、纤维弧括号内数字表示相对丰度，为次重复的平均值。图壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际基质细菌群落的影响（科分类水平）第期董春娟等壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响图壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际基质细菌群落的影响（属分类水平）菌属（）、属（）和属（）为优势菌属，其相对丰度均大于。添加壳聚糖后，属、纤维弧菌属的相对丰度显著升高，而属和属的相对丰度则显著降低。此外，属、根瘤菌属、鞘氨醇单胞菌属、微杆菌属、属、属和属的相对含量均有显著升高；而相对丰度显著降低的细菌菌群有属、食酸菌属、丰祐菌属、纤维单胞菌属等（图）。进一步将得到的鉴定到种，但是多数序列无法获得其菌种信息，图列出了种发生显著差异的已知细菌的相对丰度变化。如图所示，根瘤菌属和的相对丰度分别是对照样品的和倍；此外，属、微杆菌属、指孢囊菌属和中慢生根瘤菌属的相对丰度也有显著升高。相比对照，添加壳聚糖的根际基质中属的相对丰度显著降低，只有对照的。结论与讨论基质添加壳聚糖可以显著促进黄瓜穴盘苗的生长发育（表），进一步采用焦磷酸测序技术分析了基质添加壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌群落结构的影响，发现添加壳聚糖后根际基质的和指数显著降低，指数减小，指数增大（表），表明壳聚糖可以引起根际基质细菌丰富度和群落多样性显著降低。分析原因，壳聚糖可以作为一种新的碳源物质，被根际某些细菌分解利用，因此为根际细菌的生长提供了一个选择性的环境，利于可以分解和利用壳聚糖的细菌生长，而原有细菌菌群受到竞争性抑制，从而导致根际细菌多样性降低。基质添加壳聚糖可以改变黄瓜穴盘苗的根际细菌群落组成。基质添加壳聚糖后，穴盘苗根际基质中属、纤维弧菌属、根瘤菌属、属、属等的相对丰度显著升高，而原有优势菌属属、属、食酸菌属、丰祐菌属、纤维单胞菌属等的相对丰度则显著降低（图和图），这与已报道的土壤中添加壳聚糖后植物根际细菌群落的变化趋势相一致，。进一步分析这些上调菌群的生物学功能，发现中国农业大学学报年第卷图壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际基质中种细菌相对丰度的影响属、纤维弧菌属、根瘤菌属、鞘氨醇单胞菌属、属等细菌多为植物促生菌。多数属细菌基因组中含有糖苷水解酶编码基因，可以分解基质中的纤维素、半纤维素以及外源添加的壳聚糖等多糖分子，为幼苗生长提供更多的碳源和养分，促进幼苗生长，。添加壳聚糖后纤维弧菌属的丰度显著增加，这与之前的报道一致。等发现在河流、壕沟等不同的生态环境中添加甲壳素或壳聚糖后，纤维弧菌属细菌均显著增多成为优势菌群。多数纤维弧菌属细菌可以合成几丁质酶，分解壳聚糖，甚至一些纤维弧菌，如经甲壳素诱导后会分泌多种多糖水解酶，促进根际糖类物质的分解和活化。此外，部分纤维弧菌属细菌还具有固氮功能，对植物根部氮素的吸收具有促进作用。另一类显著升高的根际细菌为根瘤菌属。黄瓜穴盘苗根际主要的根瘤菌包括和（图），这两种细菌广泛存在于植物根际土壤中，是最主要的植物非共生固氮菌。纤维弧菌和根瘤菌数量的升高有助于植物根部氮的固定和利用，促进植物生长。鞘氨醇单胞菌属和属细菌的增多有助于植物抵御根部细菌或真菌性病害。等发现，根际鞘氨醇单胞菌可以提高莴苣抗根腐病的能力。此外，壳聚糖自身对嗜酸菌属、黄单胞菌属等植物致病性细菌也具有一定的抑菌效果，。可见，基质添加壳聚糖后，引起黄瓜穴盘苗根际属、纤维弧菌属、根瘤菌属、鞘氨醇单胞菌属、属等具有促生潜力的细菌数量增多，促进植物根部碳、氮等养分的活化和吸收，抵御根际致病性细菌的繁殖和侵染，从而改善黄瓜穴盘苗的根际微生态环境，促进幼苗的生长发育。本研究采用焦磷酸测序技术分析了基质添加壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌群落结构的影响，丰富了壳聚糖的促生机制。相较于传统分离培养的方法，基于的测序技术在分析量和信息量上具有明显的优势，但这种方法也有一定的局限性，无法将游离于细胞外的以及死亡细胞的与具有活性的细胞区分开来，且序列信息的解析基于数据库，部分序列无法获得其分类信息。因此，对黄瓜穴盘苗根际促生细菌的分离和功能鉴定，并探究其促进幼苗生长的作用机制，将是下一步开展的工作重点。参考文献，于仁竹，于贤昌，王桂红壳聚糖对黄瓜幼苗生长和生理特性的影响西北农业学报，（），（）（），第期董春娟等壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响，蒋小姝，莫海涛，苏海佳，张小勇甲壳素及壳聚糖在农业领域方面的应用中国农学通报，（），（）（），（）康贻军，程洁，梅丽娟，胡健，朴哲，殷士学植物根际促生菌作用机制研究进展应用生态学报，（），（），（）（），（）高晓旭，张志刚，段颖，董春娟，尚庆茂高浓度营养液对黄瓜和番茄下胚轴徒长的抑制作用植物营养与肥料学报，（），（）（）聂艳丽，陆斌，刘金凤，童清不同育苗基质的团花根际微生物群落功能多样性特征中南林业科技大学学报，（），（）（），（），