柠檬色百合实时荧光定量PCR内参基因筛选.pdf

中国农业大学学报 2 0 2 3 2 8 2 5 9 7 3 J o u r n a l o f C h i n a A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y h t t p z g n y d x x b i j o u r n a l s c n 梁蕤 徐雷锋 毕蒙蒙 王静 唐玉超 郝泽慧 刘一洁 杨盼盼 明军 杜方 柠檬色百合实时荧光定量P C R内参基因筛选 J 中国农业大学学报 2 0 2 3 2 8 0 2 5 9 7 3 L I A N G R u i X U L e i f e n g B I M e n g m e n g W A N G J i n g T A N G Y u c h a o H A O Z e h u i L I U Y i j i e Y A N G P a n p a n M I N G J u n D U F a n g V a l i d a t i o n o f r e f e r e n c e g e n e s f o r q u a n t i t a t i v e r e a l t i m e P C R i nLiliumleichtlinii J JournalofChinaAgriculturalUniversity 2 0 2 3 2 8 0 2 5 9 7 3 D O I 1 0 1 1 8 4 1 j i s s n 1 0 0 7 4 3 3 3 2 0 2 3 0 2 0 6 柠檬色百合实时荧光定量PCR内参基因筛选 梁蕤1 3 徐雷锋3 毕蒙蒙3 王静3 唐玉超3 郝泽慧3 4 刘一洁3 5 杨盼盼3 明军3 杜方2 1 山西农业大学园艺学院 山西太谷0 3 0 8 0 1 2 山西农业大学城乡建设学院 山西太谷0 3 0 8 0 1 3 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 北京1 0 0 0 8 1 4 北京农学院园林学院 北京1 0 2 2 0 6 5 青岛农业大学园林与林学院 山东青岛2 6 6 1 0 9 摘 要 为筛选柠檬色百合 Liliumleichtlinii 实时荧光定量P C R稳定的内参基因 以柠檬色百合不同发育时期 花被片 根 茎 叶和鳞片为试验材料 测定比较总类胡萝卜素含量 使用R T P C R和荧光定量P C R检测9个候选 内参基因 AP4 Actin TUB CYP eIF GAPDH RH2 UBC和18S 特异性及表达水平 利用g e N o r m N o r m F i n d e r B e s t k e e p e r C T程序和R e f F i n d e r网站综合评估候选内参基因表达稳定性 选用八氢番茄红素酶基 因PSY对内参基因稳定性进行验证 最终确定合适且稳定的内参基因 结果表明 1 柠檬色百合花被片发育过程 中Actin和AP4为9个候选内参基因中最稳定的内参基因 UBC为最不稳定的内参基因 2 柠檬色百合不同器 官间eIF和AP4为候选内参基因中最稳定的内参基因 18S为最不稳定的内参基因 3 在柠檬色百合花被片发 育过程和不同器官间 以筛选出最稳定的内参基因为参照计算所得PSY基因表达情况与实际测得总类胡萝卜素 含量变化趋势一致 以筛选出最不稳定的内参基因作为参照计算所得PSY基因表达情况与总类胡萝卜素含量变 化趋势不同甚至相反 研究表明在试验中不能随意使用内参基因 需要在使用前对其进行筛选 评价和验证 同时 研究结果为柠檬色百合花被片发育过程和不同器官间基因表达分析提供了稳定的内参基因 关键词 柠檬色百合 实时荧光定量P C R 内参基因 类胡萝卜素 中图分类号 S 6 8 2 2 文章编号 1 0 0 7 4 3 3 3 2 0 2 3 0 2 0 0 5 9 1 5 文献标志码 A 收稿日期 2 0 2 2 0 8 2 2 基金项目 山西省基础研究计划 自由探索类 自然科学研究面上项目 2 0 2 1 0 3 0 2 1 2 3 4 1 6 国家自然科学基金项目 3 2 1 7 2 6 2 4 3 1 8 0 1 8 9 9 山西农业大学横向科技 合作项目 2 0 2 1 N Y G G 1 1 1 第一作者 梁蕤 0 0 0 0 0 0 0 3 0 9 9 1 5 8 7 5 硕士研究生 E m a i l l r u i 1 1 1 8 1 6 3 c o m 通讯作者 杜方 0 0 0 0 0 0 0 3 4 8 5 3 7 7 8 2 教授 主要从事花卉种质资源利用及分子生物学研究 E m a i l d f 7 3 0 2 2 7 y e a h n e t 明军 0 0 0 0 0 0 2 2 9 4 9 6 1 9 9 研究员 主要从事花卉育种及分子生物学研究 E m a i l m i n g j u n c a a s c n Validationofreferencegenesforquantitativereal