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南 京 农 业 大 学 学 报 收 稿 日 期 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 作 者 简 介 汤 淑 亚 硕 士 研 究 生 通 信 作 者 蒋 春 号 副 教 授 研 究 方 向 为 植 物 病 害 生 物 防 治 有 益 微 生 物 与 植 物 互 作 分 子 机 制 研 究 与 生 物 农 药 创 制 及 绿 色 植 保 汤 淑 亚 李 子 桀 侯 启 华 等 转 录 因 子 调 控 蜡 质 芽 胞 杆 菌 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 系 统 抗 性 作 用 机 制 研 究 南 京 农 业 大 学 学 报 转 录 因 子 调 控 蜡 质 芽 胞 杆 菌 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 系 统 抗 性 作 用 机 制 研 究 汤 淑 亚 李 子 桀 侯 启 华 郭 坚 华 蒋 春 号 南 京 农 业 大 学 生 物 农 药 与 绿 色 植 保 实 验 室 江 苏 南 京 摘 要 目 的 本 文 旨 在 探 索 蜡 质 芽 胞 杆 菌 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 系 统 抗 性 的 机 制 为 青 枯 病 的 生 物 防 治 提 供 理 论 依 据 方 法 通 过 检 测 预 处 理 后 番 茄 植 株 中 防 御 相 关 基 因 相 对 表 达 量 的 变 化 验 证 可 诱 导 番 茄 系 统 抗 性 通 过 转 录 组 测 序 分 析 探 究 预 处 理 后 番 茄 抗 病 相 关 基 因 的 转 录 水 平 变 化 筛 选 获 得 参 与 诱 导 系 统 抗 性 的 相 关 基 因 利 用 证 实 基 因 在 诱 抗 过 程 中 的 差 异 表 达 利 用 技 术 构 建 沉 默 番 茄 植 株 并 开 展 诱 导 番 茄 对 青 枯 菌 抗 性 表 型 验 证 观 察 并 统 计 发 病 率 病 情 指 数 计 算 防 效 利 用 亚 细 胞 定 位 转 录 活 性 检 测 技 术 初 步 分 析 转 录 因 子 生 化 功 能 结 果 预 处 理 显 著 促 进 番 茄 植 株 生 长 与 清 水 对 照 相 比 处 理 番 茄 的 株 高 茎 粗 地 上 部 鲜 重 分 别 增 加 了 和 预 处 理 番 茄 可 调 节 防 御 基 因 表 达 触 发 番 茄 对 青 枯 病 系 统 抗 性 转 录 组 测 序 分 析 结 果 显 示 处 理 引 起 大 量 番 茄 植 株 基 因 表 达 水 平 变 化 筛 选 验 证 发 现 其 中 一 个 乙 烯 响 应 因 子 编 码 基 因 的 表 达 量 被 显 著 上 调 深 入 研 究 发 现 相 对 于 野 生 型 植 株 在 沉 默 番 茄 中 植 株 对 青 枯 病 的 敏 感 性 显 著 增 强 同 时 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 的 抗 性 表 型 显 著 下 降 进 一 步 研 究 确 定 是 作 为 一 种 转 录 因 子 参 与 调 控 植 物 对 青 枯 菌 抗 病 性 结 论 转 录 因 子 参 与 调 控 蜡 质 芽 胞 杆 菌 诱 导 番 茄 产 生 对 青 枯 病 系 统 抗 性 关 键 词 蜡 质 芽 胞 杆 菌 番 茄 青 枯 病 番 茄 转 录 因 子 诱 导 系 统 抗 性 基 因 功 能 分 析 中 图 分 类 号 文 献 标 志 码 文 章 编 号 第 期 汤 淑 亚 等 转 录 因 子 调 控 蜡 质 芽 胞 杆 菌 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 系 统 抗 性 作 用 机 制 研 究 番 茄 青 枯 病 是 由 茄 科 劳 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 细 菌 性 土 传 病 害 该 病 害 发 生 后 难 以 控 制 造 成 番 茄 大 面 积 枯 萎 死 亡 严 重 制 约 番 茄 生 产 的 果 实 产 量 和 品 质 目 前 传 统 防 治 措 施 效 果 不 稳 定 易 污 染 环 境 防 效 不 理 想 等 问 题 突 出 生 物 防 治 因 其 