平谷区马坊镇番茄病毒病的病原鉴定.pdf

北京农学院学报 收稿日期 基金项目 北京市农业农村局乡村振兴项目 第一作者 孙春辉 硕士研究生 主要从事植物保护研究 刘丽为共同第一作者 通信作者 李永强 博士 副教授 主要从事植物病毒学研究 平谷区马坊镇番茄病毒病的病原鉴定 孙春辉 刘 丽 鲁书豪 梁宇卿 王昀轩 崔雯莉 高佳仪 李永强 北京农学院 生物与资源环境学院 农业农村部华北都市农业重点实验室 北京 摘 要 目的 为了给平谷区马坊镇设施番茄病毒病防治提供依据 方法 年 月在河北村 果各庄 早立庄 梨羊村 小屯村番茄种植区采集到表现有黄化 蕨叶 褪绿等疑似病毒病症状的番茄叶片 利用小 深度测序技术对混合叶片进行病毒筛查 并利用 验证 结果 侵染当地番茄的病毒种类有 黄瓜花叶病 毒 南 方 番 茄 病 毒 番 茄 褪 绿 病 毒 和番茄黄化曲叶病毒 在 份样品中的病毒 检出率依次为 两种及以上病毒复合侵染率为 并通过对 个 进行全序列扩增及构建系统发育树 表明其均与 北京分离物的亲缘关系最近 结论 病毒病在马坊镇 普遍发生且危害较为严重 检测结果表明 是侵染当地番茄的主要病毒 且复合侵染现象严重 关键词 设施 番茄 病毒病 病原鉴定 小 深度测序 中图分类号 文章编号 文献标志码 近年来 随着安全饮食观念的不断深入 蔬菜 产业在世界范围内得到了迅猛的发展 其种植区域 不断扩大 带来巨大的经济效益 番茄 营养价值高 广受欢迎 是全球蔬菜 作物中产量最高的种类 中国的番茄产业生产规 模宏大 其产量居各国之首 在市场进出口作物中 北 京 农 学 院 学 报 第 卷 占有重要份额 但番茄的生产面临着一重大难题 番茄病毒病发生频繁 难以防控 严重影响番茄的 产量和品质 如何有效应对病毒病的发生和发展 是当前番茄产业进一步发展中亟待解决的问题 根据最新报道 国内在番茄中鉴定到的病毒已 更新为 种 在北京地区 报道的番茄毒原种类 主 要 有 番 茄 花 叶 病 毒 黄 瓜 花 叶 病 毒 马铃薯 病毒 马铃 薯 病毒 烟草蚀纹病毒 苜蓿花叶病毒 番 茄 褪 绿 病 毒 番茄黄化曲叶病毒 番茄斑萎病毒 等 同时番茄 病毒病在田间的症状表型特别复杂 不同生长周期 表现出不同症状 且复合侵染现象严重 对番茄生 产造成严重威胁 是世界番茄种植区普通存在的一种植 物病毒 在已被报道的番茄病毒中危害最大 其寄 主除了番茄外 还包括辣椒 菜豆 棉花 拟南芥和 烟草等 多种植物 主要通过烟粉虱进行传播 不能通过机械摩擦传播 在番茄的苗期就 可引起发病 通常症状表现为顶部叶片黄化 出现 黄绿斑 叶片变小 叶缘向内卷曲 严重时植株矮 化 生长停止 不能正常开花结果 对番茄生产造成 毁灭性打击 世纪中期 以色列首次报道了番茄 黄化曲叶病毒病 年代末 引起该病的病原被正 式命名为 年 在中国上 海首次报道 最近几年 已扩散到中国 各省市的番茄种植区 每年造成的经济损失高达数 十亿元 对番茄产业的发展造成了严重影响 近年来 小 深度测序技术在农业病害监 测尤其是病毒病原鉴定领域得到广泛应用 小 深度测序技术检测病毒是基于 沉默 原理的一种检测技术 病毒侵染后会将自身的基因 组释放到植物体内 同时会触发植物的抗病毒防御 机制 即 干扰 通过 干扰的方式 植物细 胞内 形 成 大 量 的 病 毒 衍 生 小 干 扰 获得这 些小 序列 再通过生物信息学相关软件分析 将测序数据拼接 就可以获取植物中病毒的序列信 息 该研究调查了北京市平谷区马坊镇番茄病毒 病的发生情况 并利用小 深度测序技术检测 了侵染当地番茄的病毒种类 扩增了 个 基因组全序列 并对其进行了序列分析和系统发育 分析 为当地番茄病毒病的预防和综合防治奠定 基础 材料与方法 番茄病毒病样品采集 年在北京市平谷区马坊镇的河北村 果各 庄 早立庄 梨羊村 小屯村的番茄大棚中采集到疑 似病毒病的番茄叶片 液氮快速冷冻后放入 超低温冰箱中保存 以备后续使用 小 深度测序的番茄叶片样品处理 用植物 快速提取试剂盒 提取番 茄叶片样品总 用 检测 样 品 的 质 量 和 浓 度 