timePCR inLiliumleichtlinii LIANGRui1 3 XULeifeng3 BIMengmeng3 WANGJing3 TANGYuchao3 HAOZehui3 4 LIUYijie3 5 YANGPanpan3 MINGJun3 DUFang2 1 CollegeofHorticulture ShanxiAgriculturalUniversity Taigu030801 China 2 CollegeofUrbanandRuralConstruction ShanxiAgriculturalUniversity Taigu030801 China 3 InstituteofVegetablesandFlowers ChineseAcademyofAgriculturalSciences Beijing100081 China 4 CollegeofLandscapeArchitecture BeijingUniversityofAgriculture Beijing102206 China 5 CollegeofLandscapeArchitectureandForestry QingdaoAgriculturalUniversity Qingdao266109 China 中国农业大学学报2 0 2 3年第2 8卷 Abstract Inordertoselectandvalidatethereal timePCRreferencegenesstablyexpressedinLiliumleichtlinii tepals indifferentstages root stem leafandscaleweretakenasstudyobjects Thisstudymeasuredandcomparedthe totalcarotenoidscontents analyzedthespecificityandtheexpressionlevelsofAP4 Actin TUB CYP eIF GAPDH RH2 UBCand18SinL leichtliniibyRT PCRandqRT PCR GeNorm NormFinder Bestkeeper CTand RefFinderwereusedtoevaluateexpressionstabilityofthesecandidatereferencegenes PSYgenewasusedtoverify thestabilityofreferencegenes Theresultsshowedthat IntepalsduringdevelopmentofL leichtlinii AP4andActin werethemoststablegenesandUBCwastheleaststablegeneamong9candidatereferencegenes Indifferent tissues eIFandAP4werethemoststable 18Swasthemostunstable Inaddition theexpressionlevelsofPSY calculatedusingthemoststablereferencegeneswereconsistentwiththetrendoftotalcarotenoidscontentsduring tepaldevelopmentprocessandatdifferenttissues TheexpressionlevelofPSYcalculatedusingunstablereference geneswasdifferentandevenoppositetothetrendoftotalcarotenoidscontents Inconclusion referencegenesshould notbeusedrandomlyintest andtheyneedtobeevaluatedandverifiedbeforeuse Thisstudyprovidedthestable referencegenesfortheanalysisofgeneexpressionduringtepaldevelopmentanddifferenttissuesinL leichtlinii Keywords Liliumleichtlinii reversetranscriptionreal timepolymerasechainreaction referencegene carotenoid 花色是观赏园艺植物最重要的观赏性状之一 其主要由类黄酮 类胡萝卜素 甜菜色素和叶绿素这 4大类化合物构成 其中 类黄酮和类胡萝卜素是百 合花色的主要呈色物质 1 相比于类黄酮代谢研 究 类胡萝卜素代谢研究较少 2 3 且类胡萝卜素代 谢更为复杂 类胡萝卜素既作为色素在花和果实中 积累呈色 也参与光合作用 参与植物生长发育和调 控激素水平 4 产自日本的柠檬色百合 