环 保 经 济 安 全 等 优 点 受 到 生 产 者 和 研 发 者 的 青 睐 在 农 业 生 产 中 得 到 了 广 泛 使 用 据 报 道 青 枯 病 的 生 物 防 治 措 施 主 要 包 括 植 物 源 活 性 物 质 和 微 生 物 菌 剂 的 利 用 其 中 已 报 道 的 微 生 物 菌 剂 主 要 有 无 致 病 力 青 枯 菌 假 单 胞 菌 属 和 芽 胞 杆 菌 属 细 菌 其 中 芽 胞 杆 菌 因 其 对 环 境 友 好 定 殖 能 力 强 贮 藏 期 长 等 特 质 成 为 农 业 生 产 中 应 用 最 多 的 生 防 细 菌 之 一 因 此 深 入 解 析 芽 胞 杆 菌 防 治 青 枯 病 的 作 用 机 制 对 青 枯 病 生 物 防 治 技 术 的 广 泛 应 用 具 有 深 远 意 义 研 究 表 明 芽 胞 杆 菌 可 通 过 产 生 抗 菌 蛋 白 抗 生 素 等 拮 抗 物 质 与 青 枯 菌 竞 争 碳 水 化 合 物 无 机 盐 等 营 养 物 质 或 通 过 诱 导 番 茄 产 生 系 统 抗 性 来 防 治 青 枯 病 植 物 系 统 获 得 性 抗 性 与 诱 导 系 统 抗 性 是 植 物 体 内 种 不 同 的 诱 导 抗 性 前 者 由 植 物 病 原 菌 诱 导 获 得 后 者 由 非 致 病 根 际 促 生 菌 诱 导 产 生 植 物 系 统 抗 性 的 产 生 是 由 于 的 刺 激 激 活 了 植 物 防 卫 反 应 并 通 过 某 种 途 径 将 这 一 反 应 扩 散 到 植 物 体 其 他 部 位 从 而 抵 御 病 原 菌 侵 染 研 究 发 现 如 果 植 物 预 先 与 枯 草 芽 胞 杆 菌 蜡 质 芽 胞 杆 菌 等 根 际 促 生 菌 接 触 则 可 诱 导 植 物 的 产 生 从 而 抵 御 青 枯 病 根 结 线 虫 病 晚 疫 病 等 病 害 的 侵 染 乙 烯 是 诱 导 系 统 中 的 重 要 信 号 分 子 等 发 现 乙 烯 信 号 突 变 型 植 株 失 去 了 被 荧 光 假 单 胞 杆 菌 诱 导 系 统 抗 性 的 能 力 证 明 机 制 的 建 立 与 乙 烯 信 号 通 路 密 切 相 关 乙 烯 响 应 因 子 是 超 家 族 蛋 白 研 究 表 明 转 录 因 子 可 调 控 乙 烯 反 应 基 因 表 达 从 而 调 节 乙 烯 的 生 物 合 成 和 信 号 传 导 但 转 录 因 子 是 否 参 与 芽 胞 杆 菌 诱 导 的 尚 不 清 楚 蜡 质 芽 胞 杆 菌 是 本 课 题 组 前 期 从 森 林 树 木 根 围 土 壤 中 分 离 的 一 株 植 物 根 际 促 生 细 菌 菌 株 通 过 诱 发 植 物 自 身 的 抗 病 潜 能 增 强 植 物 的 抗 病 性 从 而 高 效 防 治 多 种 病 害 前 期 通 过 对 蜡 质 芽 胞 杆 菌 防 治 植 物 病 害 的 机 制 进 行 系 统 性 研 究 发 现 关 键 作 用 机 制 是 诱 导 植 物 产 生 系 统 抗 病 性 贺 蝉 等 研 究 表 明 菌 株 激 活 通 路 诱 导 拟 南 芥 对 丁 香 假 单 胞 菌 番 茄 致 病 变 种 产 生 系 统 抗 性 等 研 究 表 明 菌 株 通 过 抑 制 和 激 活 介 导 的 拟 南 芥 基 础 免 疫 从 而 触 发 对 的 系 统 抗 性 本 课 题 组 前 期 研 究 发 现 菌 株 可 诱 导 番 茄 系 统 抗 性 抵 御 番 茄 青 枯 病 根 结 线 虫 病 等 病 害 的 侵 染 但 其 诱 导 番 茄 产 生 对 青 枯 病 的 抗 性 机 制 仍 有 待 研 究 本 研 究 通 过 转 录 组 学 分 析 技 术 对 调 控 诱 导 番 茄 对 青 枯 菌 系 统 抗 性 的 关 键 基 因 进 行 挖 掘 并 对 鉴 定 出 的 关 键 转 录 因 子 的 生 物 学 功 能 及 生 化 功 能 进 行 研 究 为 蜡 质 芽 胞 杆 菌 防 治 青 枯 病 的 生 防 机 制 研 究 奠 定 基 础 材 料 与 方 法 植 物 及 微 生 物 材 料 番 茄 种 子 经 表 面 消 毒 催 芽 后 播 种 于 穴 盘 中 待 番 茄 苗 生 长 至 四 真 叶 期 进 行 移 栽 每 个 盆 钵 种 植 株 移 栽 后 左 右 进 行 试 验 处 理 培 养 条 件 光 周 期 为 长 日 照 光 照 黑 暗 培 养 时 间 试 验 菌 株 及 质 粒 见 表 生 防 菌 蜡 质 芽 胞 杆 菌 在 液 体 培 养 基 配 