LA杂交系百合特征花香释放规律及关键基因研究

园艺学报，2018， 45 (4)： 702716. Acta Horticulturae Sinica   702                                                 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0313； http： /www. ahs. ac. cn  收稿日期 ： 2017 07 04； 修回日期 ： 201803 12 基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31672190 ）；国家十二五863 计划项目（2011AA1002084）  * 共同第一作者 * 通信作者 Author for correspondence （E-mail：luyingminbjfu.edu.cn ）  LA 杂交系百合特征花香释放规律及关键基因研究 章毅颖*，李雯琪*，吕英民*（北京林业大学园林学院，国家花卉工程技术研究中心，北京  100083）  摘  要： 使用顶空固相微萃取（ HS SPME）气相色谱质谱（GC MS）联用技术和实时荧光定量技术，分析 LA 杂交系百合（Lilium longiflorum Asiatic hybrids ）花香释放代谢途径的生物化学规律和遗传特征。对比 LA系百合、 麝香百合 （Longiflorum  hybrids）、 亚洲百合 （ Asiatic hybrids）、 OT系百合 （Oriential hybrids Trumpet hybrids） 4 个杂交系的 5 个品种挥发物释放差异；利用同源克隆从 LA 百合中克隆得到3 个甲羟戊酸合成途径（MVA ）中的关键基因。结果表明： 5 个百合品种花香成分释放存在显著差异，萜烯类化合物的释放规律与香气程度基本一致。 LA 百合爱神在初开期花香释放达到顶峰，随后逐渐降低；花瓣的香味释放量最大。不同杂交系百合 MVA 途径合成酶基因（ HMGR、 MVD、FPS 、TPS ）的表达模式不同，关键基因的表达量影响最终产物的生成。在 LA 百合爱神中克隆得到 LlaTPS，在开花进程中， LlaTPS 表达趋势与萜烯类化合物释放规律相似，表明其是控制萜烯类化合物挥发量的关键基因。LlaTPS cDNA 全长 1 799 bp，具开放阅读框 1 764 bp，共编码 587 个氨基酸。系统进化树分析得出 LlaTPS与同属百合 Siberia亲缘关系最近，属于 TPSb 亚家族。克隆得到合成倍半萜前提物质 FPP 的关键基因法尼基焦磷酸合酶基因 LlaFPPS，cDNA 全长 1 072 bp，开放阅读框 1 056 bp，共编码 351 个氨 基酸； 其编码蛋白与 单子叶植物 FPPS 蛋白亲缘关系较近。克隆得到焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶（MVD）基因LlaMVD（ KX034060）， cDNA 全长 1 439 bp，开放阅读框 1 275 bp，共编码 424 个氨基酸；百合 MVD 与油棕（ Elaeis guineensis） 、短花药野生稻（Oryza brachyantha ）等单子叶植物亲缘关系较近。 关键词： 百合；花香；TPS ； FPPS； MVD 中图分类号： S 682.2       文献标志码： A        文章编号：0513-353X （2018 ） 04-0702-15 Characterization of Emitted Volatiles and Key Genes in Lilium longiflorum Asiatic ZHANG Yiying*，LI Wenqi*，and L Yingmin*（ College of Landscape Architecture， China National Floriculture Engineering Research Centre， Beijing Forestry University，Beijing  100083，China ）  Abstract： Using headspace solidphase microextraction （HS SPME）， gas chromatography mass spectrometry（ GCMS ）and quantitative real-time PCR techniques ， we analyzed the biochemical and genetic characterization of the metabolic pathway on fragrance emission of Lilium longiflorum Asiatic 章毅颖，李雯琪，吕英民. LA 杂交系百合特征花香释放规律及关键基因研究.  园艺学报， 2018， 45 (4)： 702716.                                                                                       