Lilium leichtlinii 属于百合科百合属 其花被片背景富含 类胡萝卜素呈柠檬黄色 花1 5朵下垂 开放时花 被片向上反卷 具有极高的观赏价值 是研究百合类 胡萝卜素花色呈色机理的优选材料 5 在以柠檬色百合为试验材料揭示百合类胡萝卜 素分子调控机理的过程中 检测类胡萝卜素代谢关 键基因表达是必不可少的环节 常规检测基因表达 的方法有N o r t h e r n杂交 N o r t h e r n b l o t t i n g 半定 量R T P C R S e m i q u a n t i t a t i v e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n 实时荧光定量P C R R e v e r s e t r a n s c r i p t i o n r e a l t i m e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n q R T P C R 微阵列分析 M i c r o a r r a y s a n a l y s i s 转录组测序 R N A s e q u e n c i n g 和原位杂 交 I n s i t u h y b r i d i z a t i o n I S H 等 6 7 其中q R T P C R技术凭借其高准确度 高灵敏度 高通量和操 作方便等优点被广泛应用 8 该技术支持绝对定量 分析和相对定量分析 绝对定量常用来探究单个样 品的本质属性 相对定量常用来比较多个样本间某 一特定性质 6 9 试验中通常运用相对定量探究不 同样本间同一基因表达情况 相对定量分析的准确 性受到R N A质量和完整性 反转录效率和扩增效 率等因素的影响 1 0 因此 需要使用1个或多个稳 定内参基因 R e f e r e n c e g e n e s 对目的基因的表达进 行均一化 1 1 1 3 内参基因指的是在各个样品中表达恒定的基 因 1 4 其稳定性和可靠性直接关系到目的基因表达 检测结果的准确性和整体试验研究的可靠性 在不 同百合种 品种 花发育过程 花被片不同部位 不 同器官及不同处理下 大多使用Actin或GAPDH Glyceraldehyde 3 phosphatedehydrogenase 作为内 参基因 1 5 2 0 在研究百合体细胞胚的生长发育过程时 也用到FP F boxfamilyprotein 作为内参基因 2 1 但几种常用内参基因在百合不同组织器官间 花发育 过程 花遮光处理及叶 鳞片和根胁迫处理中的稳定 性是可能变化的 因此 具体百合种 品种 及研究条 件下仍需重新筛选稳定适宜的内参基因 2 2 2 3 本研究根据前期建立的转录组数据库和已报道 的百合内参基因 选取了9个候选内参基因 使用 g e N o r m N o r m F i n d e r C T B e s t k e e p e r程序和 R e f F i n d e r网站比较分析这9个候选内参基因在柠 檬色百合花被片发育过程和不同器官间的表达情 况 并对候选内参基因稳定性进行评估排序 为检 验内参基因评估的准确性 本研究以筛选出最稳定 的内参基因和最不稳定的内参基因作为参照 检测 了八氢番茄红素酶基因PSY Phytoenesynthase 表达情况 P S Y作为类胡萝卜素代谢途径的第1 个限速酶 在植物花 叶 果实和根等不同器官中 PSY基因表达的情况直接决定总类胡萝卜素含量 的积累 1 6 2 4 2 7 因此 本试验将PSY基因在柠檬色 百合花被片发育过程和不同器官间表达情况与对应 06 第2期梁蕤等 柠檬色百合实时荧光定量P C R内参基因筛选 的总类胡萝卜素含量变化趋势结合 用来验证候选 内参基因的稳定性 本研究旨在综合多个程序网站 评估候选内参基因稳定性 通过检测总类胡萝卜素 积累和PSY基因表达验证内参基因稳定性 最终确 定柠檬色百合花被片发育过程和不同器官间适宜稳 定的内参基因 以期为百合类胡萝卜素的研究提供 理论基础 1 材料与方法 1 1 试验材料 以柠檬色百合 L leichtlinii 为试验材料 种 植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所资源圃内 依 照花蕾颜色变化和花被片发育2项指标进行取材 花被片发育第1时期 S 1 花色转变前期 花蕾长 约5 5 c m 整体呈绿色 取其绿偏黄色内花被片作 为试材 花被片发育第2时期 S 2 花开放前一天 花蕾整体柔软 不紧实 呈鲜艳柠檬黄色 花蕾中部 膨大 有张开趋势 取其柠檬黄色内花被片作为试 材 花被片发育第3时期 S 3 花开放当天 花被片 向上反卷 取其反卷的柠檬黄色内花被片作为试材 图1 a c 同时 取开放当天内花被片 叶 茎 鳞片和根作为不同器官试验材料 图1 d h 每个样品设3个生物学重复 样品经液氮速 冻后存于 8 0 超低温冰箱备用 a 第1时期 花色转变前期 b 第2时期 花开放前一天 c 第3时期 