方 酵 母 浸 粉 胰 蛋 白 胨 中 培 养 所 得 菌 液 于 离 心 用 水 调 至 备 用 青 枯 菌 在 液 体 培 养 基 配 方 酵 母 浸 粉 蛋 白 胨 葡 萄 糖 中 培 养 所 得 菌 液 于 离 心 用 水 调 至 备 用 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 表 试 验 菌 株 及 质 粒 菌 株 或 质 粒 用 途 来 源 菌 株 生 防 菌 文 献 基 因 克 隆 的 大 肠 杆 菌 农 杆 菌 广 泛 用 于 植 物 遗 传 转 化 实 验 和 瞬 时 表 达 文 献 番 茄 青 枯 病 病 原 菌 酵 母 菌 株 构 建 本 实 验 室 保 藏 质 粒 构 建 农 杆 菌 载 体 构 建 农 杆 菌 载 体 本 实 验 室 保 藏 构 建 沉 默 的 农 杆 菌 载 体 构 建 沉 默 的 农 杆 菌 载 体 本 研 究 构 建 转 录 活 性 测 定 的 酵 母 菌 株 载 体 本 实 验 室 保 藏 构 建 检 测 转 录 活 性 的 酵 母 菌 株 载 体 构 建 检 测 转 录 活 性 的 酵 母 菌 株 载 体 构 建 检 测 转 录 活 性 的 酵 母 菌 株 载 体 本 研 究 构 建 用 于 检 测 亚 细 胞 定 位 的 农 杆 菌 载 体 本 实 验 室 保 藏 构 建 检 测 亚 细 胞 定 位 的 农 杆 菌 载 体 本 研 究 番 茄 植 株 生 物 量 的 测 定 选 取 移 栽 后 长 势 一 致 的 植 株 分 别 向 每 盆 番 茄 根 部 灌 入 菌 液 对 照 组 以 等 体 积 的 清 水 代 替 每 个 处 理 株 次 生 物 学 重 复 处 理 后 用 卷 尺 游 标 卡 尺 以 及 天 平 测 量 番 茄 株 高 茎 粗 地 上 部 鲜 重 沉 默 接 种 及 沉 默 效 率 检 测 利 用 网 站 进 行 基 因 沉 默 片 段 的 筛 选 与 引 物 设 计 引 物 见 表 以 番 茄 为 模 板 利 用 引 物 进 行 扩 增 扩 增 后 的 片 段 经 过 双 酶 切 后 连 接 到 载 体 上 构 建 重 组 质 粒 利 用 电 转 化 的 方 法 将 阴 性 对 照 阳 性 对 照 以 及 质 粒 转 入 根 癌 农 杆 菌 中 利 用 筛 选 培 养 基 及 菌 落 技 术 筛 选 阳 性 转 化 子 使 用 甘 油 保 存 法 将 阳 性 转 化 子 保 存 于 根 癌 农 杆 菌 菌 株 在 液 体 培 养 基 中 培 养 离 心 收 集 菌 体 用 悬 浮 液 调 整 浓 度 为 然 后 将 重 悬 液 分 别 与 的 重 悬 液 按 体 积 比 混 合 均 匀 混 合 后 的 菌 液 在 常 温 静 置 或 振 荡 用 针 头 在 番 茄 子 叶 背 面 扎 几 个 小 孔 用 注 射 器 将 混 合 后 的 菌 液 沿 着 小 孔 注 射 入 番 茄 叶 片 在 阳 性 对 照 沉 默 植 株 出 现 白 化 表 型 后 注 射 后 左 右 每 个 处 理 取 个 重 复 分 别 提 取 并 进 行 反 转 录 得 到 的 片 段 以 作 为 内 参 基 因 采 用 半 定 量 鉴 定 沉 默 植 株 中 基 因 的 表 达 第 期 汤 淑 亚 等 转 录 因 子 调 控 蜡 质 芽 胞 杆 菌 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 系 统 抗 性 作 用 机 制 研 究 表 引 物 序 列 引 物 引 物 序 列 用 途 引 物 用 于 验 证 在 处 理 后 及 接 种 青 枯 菌 后 的 表 达 量 变 化 引 物 用 于 验 证 在 处 理 后 的 表 达 量 变 化 引 物 用 于 验 证 在 处 理 后 的 表 达 量 变 化 引 物 用 于 检 测 内 参 基 因 表 达 量 构 建 沉 默 载 体 用 于 构 建 沉 默 植 株 检 测 沉 默 效 率 构 建 载 体 用 于 检 测 是 否 具 有 转 录 活 性 构 建 载 体 用 于 检 测 是 否 具 有 转 录 活 性 构 建 载 体 用 于 检 测 是 否 具 有 转 录 活 性 构 建 载 体 用 于 检 测 亚 细 胞 定 位 番 茄 青 枯 病 温 室 防 效 试 验 设 置 处 理 组 和 清 水 对 照 组 选 择 移 栽 后 的 番 茄 植 株 每 株 灌 入 菌 液 以 等 体 积 的 清 水 作 为 对 照 每 个 处 理 株 次 生 物 学 重 复 预 处 理 后 向 处 