703 hybrids（ LA） . Five interspecific Lilium hybrids cultivars were collected to analyze the differences in scent emissions including Lilium longiflorum Asiatic hybrids，Longiflorum hybrids， Asiatic hybrids and Oriential hybrids Trumpet hybrids. These five cultivars were divided into three levels：non-scented ，light-scented，and strong-scented. Three key genes of the mevalonic acid （MVA ）pathway were isolated from LA hybrids by the homology cloning. The results indicated that there were significant differences in the release of floral scent components in five lily hybrids with different levels of fragrance， and the emitted regulation of terpene compounds was consistent with the degree of perceptible fragrance. The aroma content of Freya reached the maximum in the early flowering period， and the aroma content of tepal was the highest among the four floral tissues. The expression patterns of enzyme genes（ HMGR， MVD，FPS  and TPS）in the MVA pathway were different in different interspecific lily cultivars. The expression level of TPS was consistent with the emitted regulation of terpene compounds on the flowering of Freya，which indicated that TPS played a pivotal role in the volatilization of terpene compounds. We obtained a terpene synthase gene named as LlaTPS in LA hybridsFreya ，which was the final step in the MVA pathway. The full length of the cDNA was 1 799 bp，with an open reading frame of 1 764 bp ，encoding a total of 587 amino acids. The phylogenetic tree analysis showed that LlaTPS was the closest to the monoterpene synthase of Lilium hybrid cultivar Siberia， and belonged to TPSb subfamily. LlaFPPS was cloned from LA hybrids Freya，which can catalyze farnesyl diphosphate （ FPP）as the precursor for sesquiterpene. The full length of the cDNA was 1 072 bp， with an open reading frame of 1 056 bp，encoding a total of 351 amino acids. The phylogenetic tree analysis showed that LlaFPPS encoding protein had a close relationship with monocotyledons plant FPPS protein，and far more distant from leguminous plants. LlaMVD（ KX034060） was isolated from LA hybrids Freya， which was the key gene in the MVA pathway. The full length of the cDNA was 1 439 bp，with an open reading frame of 1 275 bp ，encoding a total of 424 amino acids. The phylogenetic tree analysis showed that Lilium MVD is closely related to that of Elaeis guineensis and Oryza brachyantha. Keywords： lily；Lilium  longiflorum Asiatic hybrids；floral scent ；TPS； FPPS；MVD 探究百合（ Lilium spp.）的花香形成机制，根据人们需求选育出不同香气的品种，是提高百合花香资源利用的重要手段之一。LA 百合杂交系是麝香百合和亚洲百合的杂交品系。麝香百合杂交系由麝香百合（ Lilium longiflorum）与台湾百合（ Lilium philippinense）杂交而成，喇叭形，花香清新。 