花开放当天 d 花 e 叶 f 茎 g 外层鳞片 h 根 标尺 2 c m a S t a g e 1 e a r l y p h a s e o f c o l o r t r a n s i t i o n b S t a g e 2 t h e d a y b e f o r e a n t h e s i s c S t a g e 3 0 d a y p o s t a n t h e s i s d F l o w e r e L e a f f S t e m g T h e o u t e r s c a l e h R o o t S c a l e 2 c m 图1 柠檬色百合不同发育时期的花和不同器官 F i g 1 F l o w e r s i n d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s a n d d i f f e r e n t t i s s u e s o fLiliumleichtlinii 1 2 总类胡萝卜素含量测定 将超低温保存的柠檬色百合内花被片 叶 茎 鳞片和根样品冷冻干燥后用研磨仪研磨 称取 0 0 1 5 g干样溶于1 m L提取液 V 正己烷 V 丙 酮 V 乙醇 2 1 1 包含质量浓度为0 0 1 的2 6 二叔丁基对甲酚 B H T 中 涡旋3 0 s 置于 2 5 超声波清洗仪振荡2 0 m i n 之后4 离心 5 m i n 1 2 0 0 0 r m i n 收集上清避光保存 对沉淀 重复上述步骤 收集上清 用提取液定容至5 m L 用 0 2 2 m有机滤膜过滤后 取3 m L于紫外分光光 度计4 4 0 6 4 5和6 6 3 n m波长下检测吸光值 每个 样品3个生物学重复 2 8 总类胡萝卜素含量根据 莫玉楠等 2 9 的方法进行计算 1 3 候选内参基因选择及引物序列 文献检索分析L i等 2 2 和X u等 2 3 合成的百合 内参基因引物 AP 4complexsubunit AP4 N C B I 登录号 K P 8 6 1 8 7 8 Beta tubulin1 TUB N C B I 登录号 K P 8 6 1 8 7 5 Cyclophilin CYP Eukaryotic 16 中国农业大学学报2 0 2 3年第2 8卷 initiationfactor1 eIF N C B I登录号 K P 8 6 1 8 7 4 Glyceraldehyde 3 phosphatedehydrogenase1 GAPDH N C B I登录号 K P 1 7 9 4 1 7 1 DEADboxRNA helicase RH2 N C B I登录号 K P 8 6 1 8 8 0 和18S RibosomalRNA 18S N C B I登录号 A Y 6 8 4 9 2 7 1 同时在已有柠檬色百合转录组数据库中对所有 U n i g e n e不同样本的f p k m值进行标准差分析 在 f p k m值高且标准差小的U n i g e n e中搜索常用内参 基因 最终筛选出Actin2 Actin N C B I登录号 O P 5 3 9 3 1 0 和Ubiquitin conjugatingenzymeE22 UBC N C B I登录号 O P 5 3 9 3 1 1 2个常用内参基 因 所有内参基因引物序列如表1所示 PSY引物 序列参照W a n g等 1 6 的设计 F C C A G A G T C C C G T G C A T C G A C R A T A T C G T C C T C T G A A A G G C C 引物由上海生工生物工程股份有限公司 合成 表1 候选内参基因qRT PCR的引物序列和扩增参数 T a b l e 1 P r i m e r s e q u e n c e s a n d a m p l i f i c a t i o n p a r a m e t e r s f o r c a n d i d a t e r e f e r e n c e g e n e s 基因 简称 G e n e 基因名称 G e n e n a m e 引物序列 5 3 P r i m e r s e q u e n c e 5 3 斜率 S l o p e 扩增效率 A m p l i f i c a t i o n e f f i c i e n c y 相关系数 R e g r e s s i o n c o e f f i c i e n t AP4AP 4complexsubunitF G A T G G G G C T T C T T T A T A C G G T R T C A T T A C A G C A A A C T C T C C C T C T 3 4 0 5 5 9 6 6 3 0 9 9 5 5 ActinActin2F A G G C T A C A C T T T C A C G A C T A C T G R