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热带作物学报 2021 42 2 436 441 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2020 03 20 修回日期 2020 04 29 基金项目 海南省自然科学基金项目 No 313037 作者简介 杨华庚 1966 男 硕士 副教授 研究方向 热带作物栽培与生理生态 E mail hg yang 外源钙及其抑制剂对蝴蝶兰幼苗耐热性的影响 杨华庚 杨毅敏 海南大学热带作物学院 海南海口 570228 摘 要 为探讨 Ca 2 信号参与调节蝴蝶兰耐热性形成的生理机制 采用适宜浓度的外源 Ca 2 CaCl 2 胞外 Ca 2 螯合 剂 EGTA 和质膜 Ca 2 通道抑制剂 LaCl 3 溶液喷施蝴蝶兰幼苗植株 以喷施蒸馏水为对照 测定高温胁迫下蝴蝶 兰幼苗植株的抗氧化酶活性 丙二醛 渗透调节物质和光合色素含量的变化 结果表明 与对照相比 CaCl 2 处理能显 著增强超氧化物歧化酶 SOD 过氧化物酶 POD 和过氧化氢酶 CAT 活性 增加脯氨酸 可溶性蛋白 可溶性 糖 叶绿素和类胡萝卜素含量 显著降低丙二醛含量 减轻了蝴蝶兰幼苗的高温伤害 而 LaCl 3 和 EGTA 处理不同程 度地降低 SOD POD 和 CAT 活性 降低脯氨酸 可溶性蛋白 可溶性糖 叶绿素和类胡萝卜素含量 显著增加丙二 醛含量 使蝴蝶兰幼苗受害加重 由此认为 Ca 2 信号可通过参与抗氧化酶活性 脯氨酸和光合色素的代谢过程来调 控蝴蝶兰幼苗耐热性的形成 关键词 蝴蝶兰 钙离子信号 耐热性 生理机制 中图分类号 S682 31 文献标识码 A Effect of Exogenous Calcium and Calcium Inhibitors on the Heat Tolerance in Phalaenopsis Seedlings YANG Huageng YANG Yimin College of Tropical Crops Hainan University Haikou Hainan 570228 China Abstract The objective of the study is to explore the underlying physiological mechanism of Ca 2 signal participating in the enhancement of Phalaenopsis heat tolerance The seedlings of Phalaenopsis were sprayed appropriate concentration of exogenous calcium Ca 2 extracellular Ca 2 chelator EGTA and plasma membrane Ca 2 channel inhibitor LaCl 3 respectively taking distilled water as the control The effects of antioxidant enzyme activity malondialdehyde MDA osmotic regulators and photosynthetic pigment contents in Phalaenopsis leaves under high temperature stress were investigated The results showed that SOD POD and CAT activities proline soluble sugar soluble protein total chlorophyll and carotenoids contents were significantly increased and MDA content was significantly reduced in the CaCl 2 treatment group stress damages in Phalaenopsis seedlings caused by high temperature were alleviated