理 组 和 对 照 组 番 茄 根 部 灌 入 青 枯 菌 液 观 察 并 统 计 各 处 理 番 茄 的 发 病 情 况 根 据 植 株 叶 片 萎 蔫 程 度 将 番 茄 青 枯 病 病 害 级 别 分 为 级 级 植 株 正 常 级 植 株 叶 片 萎 蔫 程 度 不 超 过 级 植 株 叶 片 萎 蔫 程 度 超 过 且 不 超 过 级 植 株 叶 片 萎 蔫 程 度 超 过 且 不 超 过 级 植 株 叶 片 萎 蔫 程 度 超 过 发 病 率 发 病 株 数 调 查 总 株 数 病 情 指 数 病 级 数 该 病 级 植 株 数 最 大 病 级 数 植 株 总 株 数 防 治 效 果 对 照 组 病 情 指 数 处 理 组 病 情 指 数 对 照 组 病 情 指 数 提 取 及 分 析 按 照 及 清 水 预 处 理 时 间 点 或 青 枯 菌 接 种 时 间 点 收 集 番 茄 叶 片 置 于 液 氮 速 冻 每 个 处 理 使 用 株 植 物 的 叶 片 次 生 物 学 重 复 利 用 法 提 取 叶 片 总 使 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 和 分 光 光 度 计 检 测 质 量 将 合 格 的 样 品 送 往 华 大 基 因 公 司 进 行 转 录 组 测 序 通 过 生 物 信 息 学 分 析 差 异 表 达 的 基 因 将 预 处 理 的 番 茄 叶 片 总 使 用 试 剂 盒 反 转 录 为 后 以 作 为 内 参 基 因 使 用 引 物 对 表 和 试 剂 盒 进 行 分 析 反 应 体 系 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 前 后 引 物 各 补 齐 至 反 应 程 序 共 个 循 环 采 用 方 法 计 算 基 因 相 对 表 达 量 亚 细 胞 定 位 分 析 利 用 与 试 剂 盒 构 建 重 组 质 粒 将 测 序 正 确 的 重 组 质 粒 和 空 载 体 质 粒 转 入 农 杆 菌 利 用 农 杆 菌 介 导 的 瞬 时 表 达 系 统 使 用 注 射 器 将 农 杆 菌 菌 液 注 入 烟 草 叶 片 中 处 理 后 的 烟 草 黑 暗 培 养 取 样 制 作 玻 片 使 用 蔡 司 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 亚 细 胞 定 位 情 况 具 体 参 照 张 悦 婧 等 的 方 法 进 行 烟 草 叶 片 瞬 时 表 达 转 录 激 活 活 性 检 测 为 了 研 究 的 转 录 激 活 活 性 并 确 定 激 活 域 将 基 因 分 为 部 分 利 用 同 源 重 组 酶 将 全 长 个 片 段 连 接 到 酵 母 表 达 载 体 上 构 建 重 组 质 粒 将 测 序 正 确 的 重 组 质 粒 和 空 载 体 质 粒 转 入 酵 母 菌 株 中 使 用 缺 陷 培 养 基 在 培 养 箱 内 培 养 挑 取 酵 母 单 菌 落 用 无 菌 水 重 悬 按 照 浓 度 梯 度 进 行 稀 释 取 菌 液 点 在 与 含 有 的 培 养 基 上 倒 置 培 养 拍 照 记 录 数 据 分 析 使 用 进 行 单 因 素 方 差 分 析 评 估 种 以 上 处 理 的 显 著 性 采 用 软 件 进 行 统 计 学 分 析 计 算 标 准 差 和 标 准 误 并 对 所 有 数 据 进 行 检 验 图 对 番 茄 的 促 生 作 用 或 清 水 预 处 理 后 番 茄 生 长 表 型 对 比 处 理 使 用 菌 液 灌 根 番 茄 处 理 使 用 清 水 灌 根 番 茄 或 清 水 预 处 理 后 番 茄 各 项 生 长 指 标 对 比 图 中 不 同 小 写 字 母 表 示 在 水 平 差 异 显 著 下 同 结 果 与 分 析 菌 株 对 番 茄 的 促 生 抗 病 作 用 由 图 可 见 与 清 水 对 照 组 相 比 处 理 组 中 番 茄 植 株 的 株 高 茎 粗 地 上 部 鲜 重 等 生 长 指 标 均 有 不 同 程 度 的 增 加 预 处 理 对 地 上 部 鲜 重 的 促 进 作 用 最 为 显 著 与 清 水 预 处 理 相 比 地 上 部 鲜 重 增 加 株 高 和 茎 粗 分 别 增 加 和 表 明 对 番 茄 具 有 促 生 作 用 使 用 清 水 预 处 理 的 番 茄 接 种 后 枝 叶 萎 蔫 明 显 而 用 预 处 理 再 接 种 的 植 株 大 部 分 枝 叶 仍 处 于 挺 立 状 态 图 发 