A G G A C C T C T G G G C A T C T A A 3 5 1 0 9 9 2 6 8 0 9 9 3 4 TUBBeta tubulin1 F C T A T G A C A T C T G T T T C C G C A C T C R A G C G A T A C T G T T G G G A G C C T 3 4 6 0 8 9 4 5 1 0 9 9 6 8 CYPCyclophilinF C C C G A A T A C G A A T G G C T C A R C A A T C A C C A C C T T G G C A G A A 3 2 5 2 5 1 0 2 9 8 0 9 9 2 5 eIFEukaryoticinitiation factor1 F T A T G G T G A G C T T C C T G A C A A C G T R T C A C A A A G A C A G T A A C A A C A G C G A T 3 3 9 2 1 9 7 1 5 0 9 9 7 0 GAPDH Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase1 F G C T G C A A G T T T C A A C A T T A T T C C R A T C C T C A T C A G T A T A A C C A A G A 3 5 5 7 8 9 1 0 2 0 9 9 6 4 RH2DEADboxRNAhelicaseF C C G A G A C C A G T T C G T T C A R A C A A T A G G A C C A T C C C C A T 3 4 7 7 6 9 3 8 9 0 9 8 8 4 UBCUbiquitin conjugatingenz ymeE22 F C T G C A A C A G G G A G A A T G C A G R T G G A A G A T C A A C C C A T G C A G 3 5 2 5 5 9 2 1 5 0 9 9 5 9 18S18SRibosomalRNAF C G T T T C G G G C A T G A T T T G T G G R T C G C A T T T C G C T A C G T T C T T C 3 4 0 2 9 9 6 7 3 0 9 9 6 3 1 4 总RNA提取和cDNA第1链合成 使用R N A p r e p P u r e多糖多酚植物总R N A提 取试剂盒 天根生化有限公司 提取柠檬色百合内花 被片 叶 茎 鳞片和根的R N A 并将不同样本的 R N A均稀释为相同浓度 1 1 0 0 n g L 使用 H i f a i r I I 1 s t S t r a n d c D N A S y n t h e s i s S u p e r M i x f o r q P C R g D N A d i g e s t e r p l u s 翊圣生物科技股份 有限公司 进行反转录 用E A S Y D i l u t i o n f o r R e a l 26 第2期梁蕤等 柠檬色百合实时荧光定量P C R内参基因筛选 T i m e P C R T a k a r a 进行c D N A稀释 为检测引 物扩增效率 将叶的c D N A原液依次稀释5倍并设 置5个浓度梯度 分别为叶c D N A原液的5 1 5 2 5 3 5 4和5 5倍 将不同样本c D N A原液稀释5 倍使用 每个样本均为3个生物学重复 1 5 候选内参基因RT PCR扩增和qRT PCR反应 以柠檬色百合叶c D N A为模板 进行R T P C R 扩增 扩增体系为 总体积1 0 0 L 其中2 T a q P C R M a s t e r M i x 5 0 L p r i m e r F 1 0 M 0 5 L p r i m e r R 1 0 M 0 5 L c D N A 1 0 L d d H 2 O 3 0 L 反应条件为 9 4 初始变性5 m i n 9 4 变性3 0 s 5 6 退火3 0 s 7 2 延伸2 0 s 3 5个循 环 7 2 最后延伸1 0 m i n 得到的P C R产物经 2 0 琼脂糖凝胶电泳检测 在B I O R A D凝胶成像 仪观察拍照 以柠檬色百合叶5个浓度梯度的c D N A及不 同样本c D N A为模板 在B I O R A D C F X 9 6实时荧 光定量P C R仪中对不同内参基因及PSY基因进行 三步法荧光定量 扩增体系 总体积2 0 0 L 其中 q P C R S Y B R G r e e n M a s t e r M i x 1 0 0 L p r i m e r F 1 0 M 0 4 L p r i m e r R 1 0 M 0 4 L c D N A 2 0 L d d H 2 O 7 