Kong 等（2013 ）对喇叭形百合种淡黄花百合（Lilium sulphureum ）进行昼夜花香释放规律的研究发现，其 1,8桉树脑和苯甲酸甲酯含量最丰富，其他化合物，如 蒎烯（2.4% ） ，桧萜（ 1.2%），柠檬烯 （1.5% ）， (E) 罗勒烯 （4.7% ），和 松油醇 （2.4% ）， 也发挥 了重要作用。 张辉秀等 （2012）在对麝香百合杂交系品种白天堂不同开花期的香气成分变化研究时发现，在其开花的 4 个时期（初开期、半开期、盛开期、衰败期）中，随着花的开放，其香气释放量逐渐增大，并在盛开期达到峰值，随后逐渐降低。亚洲百合杂交系主要由亚洲地区原产的百合及品种杂交而成，一般为无香型或淡香型。范艳萍等（ 2008）对亚洲百合品种精辟的花瓣进行挥发性成分和含量的测定，释香量最大的是十九烷，其次是十六烷；张辉秀等（ 2013）对不同百合挥发性成分分析得出，烷烃类释放物所占比例比较高，达到了 40%以上。大部分 LA 百合没有香味，少数品种花香浓淡适宜，花色丰富，花形多变，抗逆性强，适合百合多种种植形式，也是百合切花生产及园林地被种植的首选Zhang Yiying，Li Wenqi ，L  Yingmin. Characterization of emitted volatiles and key genes in Lilium longiflorum Asiatic. 704                                                                        Acta Horticulturae Sinica，2018， 45 (4)：702716.  材料之一。 目前对于 LA 百合花香研究不多，某些 LA 百合品种中萜烯类物质（ terpenoids）是主要香气成分，这与麝香百合花香主要成分相似。萜烯类化合物是植物香味物质的主要成分，大多数是由异戊烯二磷酸（ isopentenyl diphosphates， IPP）在单萜或倍半萜合成酶的作用下合成的。萜烯类化合物包括两个合成途径（ Mahmoud et al.，2002） ，一个是在细胞溶质中发生的甲羟戊酸途径（ mevalonic acid， MVA） ，另一个是在质体中发生的甲基赤藓糖醇磷酸途径（methylerythritol-phosphate pathway ，MEP） 。本研究中，对百合特征花香物质生物合成的关键基因进行克隆分析，探索其在 LA 杂交系百合植株上的时空表达，以解释 LA 杂交系百合相关花香成分生物合成途径的调节机制，从而指导 LA杂交系百合新品种的选育工作。 1  材料与方法 1.1  试验材料和样品采集 根据嗅觉识别强弱将 5 个百合品种的花香程度分成 3 个水平：无香型亚洲百合穿梭（Tresort ）和 LA 百合耀眼 （ Aladdin） ；轻香型 LA 百合爱神 （ Freya） ；浓香型麝香百合白天堂 （White Heaven ）和 OT 百合萨尔塔列洛 （ Saltarello） 。挥发物采集前，将每个品种的 5 6 个茎（每茎 3 5 个花芽）收集并浸没在清水中，置于 28 ，光周期为 16 h 光照 /8 h黑暗，相对湿度为 68%的室内。 2016 年 6 月 1417 日 9：0016 ：00 ，从北京市海淀区八家三顷园苗圃基地采集到 5 个百合杂交品种（图 1）盛开期的花瓣。选择 LA 百合爱神作为模型来探索 LA 百合花香释放物的特征规律，将其开花进程分成 5 个阶段（图 2） ，将花器官分花瓣、花药、花丝和心皮（柱头  + 花柱  + 子房）。每个样品取样（ 2.0 0.2）g ，重复 3 次。 1.2  花 香成分收 集与分析  利用顶空固相微萃取（HS SPME ）和气相色谱质谱（GC MS ）对花香成分进行收集，将固相微萃取纤维头在气相色谱仪的进样口老化 2 h，老化温度 250 。用无菌镊子将材料分别装到25 mL 样品瓶中并立即将样品瓶密封。将样品瓶置入 45 水浴锅，随后插入固相微萃取头，推出纤维头至样品上方 0.5 cm 处，在 45 水浴中吸收挥发性化合物 30 min 后，抽回纤维头，将萃取头插入气相色谱仪的进样口，推出纤维头，解析进样。   GCMS 与 DB-5MS 硅胶毛细管柱（ 30 m 0.25 mm i.d.，0.25 m 膜厚度）偶联（Shimadzu GCMS-QP2010） 。使用氦气作为载气。色谱的升温程序：起始温度 40 保持 2 min，以 5 min-1升至 200 ，并在 200 温度下保持 6 min。质谱条件：通过 EI 电离模式， EI 电离能量 70 eV，MS 四级杆温度为 260 ，离子阱温度 230 ，扫描范围为 30 500 amu。  挥发物成分分析：通过具有 NIST08（ National Institute of Standards and Technology）数据库的G1711EA MSD 化学工作站 （ Agilent， USA） 鉴定花香挥发性化合物。初步结果通过其保留指数 （RI ）与相关文献数据进行比较来确认。通过峰面积归一化法对化合物进行定量。 1.3  百合总 RNA 的提取与实时荧光定量 PCR（ qRT-PCR） 反应 采用艾德莱（Aidlab）植物 RNA 提取试剂盒说明书进行 RNA 提取。将提取好的 RNA 样品用章毅颖，李雯琪，吕英民. LA 杂交系百合特征花香释放规律及关键基因研究.  园艺学报， 2018， 45 (4)： 702716.                                                                                       