while the activities of three antioxidant enzymes and contents of three osmoregulation substances and contents of two photosynthetic pigments mentioned above were decreased to different extents and MDA content was significantly improved in LaCl 3 and EGTA treatments group compared with the control group thereby aggravating the damage of high temperature stress in Phalaenopsis seedlings The study showed that Ca 2 signaling could improve the resistance of Phalaenopsis seedlings to high temperature stress by participating in antioxidant enzyme activity proline and photosynthetic pigment metabolism processes Keywords Phalaenopsis Ca 2 signal heat tolerance physiological mechanism DOI 10 3969 j issn 1000 2561 2021 02 019 第 2 期 杨华庚等 外源钙及其抑制剂对蝴蝶兰幼苗耐热性的影响 437 蝴蝶兰 Phalaenopsis ssp 是具有较高观赏 性和商业价值的热带附生兰花 其生长发育对高 温敏感 易受高温的抑制和危害 不利于蝴蝶兰 植株的正常生长发育 因此 应用外源 Ca 2 等生 长调节物质提高蝴蝶兰耐热性对蝴蝶兰抗热性栽 培具有重要的生产意义 Ca 2 是植物体生长发育 的必需营养元素 不仅可作为细胞壁的结构成分 生物膜的稳定剂和多种酶的活化剂影响植物的生 长发育过程 而且还作为偶联胞外信号与胞内生 理生化反应的第二信使 参与植物对高温等逆境 的信号转导 1 高温胁迫下 植物细胞内的 Ca 2 浓度会显著升高 2 3 而形成的胞内外 Ca 2 浓度差 会产生钙信号 Ca 2 与其受体蛋白 CaM 钙调素 蛋白 结合后 能启动相关基因表达 诱导热激 蛋白的合成 调节一系列的生理代谢过程来增强 植物对高温的适应性 1 4 研究发现 外源 Ca 2 处理能提高菊花 5 茄子 6 辣椒 7 8 等植物的抗 热性 而 Ca 2 螯合剂 EGTA 和质膜 Ca 2 通道 阻抑剂 LaCl 3 处理能不同程度地降低番茄 9 辣椒 7 等植物的抗热性 说明 Ca 2 信号参与植物 抗热性的调控 其作用机制可通过稳定质膜结构 维持较高 Ca 2 AT P 酶活性 8 参与调节热激蛋白 的基因表达和热激蛋白合成 2 10 维持较高的抗 氧化酶活性和抗氧化物质含量 7 11 促进细胞内 渗透调节物质的积累 12 13 提高光合作用 12 等生 理过程来增强植物的抗热性 虽然外源 Ca 2 处理 能显著提高蝴蝶兰幼苗的耐热性 14 但目前还缺 少 Ca 2 信号是否参与蝴蝶兰耐热性调控的相关证 据 本研究采用适宜浓度的 CaCl 2 EGTA 和 LaCl 3 溶液喷施蝴蝶兰幼苗植株 测定高温胁迫下蝴蝶 兰幼苗植株的抗氧化酶活性 丙二醛 渗透调节 物质和光合色素含量的变化 初步探讨 Ca 2 信号 是否参与蝴蝶兰耐热性的调控 为生产上应用外 源 Ca 2 提高蝴蝶兰耐热性提供理论依据 1 材料与方法 1 1 材料 为生长健壮 无病虫危害的 4 叶龄蝴蝶兰品 种 满天红 Dtps Queen Beer Red Sky 的幼苗 植株 购自海南博大兰花有限公司 1 2 方法 1 2 1 试验设计 选取高度 长势 叶色基本一 致的适量幼苗植株放入温度为 27 昼 22 夜 相对湿度为 65 75 光照强度为 230 mol m 2 s 的生物培养箱内进行预处理 期 间适当浇水以保持基质湿润 5 d 后取出幼苗植株 进行试验处理 试验设计高温胁迫 蒸馏水 CK 