病 率 和 病 情 指 数 与 对 照 相 比 都 显 著 降 低 防 效 约 为 图 表 前 期 研 究 表 明 可 诱 导 番 茄 系 统 抗 性 抵 御 侵 染 第 期 汤 淑 亚 等 转 录 因 子 调 控 蜡 质 芽 胞 杆 菌 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 系 统 抗 性 作 用 机 制 研 究 为 验 证 可 通 过 诱 导 番 茄 系 统 抗 性 防 治 青 枯 病 在 预 处 理 后 提 取 番 茄 叶 片 利 用 检 测 番 茄 叶 片 中 防 御 基 因 和 的 表 达 量 发 现 在 预 处 理 后 表 达 量 均 呈 上 升 趋 势 基 因 表 达 量 先 上 升 后 略 下 降 基 因 表 达 量 先 下 降 后 上 升 图 和 说 明 可 调 控 防 御 基 因 的 表 达 诱 导 番 茄 产 生 对 青 枯 病 系 统 抗 性 从 而 降 低 青 枯 病 发 病 率 图 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 的 系 统 抗 性 或 清 水 预 处 理 后 番 茄 对 青 枯 病 抗 病 性 表 型 或 清 水 预 处 理 后 青 枯 病 在 番 茄 上 的 病 情 指 数 或 清 水 预 处 理 后 番 茄 叶 片 中 和 基 因 表 达 量 变 化 列 上 方 的 双 星 号 表 示 在 水 平 显 著 差 异 不 同 小 写 字 母 表 示 在 水 平 差 异 显 著 表 示 无 显 著 差 异 下 同 菌 株 影 响 番 茄 基 因 表 达 表 在 野 生 型 番 茄 中 对 番 茄 青 枯 病 的 防 治 效 果 处 理 发 病 率 防 效 为 探 索 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 的 系 统 抗 性 机 制 取 清 水 和 预 处 理 后 的 番 茄 叶 片 进 行 转 录 组 测 序 分 析 筛 选 获 得 参 与 诱 导 系 统 抗 性 相 关 基 因 结 果 显 示 处 理 引 起 大 量 番 茄 植 株 基 因 表 达 水 平 变 化 图 在 预 处 理 后 与 对 照 相 比 引 起 个 基 因 差 异 表 达 其 中 有 个 为 上 调 基 因 个 为 下 调 基 因 处 理 后 有 个 基 因 差 异 表 达 其 中 上 调 基 因 个 下 调 基 因 个 图 韦 恩 图 图 显 示 有 个 基 因 在 次 处 理 中 均 差 异 表 达 其 中 乙 烯 响 应 因 子 在 处 理 后 表 达 量 显 著 上 调 为 验 证 基 因 在 诱 抗 过 程 中 的 表 达 量 变 化 提 取 清 水 或 预 处 理 后 的 番 茄 叶 片 反 转 录 为 使 用 适 量 进 行 结 果 图 显 示 基 因 表 达 量 在 预 处 理 后 显 著 升 高 说 明 在 诱 导 系 统 抗 性 期 间 上 调 表 达 有 可 能 参 与 诱 导 的 此 外 本 研 究 发 现 在 预 处 理 后 在 接 种 或 未 接 种 青 枯 菌 的 番 茄 植 株 中 相 较 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 于 清 水 对 照 基 因 表 达 量 均 显 著 上 升 图 且 接 种 后 相 较 于 未 接 种 植 株 基 因 表 达 量 上 调 显 著 因 此 猜 想 可 能 在 蜡 质 芽 胞 杆 菌 诱 导 番 茄 产 生 对 青 枯 病 系 统 抗 性 中 发 挥 重 要 作 用 图 蜡 质 芽 胞 杆 菌 处 理 番 茄 后 诱 导 相 关 基 因 差 异 性 表 达 或清水预处 理 后 番茄差 异基因表达分 析热图 灿图 和韦恩 图 红色表 示上调 蓝色表示 下调 图 对 基 因 表 达 量 的 影 响 检 测 预 处 理 后 的 番 茄 植 株 内 基 因 相 对 表 达 量 预 处 理 后 的 番 茄 植 株 接 种 后 检 测 基 因 相 对 表 达 量 参 与 调 控 诱 导 的 本 研 究 成 功 构 建 了 沉 默 植 株 图 通 过 提 取 注 射 菌 株 的 番 茄 植 株 反 转 录 后 进 行 半 定 量 发 现 与 注 射 菌 株 的 植 株 相 比 该 处 理 组 植 株 的 表 达 量 明 显 下 降 图 说 明 已 成 功 沉 默 表 明 沉 默 植 株 可 用 于 后 续 试 验 利 用 基 因 沉 默 技 术 将 基 因 沉 默 后 