705 微量紫外分光光度计进行质量检测。质量合格的 RNA 样品通过艾德莱公司反转录试剂盒进行反转录。 图 1  5 个百合栽培品种  Fig. 1  The five commerical hybrid Lilium cultivars 图 2  LA 百合爱神花发育 5 个阶段和花器官解剖  Fig. 2  The five development stages and the anatomy of floral organ on Lilium longiflorum Asiatic hybrid Freya  标准曲线分析：将待测的 cDNA 模板按 10 倍浓度进行依次稀释，共稀释 5 次，用 6 个浓度的样品进行荧光定量 PCR 反应，构建标准曲线，从而验证引物扩增效率。 根据百合测序、注释结果及 cluster 结果统计分析，查找目的序列，用 Primer Premier 5 软件设计引物，选择最优的 qRT-PCR 引物序列（表 1） 。引物由中美泰和生物技术合成。 Zhang Yiying，Li Wenqi ，L  Yingmin. Characterization of emitted volatiles and key genes in Lilium longiflorum Asiatic. 706                                                                        Acta Horticulturae Sinica，2018， 45 (4)：702716.  表 1  qRT-PCR 引物序列  Table 1  Genes and primer sequences for qRT-PCR 基因名称 Gene 引物序列（ 5 3）  Primer sequence HMGR GTTACCACTCTTCACCCCTT；CAGCCTGTTTGGAACTACTT MVD CTTGTCTTGTCTACTCCCTTG； TTCCTTCTGCCTTGAACTTACC FPS GCACTTGGTTGGTGTATTGA； CGCCTTGTGTGAGAGTTGTC TPS CTCTTGCCTTTCGTCTTCTC；TCCTCCATTACTTGCTCTCC LoTIP1（ Actin）  CGAAGCCAGAAACGGAGAAGAAT；GGGTAGGGTGGATTGGGAAGA qRT-PCR 反应条件为： 95 预变性 3 min；95 变性 10 s，退火温度（ Tm）退火 30 s，72 延伸 30 s，共 39 个循环， 65 下孵化 20 s，从 65 95 每 0.5 读取 1 次熔解曲线。 荧光定量分析：以 LoTIP1（表 1）为内参基因，并对各样品进行荧光定量 PCR 反应，每个样品3 次重复，利用 2-Ct法计算相对表达量，随后导出相对表达量柱状图。 根据 GenBank 上近源物种以及百合转录组数据，利用 Primer Premier 5.0 软件设计正向和反向引物（表 2）。  表 2  百合基因克隆所用引物序列  Table 2  The primer sequences for isolation of LA hybrid Freya  引物名称 Primer 引物序列 Sequence TPS F：5 -ATGGCAGCTATGAGCTGTTTCTCAC-3； R：5 -TCATTCCAATGGGACATTATTGACA-3 FPPS ：5 -ATGACGGCGGCGGCGGT-3； R：5 -CTACTTCTCTCTCTTGTAAATCTTG-3 MVD ：5 -ATGTCGACAGAGCCGGAG-3； R： 5-TTATTTTGGAATCCCTGT-3 将已获得的百合 cDNA 文库为模板，利用上述合成好的引物采用 Thermo Scientific Phusion Hot Start II 高保真 DNA 聚合酶对基因进行扩增。 PCR 反应条件为： 98 预变性 30 s； 98 变性 10 s，55 退火 30 s，72 延伸 2 min，共 35 个循环； 72 继续延伸 10 min，4 保存。 PCR 产物通过 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，进行 DNA 纯化回收，回收后的 DNA 进行加 A 反应后，连接到克隆载体 T-Vector pCloneEZ-TOPO。随后将连接产物转化大肠杆菌 DH10B 感受态细胞，复苏，随后将菌液涂在含 Kan 的 LB 固体培养基上，过夜培养 12 16 h；待平板菌斑生长到合适大小时，挑取菌落进行 PCR 鉴定，将菌液 PCR 验证正确的菌液交由睿博兴科生物技术有限公司进行测序。 通过 Contig 软件对所测得的核苷酸序列片段进行拼接，获得 cDNA 全长。通过 NCBI 中的 ORF Finder 程序分析该基因的开放阅读框并推导出其氨基酸序列。用 ProtParam（ http： /web.expasy.org/ prot-param/） 计算蛋白分子量及等电点。使用 NCBI 中的 BLAST 对所得基因的氨基酸序列进行比对，用 Clustal X 和 MEGA 5.1 软件绘制系统进化树。采用丹麦技术大学生物序列分析中心（CBS ， DUT）的 SignalP 4.1 服务端， TMHMM 2.0 服务 端， TargetP 1.1 服务端分别进行蛋白信号肽定位和预测，跨膜结构域预测，亚细胞定位预测。