高温胁迫 20 mmol L CaCl 2 高温胁迫 5 mmol L EGTA 高温胁迫 5 mmol L LaCl 3 4个处理 每 个处理 9 株苗 3 次重复 将含 0 1 Tween 80 pH 6 8 的各处理溶液于傍晚时分均匀喷施于蝴蝶 兰幼苗叶片的正反面 以欲滴为度 连续喷洒 3 d 然后将所有处理植株置于温度为 40 1 相对 湿度为 65 75 光照强度为 230 mol m 2 s 的光照培养箱内进行 3 d 胁迫处理 胁迫结束后 立即取出植株 剪下顶端最近充分成熟的叶片 依次用自来水和蒸馏水洗净后 经干净纱布擦干 去掉叶片粗大的主脉 剪取叶样 充分混匀 用 于测定相关生理指标 1 2 2 抗氧化酶活性测定 粗酶液按文献 14 的 方法进行提取 超氧化物歧化酶 SOD 活性采 用氮蓝四唑 NBT 光化还原法 参照李合生 15 的方法测定 以抑制 NBT 光化还原的 50 为 1 个酶活性单位 U 以 U g h 表示 过氧化物酶 POD 活性采用愈创木酚法 参照郑炳松 16 的 方法测定 以每分钟吸光度增加 0 01 为 1 个酶活 性单位 以 U g min 表示 过氧化氢酶 CAT 活性采用紫外分光法 参照孔祥生等 17 的方法测 定 以每分钟吸光度减少 0 01 为 1 个酶活性单位 以 U g min 表示 1 2 3 丙二醛含量测定 采用硫代巴比妥酸法 参照孔祥生等 17 的方法测定 1 2 4 渗透调节物质含量测定 脯氨酸含量采用 酸性茚三酮法 可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝 G 250 染色法 可溶性糖含量采用蒽酮比色法 参照李合生 15 的方法测定 1 2 5 光合色素含量测定 叶绿素和类胡萝卜素 含量采用无水乙醇和丙酮等体积混合提取液法 参照张宪政 18 的方法测定 1 3 数据处理 应用 Excel 2003 软件进行数据整理和绘图 采用 SPSS 17 0 软件的 Duncan s 多重比较法进行 数据差异显著性分析 2 结果与分析 2 1 CaCl 2 EGTA 和 LaCl 3 对蝴蝶兰幼苗叶 片膜脂过氧化的影响 丙二醛 MDA 是细胞膜脂过氧化的主要产 438 热带作物学报 第 42 卷 物之一 其含量高低能反映细胞膜脂过氧化的程 度 由图 所示 CaCl 2 处理显著降低高温胁迫下 蝴蝶兰幼苗的丙二醛含量 比对照的减少 24 5 说明 Ca 2 处理能减轻高温胁迫下蝴蝶兰幼苗的膜 脂过氧化水平 而 LaCl 3 和 EGTA 处理极显著或 显著增加高温胁迫下蝴蝶兰幼苗的丙二醛含量 比对照的分别增加 69 7 和 19 2 相比之下 LaCl 3 处理的膜脂过氧化程度比 EGTA 处理的更 为强烈 说明 LaCl 3 和 EGTA 处理加重了蝴蝶兰 幼苗的膜脂过氧化伤害 不同大小写字母分别表示不同处理间在 0 01 和 0 05 水平上差异显著 Different uppercase and lowercase letters indicate significant differences among treatments at the 0 01 and 0 05 levels respectively 图 1 高温胁迫下不同处理对蝴蝶兰幼苗 丙二醛含量的影响 Fig 1 Effects of different treatments on MDA content of Phalaenopsis seedlings under high temperature stress 2 2 CaCl 2 EGTA 和 LaCl 3 对蝴蝶兰幼苗抗 氧化酶活性的影响 超氧化物歧化酶 SOD 过氧化物酶 POD 和过氧化氢酶 CAT 是细胞内清除活性氧的重 要抗氧化酶 SOD 负责清除 而 POD CAT 负责清除 H 2 O 2 其活性高低可反映细胞抗氧化能 力的强弱 从图 2 可看出 高温胁迫下 CaCl 2 处理极显著提高蝴蝶兰幼苗叶片的 SOD POD CAT 活性 比对照的分别增加了 39 0 24 5 26 9 表明 Ca 2 处理能提高蝴蝶兰幼苗清除活 性氧的能力 减轻活性氧对细胞的氧化伤害 而 EGTA 和 LaCl 3 处理均会显著降低蝴蝶兰幼苗叶 片的 SOD POD CAT 活性 其中 EGTA 处理 