沉 默 植 株 对 青 枯 病 的 敏 感 性 显 著 增 强 图 表 说 明 正 向 调 控 番 茄 抗 病 性 为 进 一 步 验 证 转 录 因 子 在 蜡 质 芽 胞 杆 菌 诱 导 番 茄 产 生 对 青 枯 病 系 统 抗 性 中 的 作 用 统 计 并 分 析 沉 默 前 后 青 枯 病 发 病 率 病 情 指 数 以 及 对 番 茄 青 枯 病 的 防 效 在 基 因 沉 默 后 处 理 组 与 对 照 组 相 比 发 病 率 没 有 显 著 差 异 且 防 效 下 降 说 明 在 沉 默 植 株 中 抗 病 性 下 降 表 明 正 向 调 控 触 发 的 系 统 抗 性 同 时 在 沉 默 后 仍 保 留 部 分 防 效 说 明 生 防 菌 诱 抗 机 制 是 多 样 的 的 表 达 上 调 只 是 诱 抗 机 制 中 的 一 种 而 非 全 部 综 上 转 录 因 子 可 参 与 调 控 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 系 统 抗 性 第 期 汤 淑 亚 等 转 录 因 子 调 控 蜡 质 芽 胞 杆 菌 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 系 统 抗 性 作 用 机 制 研 究 图 基 因 沉 默 番 茄 植 株 构 建 与 抗 病 性 鉴 定 基 因 沉 默 植 株 表 型 基 因 沉 默 植 株 验 证 或 清 水 预 处 理 后 青 枯 病 在 野 生 型 番 茄 基 因 沉 默 番 茄 上 的 病 情 指 数 表 在 野 生 型 番 茄 基 因 沉 默 番 茄 中 对 番 茄 青 枯 病 的 防 治 效 果 处 理 发 病 率 病 情 指 数 防 效 图 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 及 转 录 调 控 活 性 分 析 定 位 于 细 胞 核 且 具 有 转 录 激 活 活 性 利 用 农 杆 菌 介 导 的 瞬 时 表 达 系 统 在 烟 草 中 表 达 通 过 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 的 亚 细 胞 定 位 发 现 对 照 组 荧 光 分 布 于 整 个 叶 片 细 胞 而 处 理 组 荧 光 仅 定 位 于 细 胞 核 中 图 说 明 是 一 个 核 蛋 白 此 外 转 入 质 粒 的 酵 母 能 够 在 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 培 养 基 上 正 常 生 长 且 在 含 有 的 平 板 上 变 蓝 图 说 明 转 录 因 子 具 有 转 录 激 活 活 性 为 进 一 步 确 定 转 录 激 活 域 构 建 了 重 组 质 粒 并 转 入 酵 母 菌 株 中 图 所 有 的 酵 母 细 胞 在 培 养 基 上 均 可 正 常 生 长 但 只 有 和 酵 母 菌 可 以 在 培 养 基 上 正 常 生 长 且 在 含 有 的 平 板 上 变 蓝 图 表 明 的 转 录 激 活 域 位 于 末 端 图 蛋 白 转 录 激 活 结 构 域 分 析 用 于 转 录 激 活 域 分 析 的 结 构 示 意 图 条 形 上 方 的 数 字 表 示 氨 基 酸 残 基 的 位 置 转 录 激 活 结 构 域 检 测 讨 论 与 结 论 近 年 来 青 枯 病 的 生 物 防 治 在 生 防 菌 的 开 发 无 致 病 力 青 枯 病 菌 的 筛 选 及 转 基 因 植 物 的 构 建 等 方 面 的 研 究 取 得 较 大 进 展 其 中 生 防 菌 的 合 理 利 用 是 青 枯 病 生 物 防 治 的 重 要 内 容 不 仅 达 到 防 治 病 害 的 目 的 而 且 增 强 植 物 对 环 境 的 适 应 性 促 进 植 物 生 长 用 于 防 治 青 枯 病 的 生 防 菌 包 括 芽 胞 杆 菌 属 假 单 胞 菌 属 链 霉 菌 属 等 有 益 微 生 物 其 生 防 机 制 主 要 有 利 用 寄 生 竞 争 抗 生 交 叉 保 护 等 拮 抗 机 制 抑 制 青 枯 病 菌 生 长 或 者 诱 导 植 物 对 青 枯 病 产 生 系 统 抗 性 从 而 降 低 青 枯 病 发 病 率 目 前 生 防 菌 防 治 植 物 病 害 的 机 制 各 不 相 同 很 多 菌 株 防 病 的 具 体 作 用 机 制 尚 不 明 确 导 致 菌 剂 在 进 入 实 际 生 产 后 由 于 缺 乏 