蛋白质三维结构模型图通过在线软件 SWISS-MODEL（ https： / swissmodel.expasy.org/）绘制获得。 2  结果与分析 2.1  百合不同品种花香释放成分释放规律分析  在 5 个百合杂交品种上共检测到 37 种发性化合物（表 3） 。其中，浓香型麝香百合白天堂和 LA 百合爱神挥发物种类更多，白天堂主要香气成分为醇类化合物，包括芳樟醇、橙花叔醇、桉叶油醇，尤其是芳樟醇的相对含量贡献最大，达到 53.34%。无香型的亚洲百合穿梭挥发章毅颖，李雯琪，吕英民. LA 杂交系百合特征花香释放规律及关键基因研究.  园艺学报， 2018， 45 (4)： 702716.                                                                                       707 物种类较少，脂肪酸衍生物是其主要的释放物。在 LA 百合轻香型品种爱神和无香型品种耀眼中检测到了萜烯类化合物，包括 (Z)罗勒烯、石竹烯、 法尼烯，倍半萜的含量超过萜烯类总含量的 70%。  表 3  百合品种盛开期挥发性化合物成分及其相对含量  Table 3  Volatiles compositions and proportions of floral fragrance emitted from lily hybrid cultivars in mature period 主要成分 Main component 保留时间 /min Retention time 相对含量 /% Relative content 穿梭 Tresort 耀眼 Aladdin 爱神 Freya 白天堂 White Heaven 萨尔塔列洛 Saltarello 烷烃类 Alkane    正戊烷 Pentane 1.701        3.59 正己烷 Hexane 2.137      3.97  甲基环戊烷 Methyl-cyclopentane 2.385      0.67  环己烷 2-ethenyl-1,1-dimethyl-3-methylene- Cyclohexane 14.796  4.55      萜烯类 Terpene        月桂烯 -Myrcene 10.882    0.60  3.22 ( E)罗勒烯 -(E)-Ocimene 12.368    0.46    ( Z)罗勒烯  -(Z)-Ocimene 12.701    8.29  40.69 石竹烯 Caryophyllene 23.587    23.64    法尼烯（金合欢烯） F arnesene 25.668  8.34      醇类  Alcohol        甲醇  Methyl Alcohol 1.516 12.84  0.92  8.38 乙醇  Ethanol 1.616  14.40      已二醇 2-methyl-Pentane 1.952      2.24  顺式 3己烯醇 3-Hexen-1-ol 6.768    6.23    顺式 2己烯醇 ( Z)-2-Hexen-1-ol 7.058  3.36 17.66  3.82 反式 2己烯醇 ( E)-2-Hexen-1-ol 7.073 4.09        正己醇 1-Hexanol 7.154 4.89 5.02 12.86  2.45 2乙基 1己醇 2-ethyl-1-Hexanol 12.108  10.81  0.79  S ( ) 3,7,11三甲基 1,6,10十二烷三烯3醇 S-(Z)-3,7-dimethyl-2,6-Octadien-1-ol 12.162        1.38 桉叶油醇 Eucalyptol 12.238 1.68  0.76 0.69 10.68 芳樟醇 3,7-dimethyl-1,6-Octadien-3-ol 14.381    0.81 53.34  橙花叔醇 Nerolidol 27.058  10.30  8.17  醛类  Aldehyde        3甲基戊二醛 3-methyl- pentane 2.036      0.96  己烯醛 Hexenal 5.270 2.54  0.84    反式 2己烯醛 ( E)-2-Hexenal 6.712 3.18  3.41    酮类  Ketone        3羟基 2丁酮 3-hydroxy-2-Butanone 3.476 6.32        酯类  Ester        乙酸甲酯 Methyl acetate 1.819        2.11 乙酸 3己烯酯 ( Z)-acetate-3-Hexen-1-ol 11.395    0.31    乙酸己酯 Acetic acid，hexyl ester 11.621    0.42    乙酸 2己烯酯 ( E)-acetate-2-Hexen-1-ol 11.711    1.09    苯甲酸甲酯 Methylbenzoate 14.208    5.59 8.53  (S)-,-4三甲基 3环己烯 1甲醇（丙酸松油酯） ,-4-trimethyl-3-Cyclohexene-1-methanol, 17.307 2.98  0.44    其他  Others        甘醇酸 Hydroxy-acetic acid 1.520 15.45        柠檬腈 Geranyl nitrile 14.775      0.91  苯甲酸 Benzoic acid ， ethyl ester 16.547  4.04      4,8,12 三甲基 3,7,11十三烷三烯腈 4,8,12-trimethyl-3,7,11-Tridecatrienenitrile 27.330      5.36  注：“”未检测到或不存在。 