的 SOD POD CAT 活性分别比对照的减少 18 3 22 3 42 2 LaCl 3 处理的 SOD POD CAT 活性分别比对照的减少 34 3 12 9 28 1 说明 EGTA 和 LaCl 3 处理明显降低蝴蝶兰 幼苗的抗氧化能力 加重了高温对植株的氧化伤 害 但二者的抑制效应不同 EGTA 处理对 CAT 活性的抑制作用最强 而 LaCl 3 处理对 SOD 活性 的抑制作用最强 2 3 CaCl 2 EGTA 和 LaCl 3 对蝴蝶兰幼苗渗 透调节物质含量的影响 可溶性蛋白质 脯氨酸 可溶性糖是植物细 胞内的重要渗透调节物质 能降低细胞的渗透势 有利于增强细胞的保水能力 减轻逆境对细胞的 伤害 高温胁迫下 CaCl 2 处理显著增加蝴蝶兰幼 苗叶片的可溶性蛋白质 脯氨酸 可溶性糖含量 分别比对照的增加 11 3 15 7 218 1 表 明 Ca 2 处理能通过提高细胞的渗透调节能力缓解高 温对蝴蝶兰幼苗的伤害 而 EGTA 和 LaCl 3 处理 对可溶性蛋白质 脯氨酸 可溶性糖积累的抑制 效应不同 EGTA 处理极显著降低脯氨酸含量 但不会显著降低可溶性蛋白和可溶性糖含量 LaCl 3 处理均能显著降低脯氨酸和可溶性糖含量 但不会显著降低可溶性蛋白含量 图 3 说明 不同大小写字母分别表示不同处理间在 0 01 和 0 05 水平上差异显著 Different uppercase and lowercase letters indicate significant differences among treatments at the 0 01 and 0 05 levels respectively 图 2 高温胁迫下不同处理对蝴蝶兰幼苗抗氧化酶活性的影响 Fig 2 Effects of different treatments on antioxidant enzyme activity of Phalaenopsis seedlings under high temperature stress 第 2 期 杨华庚等 外源钙及其抑制剂对蝴蝶兰幼苗耐热性的影响 439 不同大小写字母分别表示不同处理间在 0 01 和 0 05 水平上差异显著 Different uppercase and lowercase letters indicate significant differences among treatments at the 0 01 and 0 05 levels respectively 图 3 高温胁迫下不同处理对蝴蝶兰幼苗渗透调节物质含量的影响 Fig 3 Effects of different treatments on content of osmotic adjustment substances of Phalaenopsis seedlings under high temperature stress EGTA 和 LaCl 3 处理能减弱蝴蝶兰幼苗的渗透调 节能力 使其易受高温伤害 2 4 CaCl 2 EGTA 和 LaCl 3 对蝴蝶兰幼苗光 合色素含量的影响 叶绿素和类胡萝卜素是植物的 2 类重要光合色 素 其含量多少与光能吸收密切相关 能在一定程 度上反映光合作用的强弱 如图 4 所示 高温胁迫 下 CaCl 2 处 理的蝴蝶兰幼苗叶片的总叶绿素和类 胡萝卜素含量极显著增加 分别比对照的增加 101 6 和 149 7 可见 Ca 2 处理 可通 过增加光合 色素的合成来增强光合能力 提高蝴蝶兰幼苗对高 温胁迫的适应性 EGTA 处理极显著降低总叶绿素 含量 但对类胡萝卜素的抑制作用不显著 LaCl 3 处理的总叶绿素和类胡萝卜素含量分别比对照的 减少 14 9 和 27 1 二者的下降均未达到显著差 异水平 表明 EGTA 和 LaCl 3 处 理 会抑制总叶绿素 和类胡萝卜素合成 甚至促进其降解 从而降低光 合能力 减弱蝴蝶兰幼苗对高温胁迫的抵御作用 不同大小写字母分别表示不同处理间在 0 01 和 0 05 水平上差异显著 Different uppercase and lowercase letters indicate significant differences among treatments at the 0 01 and 0 05 levels