系 统 的 理 论 依 据 难 以 在 田 间 发 挥 稳 定 效 果 因 此 为 进 一 步 探 索 青 枯 病 生 防 机 制 本 研 究 采 用 蜡 质 芽 胞 杆 菌 为 供 试 生 防 菌 验 证 得 出 能 促 进 番 茄 生 长 并 诱 导 番 茄 对 青 枯 菌 产 生 系 统 抗 性 从 而 抵 御 青 枯 病 侵 染 根 际 促 生 菌 是 一 类 生 存 于 植 物 根 系 对 植 物 兼 具 促 生 及 抗 病 效 果 的 生 防 菌 研 究 表 明 可 通 过 调 节 植 物 防 卫 机 制 来 降 低 植 物 病 害 的 发 生 这 种 抗 病 性 被 称 为 诱 导 系 统 抗 病 性 近 期 研 究 表 明 解 淀 粉 芽 胞 杆 菌 枯 草 芽 胞 杆 菌 蜡 质 芽 胞 杆 菌 等 均 可 诱 导 番 茄 的 产 生 抵 御 青 枯 病 侵 染 蜡 质 芽 胞 杆 菌 是 一 种 根 际 促 生 细 菌 可 以 在 拟 南 芥 和 番 茄 上 诱 导 对 的 系 统 性 抗 性 根 际 促 生 菌 诱 导 的 植 物 抗 病 机 制 非 常 复 杂 不 同 的 寄 主 植 物 病 原 菌 组 合 诱 导 植 物 系 统 抗 性 机 制 及 其 所 依 赖 的 信 号 转 导 途 径 也 不 同 在 以 往 研 究 中 大 多 数 以 模 式 植 物 拟 南 芥 为 植 物 材 料 研 究 诱 导 抗 病 机 制 对 于 诱 导 番 茄 系 统 抗 性 机 制 尚 不 明 确 因 此 为 明 晰 诱 导 番 茄 产 生 系 统 抗 性 机 制 本 研 究 利 用 转 录 组 测 序 对 预 处 理 后 番 茄 相 关 基 因 的 转 录 水 平 变 化 进 行 分 析 发 现 个 家 族 的 转 录 因 子 表 达 量 显 著 上 调 而 在 接 种 青 枯 菌 后 其 表 达 量 上 调 更 显 著 表 明 在 诱 导 系 统 抗 性 过 程 中 被 显 著 上 调 说 明 极 有 可 能 参 与 诱 导 番 茄 系 统 抗 性 过 程 家 族 转 录 因 子 与 植 物 抗 病 信 号 传 导 密 切 相 关 亚 家 族 转 录 因 子 被 证 明 均 在 茉 莉 酸 和 乙 烯 信 号 转 导 中 发 挥 重 要 调 控 作 用 荧 光 假 单 胞 菌 通 过 信 号 通 路 并 以 依 赖 的 方 式 在 拟 南 芥 中 触 发 表 明 信 号 通 路 在 生 防 菌 诱 导 的 中 发 挥 着 重 要 调 节 作 用 等 发 现 在 乙 烯 茉 莉 酸 信 号 通 路 缺 失 突 变 体 拟 南 芥 中 对 的 抗 性 下 降 说 明 这 条 信 号 通 路 的 激 发 均 能 在 一 定 程 度 上 抑 制 病 原 菌 在 植 物 体 内 第 期 汤 淑 亚 等 转 录 因 子 调 控 蜡 质 芽 胞 杆 菌 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 系 统 抗 性 作 用 机 制 研 究 的 增 殖 共 同 调 节 诱 导 的 系 统 抗 性 等 发 现 转 录 因 子 和 可 分 别 通 过 激 活 不 同 信 号 通 路 调 控 诱 导 从 而 减 少 病 害 发 生 在 这 种 转 录 因 子 和 单 突 变 体 中 抗 病 能 力 下 降 能 够 保 留 部 分 防 效 但 在 双 突 变 体 植 株 中 则 完 全 丧 失 防 效 表 明 和 在 诱 导 的 中 发 挥 重 要 调 控 作 用 且 存 在 功 能 冗 余 本 研 究 发 现 在 沉 默 番 茄 中 处 理 与 清 水 对 照 组 青 枯 病 发 病 率 没 有 显 著 差 异 说 明 沉 默 后 对 青 枯 病 的 抗 病 性 显 著 下 降 表 明 参 与 调 控 触 发 的 系 统 性 抗 性 揭 示 可 通 过 上 调 编 码 基 因 表 达 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 的 系 统 抗 性 机 制 此 外 作 为 亚 家 族 转 录 因 子 有 可 能 通 过 调 节 信 号 传 导 从 而 调 控 诱 导 的 而 在 沉 默 后 对 青 枯 病 仍 具 有 显 著 防 效 说 明 诱 导 的 可 能 不 完 全 依 赖 于 但 我 们 也 无 法 排 除 因 沉 默 技 术 沉 默 基 因 不 完 全 导 致 仍 能 发 挥 部 分 功 能 的 可 能 性 因 此 后 续 可 通 过 构 建 过 表 达 植 株 对 表 型 进 一 