苏云金芽胞杆菌杀线虫活性因子分析及杀虫机制研究进展_刘晓艳.pdf

33(5)713-718 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2017 年 10 月 收稿日期： 2017-04-07 基金项目：国家自然科学基金（ 31500428） ；湖北省农科院竞争性项目（ 2015jzxjh04） ；湖北省农业科技创新中心创新团队项目（ 2016620000001038） ；湖北省农业科学院重大研发成果培育专项（ 2017CGPY01） 作者简介：刘晓艳，副研究员， E-mail： xiaoyanliu6613163.com； *通信作者。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2017.05.019 苏云金芽胞杆菌杀线虫活性因子分析及杀虫机制研究进展 刘晓艳*，闵 勇，黄大野，方 伟，王开梅，杨自文 （湖北省农业科技创新中心生物农药分中心 /湖北省生物农药工程研究中心 /湖北省农业科学院植物保护研究所，武汉 430064） 摘要： 苏云金芽胞杆菌 Bacillus thuringiensis（ Bt） ，是一种重要的昆虫病原细菌，对多种农业害虫包括鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目和线虫等具有高特异杀虫活性，是迄今应用最广泛的微生物杀虫剂。本文总结了杀线虫 Bt 菌株的活性因子种类以及不同类的活性物质杀线虫机制的分析，能够为生物杀线剂的研究与创制提供理论基础。 关 键 词： 苏云金芽胞杆菌；杀线虫活性因子；杀线虫机制 中图分类号： S476.1 文献标识码： A 文章编号： 1005-9261(2017)05-0713-06 Research Advances on the Nematicidal Factors and Virulence Mechanisms of Bacillus thuringiensis LIU Xiaoyan*, MIN Yong, HUANG Daye, FANG Wei, WANG Kaimei, YANG Ziwen (Biopesticide Branch, Hubei Innovation Centre of Agricultural Science and Technology/Hubei Biopesticide Engineering Research Centre/Institute of Plant Protection, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China) Abstract: Bacillus thuringiensis abbreviated as Bt, is a kind of important insect pathogenic bacteria with high specific insecticidal activity against various agricultural pests, including Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Hymenoptera and nematode. Bt is by far the most widely used microbial insecticide. In this paper, we summarized the types of active factors and the nematicidal mechanism, which could provide the theoretical basis for the research and development of the bio-nematicides. Key words: Bacillus thuringiensis; nematicidal factors; nematicidal mechanism 苏云金芽胞杆菌 Bacillus thuringiensis（ Bt）是一种好氧、产孢的革兰氏阳性细菌，这种细菌能够产生特异性的杀虫晶体蛋白（ insecticidal crystal proteins， ICPs），对鳞翅目 Lepidoptera、鞘翅目 Coleoptera、膜翅目 Hymenoptera、双翅目 Diptera、线虫 Nematodes 及螨类 Acaribs 等多种害虫具有高杀虫活性1-4，是迄今为止世界上应用最广泛的生物杀虫剂。近年来，国内外的学者在 Bt 杀线虫的种类、杀线虫 Bt 基因的克隆、杀线虫活性物质的鉴定及杀线虫的机理等方面展开了大量研究工作，并取得了显著的进展。 1 Bt杀线虫的种类 研究报道， Bt 可以对多种不同来源、不同种属的线虫起到毒杀作用。 1963 年， Ciordia 与 Bizzeli5发现 Bt 苏云金亚种对牛肠道线虫的卵和幼虫具有毒杀活性； 1972 年， Prasad 等6首先发现 外毒素不仅影响根结线虫 Meloidogyne incognita 卵的孵化，还对其幼虫具有高毒杀活性。此外， 外毒素还对香蕉穿孔线虫 Radopholus similis 和酸酱线虫 Panagrellus redivivus 具有毒杀作用7。 