Note： “” Not detected or not exist. Zhang Yiying，Li Wenqi ，L  Yingmin. Characterization of emitted volatiles and key genes in Lilium longiflorum Asiatic. 708                                                                        Acta Horticulturae Sinica，2018， 45 (4)：702716.  2.2  LA 百合不同开花时期花香成分释放规律分析  将 LA 百合品种爱神作为研究对象，以探讨不同开花进程和不同花器官上的差异（表 4）。该品种挥发物种类在开花的 5 个时期均不同，花蕾期 8 种，初开期 19 种，半开期 16 种，盛开期 17种，衰老期 7 种。总挥发性化合物相对含量在初开期和半开期达到峰值，随后呈下降趋势。 表 4  LA 百合爱神不同开花时期和花器官的挥发性化合物成分及相对含量  Table 4  Volatiles compositions and proportions of floral fragrance emitted from different developmental  floral stages and different floral parts of lily hybrid Freya  主要成分 Main component 保留时 间/min Retention time 相对含量 /% Relative content 花蕾期 Flower bud 初开期 Starting-opening 半开期 Mid- opening 盛开期 Mature 衰老期 Fully mature 花丝 Filament 花药 Anther 心皮 Carpels 烷烃类 Alkane          环己烷 Cyclohexane 2.742    0.22          萜烯类 Terpn        月桂烯 -Myrcene 10.882  0.48  0.60        柠檬烯 D-Limonene 12.146    3.79          反式罗勒烯 (E)-Ocimene 12.368  0.50  0.46        顺式罗勒烯 (Z)-Ocimene 12.701 1.42 8.96 1.33 8.29 7.31      石竹烯 Caryophyllene 23.587 28.23 17.17 13.05 23.64 7.02 44.90 7.54 16.34 石竹烯 -Caryophyllene 24.512 2.00 1.27 1.07    2.92    醇类 Alcohol        甲醇 Methyl Alcohol 1.516  0.93 0.87 0.92  2.32  2.96 乙醇 Methyl Alcohol 1.618            4.83  3己烯醇 3-Hexen-1-ol 6.617    0.11          反式 2己烯醇 (E)-2-Hexen-1-ol 7.033 15.06 17.90 17.03 17.66 23.23      顺式 2己烯醇 (Z)-2-Hexen-1-ol 7.057          3.11    环乙醇 Cyclohexanol 7.071            2.68  正己醇 1-Hexanol 7.154 22.42 17.66 22.75 12.86 14.83 15.61 6.60 1.23 2乙基 1己醇  2-ethyl-1-Hexanol 12.129  0.94            2甲基 1戊醇  2-Propyl-1-pentanol 12.137          1.10    桉叶油醇 Eucalyptol 12.238  0.44  0.76        芳樟醇 3,7-dimethyl-1,6-Octadien-3-ol14.381  0.73  0.81        , 4三甲基3 环己烯1甲醇  ,-4-trimethyl-3- Cyclohexene-1-methanol 17.307      0.44        醛类 Aldehyde          3己烯醛 ( Z)-3-Hexenal 5.208  0.49 0.81          正己醛 Hexenal 5.270 1.54 1.74 2.39 0.84  3.80 27.88 3.63 2己烯醛 ( E)-2-Hexenal 6.712 5.92 8.55 14.10 3.41 11.69 1.72 22.12  酯类 Ester          顺式 3己烯酯 (Z)-formate-3-Hexen-1-ol 6.733 9.41 8.40 11.39 6.23 8.87 3.40    乙酸 3己烯酯 (Z)-acetate-3-Hexen-1-ol 11.395  0.77 0.75 0.31        乙酸已酯 Acetic acid，hexyl ester  11.621  1.16 1.18 0.42        乙酸 2己烯酯  (E)-2-Hexen-1-ol， acetate 11.711