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 和 检测 样品的完整性 当测 定 质 量 浓 度 体 积 值 时 样 品检测合格 样品检测合格后委托华大基因公司 进行小 分离 建库和测序工作 将在河北村 采集的 叶片等量混合 命名为 在 小屯村采集的 叶片等量混合 命 名为 将梨羊村采集的 早立庄村采集的 和果各庄村采集的 叶片等量混合 命名为 分别进行测序 小 深度测序数据处理 利用 语言脚本将小 深度测序原始数 据中的低质量数据剔除 去除接头序列 得到有效 序列 将有效序列通过 软件 剔除基因组序列后 与未比对到的小 通 过 软件进行拼接 获得多个 拼接所得的 通过 网站的病毒核酸数据库和蛋白 质数据库进行 比对 并对其分类注释 法验证 根据小 测序结果及已有报道 设计候选 病毒的特异性引物对其进行验证 引物信息见表 病毒 通过 方式验证 其余病毒 通过 方 式 验 证 分别按照植物基因组 提取试剂盒 和植物总 提取试 剂盒 的说明书提取病样叶片的总 总 以提取的 总 为模板 引物 和 各添加 添 加 随后用 处理过的水将反应体系体 年第 期 孙春辉 等 平谷区马坊镇番茄病毒病的病原鉴定 积补充至 将上述反应体系在 水浴中 孵育 向反应体系中添加 逆转录 反应缓冲液 反转录酶 和 抑制 剂 合 成 试剂均采购于 表 用于检测病毒的引物 引物 引物序列 以合成的 和提取的 为模板进行 扩增 扩增总体系为 包括上 下 游引物各 预混液 扩增程序为 预变性 变性 退火 延伸 进行 个循环 补平 扩增结 束后 通过琼脂糖凝聚电泳观察片段大小 并将片 段 进 行 回 收 纯 化 后 克 隆 至 载 体 中 通过热激法将重组载体转化至大肠杆 菌 感受态 之后通过菌落 鉴定阳性克 隆 将阳性克隆送至生工生物工程 上海 技术服 务有限公司测序 序列拼接 将对 阳 性 克 隆 测 序 获 得 的 病 毒 序 列 利 用 软件进行序列拼接 拼接结果与 中的 进行同源比对分析 并下载相关序列 数据 全基因组序列扩增 根据小 深度测序结果 通过 软件拼 接得 到 五 条 不 同 的 序 列 分 两 段 对 全基因组序列进行扩增 所设计的 对引 物信息见表 感病植株 的提取 扩增 回收 连接 及转化参考 进行 序列分析和系统发育分析 利用 软件对扩增获得的 的序列进行组装 根据 中 鉴 定 基因组上每个 的具体位置 并通 过 网站对拼接得到的这五条 全长 序列进行核苷酸一致性分析 表 全长序列扩增所需引物 引物 引物序列 利用 软件 采用最大似然法 根据 的全序列构建系统发育树 可信度设置为 次重复 分析其亲缘关系 结果与分析 番茄病毒病样本的检测 样品 质量检测 所提取 的质量 结果如图 表 所示 其 的 均大 于 浓度均大于 值均大于 图 样品 电泳 表 样品 质量检测 样品 质量浓度 番茄发病情况 在平谷区马坊镇的河北村 果各庄 早立庄 梨羊村 小屯村的番茄大棚中采集 的疑似病毒病叶片的症状包括黄化 卷叶 蕨叶 矮 化 显脉和褪绿等 一部分叶片表现其中的一种症 状类型 而大部分叶片则表现出复合症状 深度测序结果分析 通过小 深度测序 技术 进行数据处理后对得到的 序列在 上进行 比对 检测出番茄叶片上带有 以及 四种病毒序列 北 京 农 学 院 学 报 第 卷 表 结果 序号 病毒名称 数 未检测到 未检测到 未检测到 未检测到 检测 根据文中设计的病毒特异性引物 以提取的番 茄叶片 和反转录的 为模板 经 扩增 琼脂糖凝胶电泳检测 明确样品中确 有测序结果中预测的 这四种病毒 图 其中梨羊村的样品中检测到有 注 样品 阴性对照 图 疑似感染番茄病毒的番茄样品 检测结果 和 果各庄和早立庄的样品中 检测到有 和 河北村的样品中只检 测到了 而小屯村的样品中检测到 和 这 种病毒 由此表明小 测序结果具有可靠性 在 份的样品中 种病毒的检出率依次为 种及以上病毒复合侵染率为 番茄黄化曲叶病毒基因组全序列扩增 分段扩增番茄黄化曲叶病毒 利用引物 对番茄病叶进行基 因组扩增 分别获得大小约为 