1985 年， Bone 等8发现以色列亚种及库斯塔克亚种的晶体蛋白对动物寄生线虫蛇形毛圆线虫 Trichostronglus colubriformis 的幼虫和卵有714 中 国 生 物 防 治 学 报 第 33 卷 高活性，以色列亚种的毒素蛋白还对奥斯特线虫 Ostertagia ostertagi、捻转血矛线虫 Haemonchus contortus等动物寄生线虫的卵有毒杀活性9。 1992 年， Bradfish10用溶解的伴胞晶体蛋白进行线虫生物测定发现，对根结线虫属 Meloidogyne spp.、滑刃线虫属 Aphlenchoides spp.、短体线虫属 Pratylenchus spp.和矮化线虫属 Tylenchs spp.等植物寄生线虫有毒杀活性。 1994 年， Sharma 等11用以色列亚种的毒素蛋白处理大豆和玉米种子，大豆胞囊线虫 Heterodera glycines Ichinohe 病害显著减轻。 1995 年，苏云金芽胞杆菌伴胞晶体毒素中加入乳突类圆线虫 Strongyloides papillosus，发现幼虫随毒素量的增加，死亡数亦相应增加12。 1996年，有报道证明苏云金芽胞杆菌的伴胞晶体毒素对捻转血矛线虫有毒13。还发现 Bt 伴胞晶体蛋白对猪蛔虫的杀虫作用十分明显，对猪无急性毒副作用14。余子全等15从全国各地采集到的 1500 多株苏云金芽胞杆菌中筛选到 9 株对北方根结线虫 Meloidogyne hapla、苎麻短体线虫 Pratylenchus scribneri 和甘薯茎线虫Ditylenchus destructor 有高毒力的菌株。研究者们相继还发现苏云金芽胞杆菌对松材线虫和广州管圆线虫Angiostrongylus cantonensis 具有杀线虫活性16-19。报道称 Cry5B 和 Cry21A 毒素蛋白对鼠类中的蛔虫Heligmosomoides polygyrus bakeri 和仓鼠锡兰钩虫 Ancylostoma ceylanicum 具有高毒力20,21。该课题组接着发现 Cry5B 蛋白还对人和猪的寄生蛔虫 Ascaris suum 有活性，因此 Bt 除了应用在农业上外还可以用在医药上，有望开发成驱虫剂22。 2 Bt杀线虫晶体蛋白基因 目前已报道的对线虫具有杀虫活性的 Bt 基因分为 9 大类，共 25 种（表 1），包括 cry1 类的 cry1Aa、cry1Ia、 cry1Ea6， cry5 类的 cry5Aa1、 cry5Ab1、 cry5Ac1、 cry5Ad1、 cry5Ba1、 cry5Ba2、 cry5Ba3， cry6 类的 cry6Aa1、 cry6Aa2、 cry6Aa3， cry12 类的 cry12Aa1， cry13 类的 cry13Aa1、 cry13Aa2， cry14 类的 cry14Aa1、cry14Ab1， cry21 类的 cry21Aa1、 cry21Aa2、 cry21Ba1、 cry21Fa1、 cry21Ha1， cry35 类的 cry35Aa4 和 cry55类的 cry55Aa123-35。通过这些杀线虫 Bt 蛋白的序列同源性比较分析， cry1 类与 cry55 类、 cry5A 类与 cry12类、 cry5B 类与 cry21 类、 cry13 类与 cry14 类亲缘关系较近， cry6 类及 cry35 类与上述基因亲缘关系较远，单独分为一类（图 1）。 Cry21Ba1Cry5Ba3Cry5Ba2Cry5Ba1Cry21Aa1Cry21Aa2Cry13Aa1Cry13Aa2Cry14Aa1Cry14Ab1Cry12Aa1Cry5Aa1Cry5Ab1Cry5Ac1Cry5Ad1Cry21Fa1Cry21Ha1Cry1Ea6Cry6Aa1Cry6Aa2Cry6Aa3Cry35Aa4Cry55Aa1Cry1Aa1Cry1Ia图 1 苏云金芽胞杆菌中杀线虫晶体蛋白亲缘关系比较图 Fig. 1 Phylogenetic relationship map of nematicidal crystal protein from B. thuringiensis 第 5 期 刘晓艳等：苏云金芽胞杆菌杀线虫活性因子分析及杀虫机制研究进展 715 表 1 已报道的具有杀线虫活性的 Bt 晶体蛋白 Table 1 The reported Bt nematicidal crystal proteins 杀虫蛋白名称 Protein name 氨基酸序列登录号 GenBank ID 作者 Author 年份 Year 菌株 Strain Cry1Aa WP016090222.1 Liu et al 232015 YC10 Cry1Ia WP000769223.1 Liu et al 232015 YC10 Cry1Ea6 AAL50330.1 Sun et al 241999 YBT1532 Cry5Aa1 AAA67694.1 Narva et al251994 PS17 Cry5Ab1 AAA67693.1 Narva et al251991 PS17 Cry5Ac1 I34543.1 Payne et al251997 - Cry5Ad1 ABQ82087.1 Lenane et al252007 L366 Cry5Ba1 AAA68598.1 Foncerrada & Narva251997 PS86Q3 Cry5Ba2 ABW88931.1 Guo et al262008 YBT1518 Cry5Ba3 AFJ04417.1 Wang et al252012 zjfc85 Cry6Aa1 AAA22357.1 Narva et al251993 PS52A1 Cry6Aa2 