respectively 图 4 高温胁迫下不同处理对蝴蝶兰幼苗光合色素含量的影响 Fig 4 Effects of different treatments on content of photosynthetic pigment contents of Phalaenopsis seedlings under high temperature stress 3 讨论 高温胁迫下 Ca 2 处理能促使更多的胞外 Ca 2 通过质膜钙离子通道进入胞内 明显增加胞 内的 Ca 2 含量 3 从而促进 CaM 基因表达 增加 CaM 蛋白含量 Ca 2 与 CaM 结合形成钙 钙调素 Ca 2 CaM 信号系统 参与植物热激信号的转 导过程 10 研究发现 Ca 2 处理明显降低高温胁 迫下辣椒幼苗的质膜透性 而 La 3 和 EGTA 处理 会增加辣椒幼苗的质膜透性 7 本研究中 CaCl 2 处理显著降低高温胁迫下蝴蝶兰幼苗的丙二醛含 量 而 LaCl 3 和 EGTA 处理显著增加丙二醛含量 说明外源 Ca 2 能减轻高温胁迫下蝴蝶兰幼苗膜脂 过氧化作用 缓解质膜系统的损伤 提高了质膜 的稳定性 在一定程度上提高了蝴蝶兰幼苗的耐 440 热带作物学报 第 42 卷 热性 而 LaCl 3 和 EGTA 处理加剧蝴蝶兰幼苗膜 脂过氧化作用 破坏质膜的完整性 降低了蝴蝶 兰幼苗的耐热性 进一步证明 Ca 2 信号参与调控 蝴蝶兰等植物的耐热性 高温胁迫下活性氧的产生与清除失衡 引发 活性氧的过量积累 从而激活 SOD POD CAT 活性 三者相互协同共同清除过量的活性氧 减 轻了细胞的过氧化伤害 使质膜系统维持相对稳 定性 提高了植物的抗热性 19 SOD POD 和 CAT 受 Ca 2 CaM 信号系统的诱导和调控 6 例 如 Ca 2 与 CaM 结合能激活 SOD 活性 20 和 CAT 活性 21 研究表明 外源 Ca 2 处理维持高温胁迫 下玉米幼苗相对较高的 SOD CAT 抗坏血酸过 氧化物酶 APX 活 性 而 EGTA 处理能使 SOD CAT APX 快速失去活性 11 Ca 2 处理能抑制高 温胁迫下辣椒叶片抗氧化物质抗坏血酸 AsA 和谷胱甘肽 GSH 的氧化破坏 使其维持在相 对较高的水平 而 EGTA 和 La 3 处理促使辣椒 AsA 和 GSH 含量降低 7 本研究表明 CaCl 2 处 理显著提高高温胁迫下蝴蝶兰幼苗的 SOD POD CAT 活性 而 EGTA 和 LaCl 3 处理显著降低高温 胁迫下 SOD POD CAT 活性 说明外源 Ca 2 处理提高了抗氧化酶系统清除蝴蝶兰幼苗活性氧 的能力 明显降低细胞的膜脂过氧化伤害 增强 其耐热性 而 EGTA 和 LaCl 3 处理使蝴蝶兰幼苗 的抗氧化酶系统受到抑制 加重了蝴蝶兰幼苗的 高温伤害 表明 Ca 2 信号可通过参与调节抗氧化 酶活性来调控蝴蝶兰耐热性的形成 渗透调节是植物防御高温胁迫的重要机制 高温胁迫下 植物体内大量积累可溶性蛋白 可 溶性糖 脯氨酸等渗透调节物质 能在一定程度 上降低细胞水势 防止细胞内脱水 维持体内水 分平衡 稳定细胞膜结构及其功能 提高植物对 高温胁迫的适应性 22 有研究表明 脯氨酸的积 累与茄子的耐热性呈显著正相关 23 适宜浓度 CaCl 2 处理能促进高温胁迫下百合脯氨酸和可溶 性蛋白的大量积累 而 EGTA 处理明显降低百合 脯氨酸和可溶性蛋白含量 12 短期热胁迫下 Ca 2 处理可使番茄幼苗及其悬浮培养细胞内的脯氨酸 含量增加 而 EGTA 或 La 3 处理却使脯氨酸含量 下降 13 本研究中 CaCl 2 处理能显著或极显著 增加高温胁迫下蝴蝶兰幼苗叶片的可溶性蛋白 质 脯氨酸 可溶性糖积累 而 EGTA 和 LaCl 3 处理极显著降低脯氨酸含量 LaCl 3 处理显著降低 可溶性糖含量 表明 Ca 2 信号主要是通过参与调 节高温胁迫下蝴蝶兰幼苗脯氨酸合成和积累来缓 解高温对其的伤害 高温胁迫下 CaCl 2 处理显著 增加了蝴蝶兰幼苗叶片的可溶性蛋白含量 而 EGTA 和 LaCl 3 处理不同程度地降低了可溶性蛋 白含量 这可能是由于 Ca 2 能促进热激蛋白基因 表达和热激蛋白合成 而 EGTA 和 LaCl 3 却能降 低热激蛋白基因表达和热激蛋白合成所致 2 10 热激蛋白合成 