的电泳条 带 条带大小符合预期 且没有在健康植株中检测 到条带 病毒基因组结构分析 拼接得到的五条 分离物的全长序列 命名为 和 其全长分别为 和 进一步分析 个分离物的分子特征发现 个 分离物与已报道的 具有相同的结构特征 基因组均为单链闭合环状 编码 个开放阅读 框 其中病毒链和互 补链的编码框信息如表 所示 表 个 分离物的开放阅读框信息 病毒分离物相似性比对 在 网站上对 拼接出的病毒全序列进行比对 发现 与 分离物 登录号 相似度最高 为 与分离物 登录号 相似 度 最 高 为 与 分 离 物 相似度最高 为 与分离物 相似度最 高 为 与分离物 相似度最高 为 拼接序列与其他分离物的 年第 期 孙春辉 等 平谷区马坊镇番茄病毒病的病原鉴定 核苷酸相似性比对见表 表 拼接序列与 其他分离物相似性比对 分离物名称 登录号 系统进化树分析 将得到的病毒序列全长 在 网站上进行 比对 并基于比对结果与 当前已经报道过的 的不同分离物 通过构 建系统发育树 并以同科不同属的 做为外源病毒作为对照 进 行分析 如图 拼接得到的 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 和 与中国北 京番茄分离物 共聚与同一个分支上 亲缘关系最近 和 与中国 北京番茄分离物 共聚与同一个分支 上 亲缘关系最近 都与同属的中国云南番茄分离 物 中国江苏番茄分离物 中国陕西番茄分离物 等 个分离物聚在不同的分支上 亲缘关系 较远 图 番茄病毒 全序列系统进化树分析 结论与讨论 该研究利用小 深度测序技术对采自平谷 区马坊镇河北村 果各庄 早立庄 梨羊村 小屯村 五个设施番茄基地的 份疑似病毒病的混合叶片 样品进行了毒原检测 共检测到 和 种病毒 对每份样品进行 验证 发现每份番茄样品中都检测到有病毒侵 北 京 农 学 院 学 报 第 卷 染 其中检出最多的为 其检出率为 并且发现多数样品中存在 种病毒的复合侵染 复合侵染率达 综合到地区来看 梨羊村 果各庄和早立庄地区的样品在共检测到 三种病毒 和 两种病 毒的复 合 侵 染 严 重 河北村的样品中只检测到 一种 病 毒 而小屯村中的样品中检测到 和 四种病毒 存在 种 病毒甚至 种病毒的复合侵染 由此可认为 平谷 区马坊镇番茄病毒病的毒原有 和 种 其中 为优势种 病毒病发 生较为普遍 病毒复合侵染严重 同时对各地区检 测到的 序列拼接后得到 个 序 列 对其进行了全基因组扩增 并分析各基因序列 的分子特征及核苷酸相似性 证实 个 分 离物的全基因序列分别为 和 确认这 个病毒分离物是 分离物 并通过系统进 化分析发现 和 与中国北京番茄分离物 亲缘关系 最近 和 与中国北京番茄 分离物 亲缘关系最近 由此可见 北 京地区的番茄中 发生普遍 类型复杂 其防 治工作面临严峻挑战 结合对当地番茄病虫害的 调查分析 认为烟粉虱的迁徙 种苗来源不稳等可 能是病毒迁入的主要途径 据此研究 为明确平谷 区马坊镇番茄病毒病的发生情况提供了理论依据 为番茄病毒病的防控和抗病毒育种奠定了基础 参考文献 刘钦 乡村振兴战略背景下我国蔬菜产业发展分析 北方 园艺 李君明 项朝阳 王孝宣 等 十三五 我国番茄产业现状及展 望 中国蔬菜 严婉荣 王宝 吉训聪 等 番茄病毒病种类及主要鉴定方法研 究进展 分子植物育种 冯兰香 杨翠荣 北京地区番茄病毒病病毒原种类的监测与黄 瓜花叶病毒株系的鉴定 中国蔬菜 李明远 黄化曲叶病毒病传入北京 番茄生产面临威胁 植 物保护 李明远 陈东亮 李雪梅 等 李明远断病手迹 八十六 北京蔬 菜上的几种番茄斑萎病毒 农业工程技术 张前荣 李大忠 朱海生 等 番茄黄化曲叶病毒研究进展 分子植物育种 李明远 试说北京番茄病毒病 年的变迁 以番茄黄化曲 叶病毒为主的时期 蔬菜 苏秀 小 深度测序在几种木本植物病毒鉴定中的应用 杭州 浙江大学 于云奇 小 深度测序在柑橘新发病毒的鉴定及 诱导的抗病毒新机制中的研究 重庆 西南大学 闫亚莉 基于小 深度测序技术检测鉴定山东省及周边地 区番茄病毒种类 泰安 山东农业大学