二十个黑木耳菌株的酯酶同工酶分析

北方园艺（）：食用菌第一作者简介：刘国丽（），女，硕士，助理研究员，现主要从事食用菌遗传育种等研究工作。：责任作者：张敏（），女，博士，研究员，现主要从事食用菌育种及栽培等研究工作。：基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目（）；国家食用菌产业技术体系资助项目（）。收稿日期：二十个黑木耳菌株的酯酶同工酶分析刘国丽，李红，吕立涛，张敏（辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁沈阳）摘要：以个（）黑木耳菌株为试材，采用拮抗试验和酯酶同工酶试验分析了其遗传多样性，以期为辽宁黑木耳的亲缘关系和遗传育种研究提供参考依据。结果表明：试验共检出迁移率不同的谱带条，个菌株间的遗传相似系数变化范围在。当遗传相异系数为时，供试菌株被聚成个类群，和自成一类，其余为第三类。说明绝大多数黑木耳菌株亲缘关系很近，且聚类分析结果与形态观察及拮抗试验结果基本一致。关键词：黑木耳；拮抗试验；酯酶同工酶；聚类分析中图分类号：文献标识码：文章编号：（）黑木耳（）属担子菌门、层菌纲、木耳目、木耳科、木耳属。又名木耳、细木耳，是我国最先栽培的食用菌之一。黑木耳是我国著名的“山珍”之一，享有“黑色瑰宝”“素中之荤”之美誉，已经成为世界各国广大消费者的美味佳肴。目前市场上黑木耳菌种名目繁多，菌种管理相对滞后，乱引种、乱命名现象比较普遍，导致同名异种或同种异名现象比较严重，老化、退化和劣质菌种流入生产，不仅造成严重的经济损失，还给科研工作带来很多困难，严重影响着黑木耳产业的可持续发展。同工酶指一类具有相同功能，但分别由不同等位基因或不同基因位点编码的蛋白质。由于不同的菌种中同工酶的基因位点不同，同工酶技术能够从本质上揭示菌株间的遗传差异，为杂交亲本的选择提供非常重要的参考依据。现已大量应：，，（，，，，），，，，，（），（），（），：；；；用于诱变育种的融合子和杂交育种的菌株特性及种质鉴定方面，特别是在食用菌的研究中应用更为广泛。该研究对个黑木耳的主要栽培品种进行了拮抗试验和酯酶同工酶分析试验，旨在为黑木耳的优良品种选育、种性鉴定及菌种管理等工作提供参考依据。材料与方法试验材料供试黑木耳菌株共有个，品种名及来源见表。表黑木耳供试品种菌株编号品种名来源 “长城号” 吉林省珲春长城菌业科技开发有限公司“野生号” 抚顺市清原县采集“木” 黑龙江省微生物研究所“纯黑山” 辽宁三友农业生物科技有限公司“野生号” 黑龙江省海林市山市镇胜利村采集“野生号” 内蒙古呼伦贝尔市鄂伦春阿荣旗采集“黑优” 黑龙江省亚布力忠正食用菌研究所“” 辽宁三友农业生物科技有限公司“” 大连全禾菌业有限公司“丰产” 辽宁省农业科学院食用菌研究所“神” 吉林省海澜生物技术有限公司“新科” 江苏省江都天达食用菌研究所“铁” 铁岭县白旗寨乡凡河源黑木耳种植专业合作社“春宝” 吉林省海澜生物技术有限公司“新科” 江苏省江都天达食用菌研究所“海元” 吉林省海澜生物技术有限公司“黑威” 抚顺大金禾食用菌有限公司“丰产王” 辽宁省农业科学院食用菌研究所“” 大连全禾菌业有限公司“菊” 江苏省江都天达食用菌研究所试验方法菌种活化挑取供试黑木耳菌丝左右接种至综合培养基上进行活化，置于黑暗条件下培养，将菌丝长势强的菌种用于拮抗试验。拮抗试验将所有菌株每个为一组进行组合，每个菌种用直径打孔器打取个菌丝块，交叉循环，设置个重复。每平皿接种个菌株，按“品”字形排列。菌株间距左右，置于黑暗条件下培养，观察不同菌株间拮抗线形成是否存在及明显情况。