能维持蛋白质的稳态 保护细胞 免受高温伤害 2 叶绿素是植物吸收光能的主要物质 直接影 响植物光合作用的光能利用 24 类胡萝卜素除吸 收光能外 还可作为细胞内的抗氧化剂 起吸收 过剩光能 猝灭活性氧 防止膜脂过氧化作用 22 高温胁迫下 适宜浓度的 Ca 2 处理能减轻花生幼 苗的光系统损伤 增加光合膜的稳定性 25 显著 增加皖贝母叶片叶绿素和类胡萝卜素含量 明显 提高光合效率 22 研究发现 CaCl 2 处理能减缓 高温胁迫下百合叶片的叶绿素降解 使叶绿素含 量始终高于对照 而 EGTA 和 CaM 抑制剂三氟拉 嗪 TFP 处理却促进叶绿素的降解 使叶绿素 含量始终低于对照 12 本研究中 CaCl 2 处理极 显著增加了高温胁迫下蝴蝶兰幼苗叶片的叶绿素 和类胡萝卜素含量 而 EGTA 和 LaCl 3 处理不同 程度地降低了叶绿素和类胡萝卜素含量 说明 CaCl 2 处理提高了高温胁迫下蝴碟兰的光合能力 有利于增强蝴蝶兰幼苗对高温的适应性 而 EGTA 和 LaCl 3 处理降低了光合产物的合成 减弱 了蝴蝶兰幼苗对高温的耐受性 说明 Ca 2 信号可 通过参与调节光合色素的代谢过程来调控蝴蝶兰 幼苗耐热性的形成 综上所述 本研究初步认为 Ca 2 信号可通 过参与调节抗氧化酶活性 脯氨酸和光合色素代 谢过程来增强蝴蝶兰幼苗的耐热性 但有关 Ca 2 信号调控蝴蝶兰幼苗耐热性的形成机制有待于从 分子机制上进一步加以揭示 参考文献 1 Hashimoto K Kudla J Calcium decoding mechanisms in plants J Biochimie 2011 93 12 2054 2059 2 药欣荣 高 巍 张金霞 等 高温胁迫下糙皮侧耳胞内 钙离子对 热激蛋 白基因表 达的调 控 J 食用菌学 报 2019 26 2 17 23 第 2 期 杨华庚等 外源钙及其抑制剂对蝴蝶兰幼苗耐热性的影响 441 3 齐明芳 王 丹 齐红岩 等 钙处理对高温胁迫下番茄 幼苗光合及钙含量的影响 J 沈阳农业大学学报 2015 46 3 277 283 4 周人纲 热激信号转导中的钙 钙调素途径 J 华北农学 报 2003 S1 24 29 5 孙宪芝 郭先锋 郑成淑 等 高温胁迫下外源钙对菊花 叶片光合机构与活性氧清除酶系统的影响 J 应用生态 学报 2008 19 9 1983 1988 6 陈贵 林 贾开 志 钙和 钙调 素拮抗 剂对 高温 胁迫下 茄子 幼 苗抗氧化系统的影响 J 中国农业科学 2005 38 1 197 202 7 张宗申 利容 千 王建波 外源 Ca 2 La 3 和 EGTA 处理 对辣椒叶片热激反应的影响 J 武汉大学学报 自然科学 版 2000 46 2 253 256 8 张宗申 利容千 王建波 Ca 2 预处理对热胁迫下辣椒叶 肉细胞中 Ca 2 ATP 酶活性的影响 J 植物生理学报 2001 27 6 451 454 546 9 徐坤鹏 齐明芳 李天来 等 钙及其抑制剂对亚高温逆 境条件下番茄秧苗的调控 J 北方园艺 2010 6 8 12 10 李 冰 周人纲 钙 钙调素信号系统参与热激信号转导 的研究 J 西北植物学报 2004 24 7 1322 1328 11 Gong M Chen S N Song Y Q et al Effect of calcium and calmodulin on intrinsic heat tolerance in relation to antioxi dant systems in maize seedlings J Australian Journal of Plant Physiology 1997 24 3 371 379 12 张铭顺 吕福 堂 褚鹏飞 等 外源 Ca 2 提高百 合耐热性 的生理机制初探 J 河南农业科学 2019 48 2 120 125 13 De B Bhattacharjee S Mukherjee A K Short term heat and cold shock induced proline accumulation in relation to cal cium involvement 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责任编辑 谢龙莲