步 验 证 前 期 研 究 表 明 家 族 转 录 因 子 可 参 与 植 物 防 御 反 应 以 应 对 各 种 环 境 胁 迫 和 病 原 体 例 如 非 生 物 胁 迫 冷 热 干 旱 盐 度 渗 透 胁 迫 和 生 物 胁 迫 草 食 性 昆 虫 和 微 生 物 病 原 体 许 多 研 究 证 明 过 表 达 家 族 转 录 因 子 的 转 基 因 植 物 可 提 高 对 非 生 物 和 生 物 胁 迫 的 耐 受 性 在 沉 默 番 茄 中 无 论 是 否 进 行 处 理 沉 默 植 株 的 病 情 指 数 都 显 著 高 于 野 生 型 植 株 说 明 正 向 调 控 番 茄 对 青 枯 病 的 抗 性 先 前 的 研 究 表 明 在 应 对 生 物 胁 迫 时 转 录 因 子 可 通 过 调 控 防 御 相 关 基 因 的 表 达 激 活 靶 基 因 诱 导 植 物 激 素 反 应 调 控 程 序 性 细 胞 死 亡 等 途 径 参 与 植 物 防 御 反 应 因 此 为 了 进 一 步 研 究 转 录 因 子 在 调 控 植 物 抗 性 中 的 作 用 本 研 究 对 转 录 活 性 亚 细 胞 定 位 等 生 化 功 能 进 行 初 步 分 析 结 果 表 明 是 具 有 转 录 激 活 活 性 的 核 蛋 白 且 转 录 激 活 域 位 于 端 说 明 其 可 能 作 为 一 个 转 录 激 活 因 子 参 与 植 物 抗 病 过 程 但 对 于 其 如 何 调 控 下 游 基 因 表 达 是 否 参 与 调 节 信 号 传 导 还 需 要 进 一 步 研 究 综 上 所 述 本 研 究 发 现 诱 导 的 番 茄 对 青 枯 病 系 统 抗 性 依 赖 于 编 码 基 因 的 上 调 表 达 同 时 可 作 为 转 录 因 子 正 向 调 控 植 物 的 基 础 抗 性 但 在 诱 导 番 茄 对 青 枯 病 系 统 抗 性 过 程 中 发 挥 的 具 体 作 用 仍 有 待 后 续 进 一 步 系 统 研 究 参 考 文 献 李 林 章 高 天 一 古 斌 权 苗 期 注 射 接 种 法 快 速 鉴 定 番 茄 青 枯 病 抗 性 水 平 的 研 究 蔬 菜 宫 超 黎 振 兴 麦 培 婷 等 番 茄 青 枯 病 抗 性 相 关 根 际 微 生 物 的 研 究 进 展 广 东 农 业 科 学 徐 欣 韵 王 宁 丁 佳 等 番 茄 青 枯 病 拮 抗 菌 的 定 向 筛 选 及 其 抗 病 促 生 机 制 研 究 微 生 物 学 报 赖 宝 春 姚 锦 爱 戴 瑞 卿 等 株 拮 抗 放 线 菌 复 合 防 治 番 茄 青 枯 病 的 研 究 中 国 生 物 防 治 学 报 王 杰 龙 世 芳 王 正 文 等 番 茄 青 枯 病 防 治 研 究 进 展 中 国 蔬 菜 乔 俊 卿 陈 志 谊 梁 雪 杰 等 枯 草 芽 孢 杆 菌 防 治 番 茄 青 枯 病 中 国 生 物 防 治 学 报 朱碧 春 顾 丽 李 正 等 南极土 壤 芽孢杆菌 的分离鉴定 及其防治玉 米细菌性褐 腐病的研究 南 京农业大学 学报 刘 艳 霞 沈 宏 李 想 等 烟 草 青 枯 病 劳 尔 氏 菌 与 拮 抗 菌 对 根 系 分 泌 物 的 竞 争 作 用 微 生 物 学 报 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 张 亮 盛 浩 袁 红 等 荧 光 假 单 胞 菌 诱 导 番 茄 抗 枯 萎 病 的 研 究 土 壤 吴 跃 开 植 物 促 生 根 圈 细 菌 诱 导 植 物 系 统 抗 性 的 研 究 进 展 中 国 森 林 病 虫 许 世 达 耿 兴 敏 王 露 露 植 物 乙 烯 响 应 因 子 的 结 构 功 能 及 表 达 调 控 研 究 进 展 浙 江 农 林 大 学 学 报 蒋 春 号 蜡 质 芽 胞 杆 菌 诱 导 植 物 对 丁 香 假 单 胞 菌 及 南 方 根 结 线 虫 抗 性 机 理 研 究 南 京 南 京 农 业 大 学 贺 婵 汪 顺 娥 郝 海 婷 等 小 介 导 蜡 质 芽 胞 杆 菌 激 活 通 路 诱 导 拟 南 芥 系 统 抗 病 性 研 究 植 物 病 理 学 报 方 中 达 植 病 研 究 方 法 版 北 京 中 国 农 业 出 版 社 张 悦 婧 李 颖 王 娟 娟 等 不 同 转 化 条 件 对 种 农 杆 菌 基 因 在 本 氏 烟 草 中 瞬 时 表 达 的 影 响 植 物 研 究 陈 雪 代 园 风 余 祥 文 等 烟 草 青 枯 病 生 物 防 治 研 究 进 展 农 业 灾 害 研