AAM46849.1 Bai et al152001 YBT1518 Cry6Aa3 ABH03377.1 Jia et al252006 96418 Cry12Aa1 AAA22355.1 Narva et al251991 PS33F2 Cry13Aa1 AAA22356.1 Narva et al251992 PS63B Cry13Aa2 ANS46158.1 Hollensteiner et al252016 MYBT18246 Cry14Aa1 AA21516. Narva et al251994 PS80JJ1 Cry14Ab1 AGU13817.1 Sampson et al252012 ARP001 Cry21Aa1 I32932.1 Payne et al251996 - Cry21Aa2 66477.1 Feitelson251997 - Cry21Ba1 BAC06484.1 Sato & Asano252002 - Cry21Fa1 AHI15915. Iatsenko et al272013 DB27 Cry21Ha1 HI15917.1 Iatsenko et al272013 DB27 Cry35Aa4 AAT29025. Schnepf et al282004 PS185GG Cry55Aa1 BW88932.1 Guo et al262008 YBT1518 3 Bt中其他杀线虫活性成分 Bt 中杀线虫的主要活性物质为杀虫晶体蛋白如 Cry1Aa、 Cry5Ba2、 Cry6Aa2、 Cry14Aa1、 Cry21Aa1和 Cry55Aa1（表 1） ， 此外， 还有一些次级代谢产物也具有较高的杀线虫活性， 如化合物类的苏云金素36-38和反式乌头酸39，金属蛋白酶、几丁质酶及其他蛋白，如双结构域蛋白40-43等（表 2）。 表 2 已报道的 Bt 中对杀线虫有毒杀作用的其他活性因子 Table 2 Other reported nematicidal bioactive factors from Bt 分类名称 Name 杀线虫成分 Nematicidal factors 杀线虫基因 Nematicidal genes 参考文献 Reference 化合物 Compound 苏云金素 Thuringiensin thu cluster 37 反式乌头酸 Trans-aconitic acid tbrA， tbrB 39蛋白酶 Protease 金属蛋白酶 Metalloproteinase bmp1 40胶原蛋白酶 Collagenase colB 41 几丁质酶 Chitinase chi9602 42其他蛋白 Other protein 双结构域蛋白 Two-domain protein nel 43 716 中 国 生 物 防 治 学 报 第 33 卷 4 Bt中活性因子的杀线虫机制 Zheng 等44通过比对 120 株产孢芽胞杆菌菌株的基因组序列，生物信息学分析发现在这些对线虫具有毒杀活性的菌株中至少存在 4 种杀虫机制：晶体蛋白的穿孔机制、苏云金素的 RNA 聚合酶抑制机制、蛋白酶的降解机制和几丁质酶的降解机制。 4.1 杀虫晶体蛋白的穿孔机制 认为晶体蛋白杀死线虫的机理可能与昆虫相类似，毒素蛋白在线虫肠道碱性环境下被蛋白酶剪切加工，分解成有毒的多肽，与线虫中肠上皮细胞的靶标部位结合，破坏肠道组织，导致细胞膜穿孔，使靶标线虫死亡45-52。 Marroquin 等53研究发现， Cry5B 蛋白能使秀丽小杆线虫整个肠组织收缩，脱离体壁并形成类似空泡的结构。 Wei 等54也发现，晶体蛋白作用线虫时，其肠道收缩脱离体壁并造成肠组织退化。通过罗丹明标记的毒素蛋白作用秀丽小杆线虫发现，所有荧光都集中在肠道组织上，表明毒素蛋白作用在线虫的肠道组织上55。最新研究报道 Cry6Aa 蛋白具有 螺旋结构，其对线虫的作用也可能是通过穿孔完成56。 4.2 苏云金素的 RNA 聚合酶抑制机制 苏云金素是一种由 Bt 产生的小分子量杀线虫活性物质，也称为 外毒素。通常认为，苏云金素是核酸代谢抑制剂，由于和 ATP 的结构类似，会与 ATP 竞争 RNA 聚合酶的结合位点，从而抑制依赖于 DNA的 RNA 聚合酶57。然而通过对苏云金素分子的合成与代谢途径的分析发现，其化学本质更像是糖类衍生物，因此，苏云金素对线虫的杀虫机制是否与 ATP 竞争 RNA 聚合酶的结合位点有待进一步的研究37。 4.3 蛋白酶和几丁质酶的降解机制 Bt 菌株通常含有多种蛋白酶基因，如 bmp1 和 colB，这些基因表达的蛋白酶可以降解线虫的中肠，导致线虫的死亡40,41。 Bt 菌株产生的几丁质酶则是通过降解线虫卵的几丁质成分来杀死线虫42。 除了上述机制外，还有研究发现 Cry6Aa 蛋白通过影响坏死信号通路启动了秀丽小杆线虫的细胞凋亡过程46。此外一种含有双结构域蛋白 Nel 可以在模式植物和线虫体内启动热应激途径和坏死途径，从而引起线虫的死亡43。 5 结语 对线虫具有杀虫活性 Bt 菌株的发现，为线虫病害的生物防治提供了一个安全、有效的途径。通过鉴定 Bt 中杀线虫活性因子的本质，了解这些活性因子杀虫机制，有助于开发新的生物杀线剂，推进生物农药在线虫病害防治中的应用。此外，通过进一步研究， Bt 及其代谢产物在医药上防治寄生虫的应用也是大有可能的。 参 考 文 献 1 Schnepf E, Crickmore N, Van Rie J, et al. 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