酯酶同工酶鉴定将活化后的供试菌株转接到液体综合培养基上，、避光培养，过滤收集摇瓶中的菌丝体，并用无菌水冲洗干净，滤纸吸干水分，称取菌丝体放入研钵中，加入适量液氮充分研磨后，装入离心管中，加入等量研磨液，于、离心。弃去沉淀取上清，置于离心管中，低温保存备用。采用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳进行酯酶同工酶分析。将样品与蔗糖（）混合后点样，加样量，先低压电泳一段时间，待进入分离胶后再加大到所需电压，电泳在冰箱中进行。电泳完毕后，取出凝胶，进行染色和固定，下保存。数据分析根据酯酶同工酶电泳结果，在凝胶上具有相同迁移率的位置上有条带的记为，无条带的记为。统计各菌株的同工酶条带信息，采用进行系统聚类分析，得到各菌株同工酶的差异系数矩阵表及聚类树状图，对各菌株进行遗传分析。结果与分析拮抗试验结果由表可知，共检测拮抗组合数个，其中与其它供试菌株均有明显的拮抗线（图），说明与其它菌株亲缘关系较远，为独立菌株。与、与、，与也均有明显的拮抗线。其它组合拮抗反应不明显（图），说明亲缘关系较近或为同株异名。酯酶同工酶的多态性分析由图可知，在相同的条件下，个黑木耳菌株共有条酯酶同工酶条带。值在（，，，，，，，，，，，，，，，，，）。其中，、为个菌株共有北方园艺月（上）表拮抗试验结果菌株编号注：表示拮抗反应明显；表示有拮抗反应，但是不明显；无拮抗反应。：；；注：拮抗反应明显；拮抗反应不明显。箭头位置为拮抗线。：；图拮抗试验的条基础性共有酶带。菌株谱带分布和其它菌株差异较大，共有条特有谱带，分别为和；菌株有条特有谱带；有条特有谱带；有条特有谱带，这些特有谱带可作为菌株与其它菌株鉴别的依据。和具有相同的酶带，与、谱带相同，说明它们具有极相近的亲缘关系，很有可能是同株异名。检测到的条带数最少，仅为个。聚类分析由表可知，个菌株间的遗传相似系数变化范围在。部分菌株（和、和、和、和、和）之间相似系数为，显示它们亲缘关系很近，这些菌株很有可能为同物异名，需要从多个方面予以比较鉴别。从图可以看出，当遗传相异系数为时，供试菌株被聚类成个类群：和自成一类，第三类为、第期北方园艺图供试菌株的同工酶酶谱表个黑木耳菌株间的遗传相似性系数菌株编号、。讨论与结论该研究对目前市场上个黑木耳的主要栽培品种进行了拮抗试验和酯酶同工酶分析，得到个黑木耳供试菌株的遗传相似系数和聚类分析树状图，初步鉴定了个供试菌株之间的亲缘关系。结果表明，个黑木耳菌株的酯酶多态性较高，种质资源较为丰富，部分菌株之间酶带相似性极高，可以初步判断这些菌株亲缘关系较近，很有可能是同株异名，例如和，和，和，和，和，虽然来自不同地区，亲缘关系却很近，这可能与目前我北方园艺月（上）图黑木耳菌株聚类分析国各地互相穿插引种、菌种管理混乱等有关，与唐利华等的研究结论相似。该研究为辽宁省黑木耳优良菌种的选育以及菌种的管理工作提供参考依据。由于酯酶活性受外界因素的影响较大，酯酶同工酶试验的稳定性以及可重复性不高，还需采用和等分子标记技术对个黑木耳供试菌株进一步分类鉴别。参考文献马云桥，张介弛黑龙江省黑木耳菌种生产现状及发展对策北方园艺，（）：唐利华，郭倩，王瑞娟，等中国黑木耳主要栽培菌株酯酶同工酶的研究食用菌学报，（）：秦俊哲，谷珅睿，陈合个灵芝菌株的酯酶同工酶分析微生物学通报，（）：韦仕岩，王灿琴，覃晓娟，等金福菇菌株的酯酶同工酶分析基因组学与应用生物学，（）：李红，肖千明，张敏辽宁省黑木耳主栽品种的酯酶同工酶分析湖北农业科学，（）：边银丙，罗信昌，周启木耳栽培菌株酯酶同工酶的酶谱多样性研究菌物系统，（）：，，，（，，）：（），，，：；；；第期北方园艺