2 L 反应条件为 9 5 预变性 5 m i n 9 5 变性1 0 s 5 6 退火2 0 s 7 2 延伸 3 0 s 4 0个循环 熔解曲线程序为 6 5 9 5 每 5 s升温0 5 反应结束后由C F X M a n a g e r软件生成熔解曲 线 根据熔解曲线分析候选内参基因引物特异性 根据各内参基因在不同柠檬色百合叶c D N A梯度 下CT值绘制标准曲线并计算斜率 k 扩增效率 E 和线性相关系数 R2 利用C F X M a n a g e r软件 G e n e S t u d y程序中P f a f f l方法计算基于单个内参 基因的PSY相对表达量 运用V a n d e s o m p l e方法 计算基于多个内参基因的PSY相对表达量 使用 S P S S分析PSY相对表达情况与总类胡萝卜素积累 间斯皮尔曼相关性 1 6 数据分析及候选内参基因稳定性评价 整理全部样本中候选内参基因CT值 使用 g e N o r m N o r m F i n d e r C T B e s t k e e p e r程序和 R e f F i n d e r网站 h t t p s w w w h e a r t c u r e c o m a u r e f f i n d e r t y p e r e f e r e n c e 分析柠檬色百合花被 片发育过程和不同器官间候选内参基因的表达稳 定性 g e N o r m程序将循环数转换为基因相对表达 量 即将所有CT值转换为2 C T CT 各CT值 最 小CT值 通过计算候选内参基因表达稳定值 M 来评估 M值与稳定性呈负相关 M值越小 稳定 性越高 若M值超过1 5即认定该基因不适合作内 参基因 之后计算出标准化所需的最佳内参基因数 量 程序默认值为Vn n 1 0 1 5 当Vn n 1即视为不 稳定内参基因 同时将所有输入候选内参基因组成 1个B e s t k e e p e r指数 计算每个候选内参基因和 B e s t k e e p e r指数之间的相关性 通过皮尔逊相关系 数 r 决定系数 r2 和显著水平P值 P 描述候选 内参基因与B e s t k e e p e r指数之间的关系 1 4 最后依托R e f F i n d e r在线网站基于以上4个程 序结果 给每个候选内参基因分配1个适当权重 并 计算它们权重的几何平均值 以获得最终的整体 排名 3 3 2 结果与分析 2 1 总类胡萝卜素含量 在柠檬色百合花被片中 随着生长发育 花被片 背景颜色由绿变黄 积累的总类胡萝卜素含量增加 图2 a 柠檬色百合叶子为绿色 茎和鳞片表面 附着浅紫色 根为乳白色 总类胡萝卜素在不同器官 间积累依次为 花被片 叶 茎 根 鳞片 且根和 鳞片中含量极少 图2 b 2 2 引物特异性及扩增效率 以柠檬色百合叶c D N A为模板 用9个候选内 参基因的引物进行R T P C R扩增 电泳图显示片段 大小正确 条带单一 均无引物二聚体 图3 a 以5个浓度梯度的柠檬色百合叶c D N A为模板 进 行q R T P C R反应 结果显示 熔解曲线均为单一信 号峰 且同一样品重复性好 表明9个候选内参基因 36 中国农业大学学报2 0 2 3年第2 8卷 引物特异性高 图3 b j 根据q R T P C R反 应所得CT值绘制标准曲线 9个候选内参基因的相 关系数R2介于0 9 8 8 4 0 9 9 7 0之间 扩增效率 介于9 1 0 2 1 0 2 9 8 之间 表1 同一图中不同字母表示差异显著 P 0 0 5 0 W i t h i n t h e s a m e g r a p h d i f f e r e n t l e t t e r s r e p r e s e n t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s P 0 0 5 0 图2 总类胡萝卜素含量 F i g 2 T o t a l c a r o t e n o i d c o n t e n t 2 3 表达水平分析 利用所有样本中得到的CT值可以预测9个候 选内参基因的表达水平 CT值越低 表达丰度越 高 9个候选内参基因在花被片发育过程和不同器 官间的CT值分布见图4 结果表明 18S表达丰度 最高 eIF和UBC的表达水平变异最小 2 4 稳定性分析 将g e N o r m和N o r m F i n d e r结果按照M值排 序 C T结果按照平均标准偏差排序 B e s t k e e p e r 结果中 按S D从小到大 C V从低到高依次进行稳 定性排序 同时考虑候选内参基因与B e s t k e e p e r指 数间r和P值 若2个内参基因间S D值相近 C V 值也相近 则将r值低的内参基因排在后面 若候选 内参基因S D 1则视为不稳定内参基因 候选内参 基因与B e s t k e e p e r指数间P 0 0 5也视为不稳定 内参基因 表2 由于不同程序算法不同 所得结果并不一致 用 R e f F i n d e r网站对上述程序结果进行综合分析确定 最终内参基因稳定性排序 2 4 1 柠檬色百合花被片发育过程中候选内参基 因稳定性分析 柠檬色百合花被片发育过程所得B e s t k e e p e r 结果中 虽然UBC的S D最小 C V最低 但其与相 应B e s t k e e p e r指数相关系数的P值为0 5 0 7 远大 于0 0 5 0 表明UBC与B e s t k e e p e r指数不相关 而 其余8个候选内参基因与B e s t k e e p e r指数相关系 数的P值均为0 0 0 1 r值在0 8 7 6 0 9 9 6之间 表 明这8个候选内参基因与B e s t k e e p e r指数间相关 性强且呈极显著相关 说明在柠檬色百合花被片发 育过程中 UBC与其它候选基因存在较大差异 不 适合作内参基因 CYP的S D值 1 0 0 为不稳定 内参基因 表2 g e N o r m计算最稳定的内参基因为AP4和 TUB 图5 a N o r m F i n d e r计算最稳定的内参基 因为 TUB 图5 c C T计算最稳定的内参基因 为Actin 图5 d B e s t k e e p e r计算最稳定的内参 基因为eIF 表2 综合以上4个程序的结果判断最 不稳定的内参基因为UBC g e N o r m程序默认 Vn n 1 0 1 5 柠檬色百合花被片发育过程中计算 得V2 3配对变异系数为0 0 6 小于0 1 5 故柠檬色 百合花被片发育过程中荧光定量标准化所需的最佳 内参基因数为2 图5 b R e f F i n d e r综合以上4 个程序分析结果 计算得柠檬色百合花被片发育过 程最稳定的内参基因为Actin和AP4 表3 2 4 2 柠檬色百合不同器官间候选内参基因稳定 性分析 柠檬色百合不同器官间所得B e s t k e e p e r计算 结果中 9个候选基因与相应B e s t k e e p e r指数间显 著相关 TUB和18S的S D 1 0 0 为不稳定内 参基因 表2 g e N o r m计算最稳定的内参基因为 46 第2期梁蕤等 柠檬色百合实时荧光定量P C R内参基因筛选 AP4和Actin 图6 a N o r m F i n d e r和 C T计算 最稳定的内参基因为eIF 图6 c 和 d B e s t k e e p e r计算最稳定的内参基因为AP4 表2 g e N o r m程序计算的V2 3配对变异系数为0 1 5 故 至少需要2个内参基因用于柠檬色百合不同器官间 标准化 图6 b 根据R e f F i n d e r综合分析 计算 得柠檬色百合不同器官间最稳定的内参基因为eIF 和AP4 最不稳定的内参基因为18S 表3 R F U 相对荧光定量值 R F U R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s 图3 候选内参基因引物特异性 F i g 3 A m p l i f i c a t i o n s p e c i f i c i t y o f p r i m e r s 56 中国农业大学学报2 0 2 3年第2 8卷 中间横线表示中位数 T h e m i d d l e h o r i z o n t a l l i n e i s t h e m e d i a n 图4 9个候选内参基因的CT值分布图 F i g 4 D i s t r i b u t i o n o fCTv a l u e s o f c a n d i d a t e r e f e r e n c e g e n e s i n a l l s a m p l e s 表2 Bestkeeper分析候选内参基因稳定性 T a b l e 2 E x p r e s s i o n s t a b i l i t y v a l u e s o f c a n d i d a t e r e f e r e n c e g e n e s c a l c u l a t e d b y B e s t k e e p e r 基因 G e n e 花被片发育过程中 T e p a l s a t d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s 不同器官D i f f e r e n t t i s s u e s 标准偏差 S t a n d a r d d e v i a t i o n 变异系数 C o e f f i c i e n t o f v a r i a n c e P值 Pv a l u e 皮尔逊 相关系数 P e a r s o n c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t 标准偏差 S t a n d a r d d e v i a t i o n 变异系数 C o e f f i c i e n t