CRISPR_Cas9单碱基编辑技术创制抗除草剂拟南芥种质_陈易雨.pdf

引 用 格 式 ： 陈 易 雨 , 王 志 平 , 倪 汉 文 , 等 . CRISPR/Cas9 单 碱 基 编 辑 技 术 创 制 抗 除 草 剂 拟 南 芥 种 质 . 中 国 科 学 : 生 命 科 学 , 2017, 47: 1 1961 199, doi: 10.1360/N052017-00064英 文 版 见 ： Chen Y Y , W ang Z P , Ni H W , et al. CRISPR/Cas9-mediated base-editing system ef ficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis . SciChina Life Sci, in press, doi: 10.1007/s1 1427-017-9021-5 2017 中 国 科 学 杂 志 社 www .scichina.comCRISPR/Cas9单碱基编辑技术创制抗除草剂拟南芥种质陈易雨1 ,王志平2 ,倪汉文1 ,许勇3 ,陈其军2* ,姜临建1*1. 中 国 农 业 大 学 植 物 保 护 学 院 植 物 病 理 学 系 , 农 业 部 作 物 有 害 生 物 监 测 与 绿 色 防 控 重 点 实 验 室 , 北 京 100193;2. 中 国 农 业 大 学 生 物 学 院 , 植 物 生 理 与 生 化 国 家 重 点 实 验 室 , 北 京 100193;3. 国 家 蔬 菜 工 程 技 术 研 究 中 心 , 北 京 市 农 林 科 学 院 蔬 菜 研 究 中 心 , 农 业 部 园 艺 作 物 生 物 学 与 种 质 创 制 重 点 实 验 室 ( 华 北 ), 北 京 100097 同 等 贡 献* 联 系 人 , E-mail: qjchencau.edu.cn; jianglinjiancau.edu.cn收 稿 日 期 : 2017-03-10; 接 受 日 期 : 2017-03-20; 网 络 版 发 表 日 期 : 2017-05-10国 家 重 点 研 发 计 划 ( 批 准 号 : 2016YFD0101804) 、 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 批 准 号 : 31471785, 31670371) 和 公 益 性 行 业 ( 农 业 ) 科 研 专 项 ( 批 准 号 :201303022) 资 助CRISPR/Cas9 基 因 编 辑 系 统 因 其 高 效 、 廉 价 、 简单 、 通 用 等 特 点 , 引 发 了 基 因 编 辑 领 域 的 革 命 . 但 是 ,在 植 物 基 因 组 上 进 行 定 点 突 变 , 依 然 困 难 重 重 . 目 前的 技 术 路 线 是 , 将 含 有 突 变 的 DNA 模 板 通 过 修 复 Cas9产 生 的 DNA 双 链 断 裂 的 方 式 整 合 到 植 物 基 因 组 中 , 从而 实 现 目 标 区 域 中 的 点 突 变 . 整 合 机 制 包 括 同 源 末 端修 复 1 或 非 同 源 末 端 修 复 2 的 两 种 方 式 . 但 是 , DNA 模板 整 合 到 目 标 区 域 的 效 率 极 低 , 这 是 在 植 物 基 因 组 中产 生 定 点 突 变 的 最 大 技 术 障 碍 .近 期 , Komor 等 人 3 将 胞 嘧 啶 脱 氨 酶 (cytidine deam-inase, CD) 和 糖 苷 酶 抑 制 剂 (uracil glycosidase inhibitors,UGI) 分 别 融 合 到 Cas9n(D10A) 的 N 端 和 C 端 , 在 哺 乳动 物 基 因 组 上 实 现 了 定 点 突 变 . 其 机 理 是 , Cas9n 在sgRNA 的 引 导 下 与 靶 标 序 列 结 合 , 释 放 出 互 补 链 的 胞嘧 啶 碱 基 (C), 作 为 融 合 在 Cas9n 上 的 胞 嘧 啶 脱 氨 酶 的 底物 , 被 变 成 尿 嘧 啶 (U). Cas9n 在 sgRNA 互 补 链 上 产 生 缺口 , 使 得 随 后 的 DNA 修 复 过 程 更 多 的 以 对 侧 互 补 链 为修 复 模 板 , 将 U-G 碱 基 对 改 变 为 U-A 碱 基 对 . U-A 碱 基对 随 后 被 修 复 成 T-A, 从 而 实 现 了 C 到 T 的 单 碱 基 替 换 .单 碱 基 突 变 能 够 改 良 包 括 抗 除 草 剂 在 内 的 许多 重 大 农 艺 质 量 性 状 . 值 得 指 出 的 是 , 非 转 基 因 抗咪 唑 啉 酮 除 草 剂 作 物 , 如 水 稻 ( Oryza sativa ) 、 小 麦( T riticum aestivum ) 、 油 菜 ( Brassica campestris L.) 、 向日 葵 ( Helianthus annuus ) 和 玉 米 ( Zea mays ) 等 的 遗 传 基础 就 是 其 乙 酰 乳 酸 合 成 酶 基 因 (acetolactate synthase,ALS ) 的 单 碱 基 突 变 . 本 研 究 的 目 标 是 建 立 针 对 植物 基 因 组 的 单 碱 基 编 辑 技 术 体 系 , 并 通 过 对 拟 南 芥( Arabidopsis thaliana ) 的 ALS 基 因 进 行 单 碱 基 编 辑 来 创制 抗 除 草 剂 新 种 质 .为 此 , 本 研 究 组 首 先 合 成 了 经 过 玉 米 密 码 子优 化 的 CD-Cas9n-UGI( BE3 ) 基 因 , 然 后 用 BE3 替 换 了pHEE401E 载 体 4 上 的 zCas9 基 因 , 构 建 了 植 物 单 碱 基编 辑 载 体 pHEE901( 图 1A). 巧 合 的 是 , 拟 南 芥 ALS 基 因上 编 码 第 197 位 脯 氨 酸 的 密 码 子 是 “CCT”, 正 好 位 于 该单 碱 基 编 辑 系 统 的 “ 编 辑 窗 口 ”, 且 C 变 为 T 后 , 有 望 赋予 拟 南 芥 除 草 剂 抗 性 , 如 抗 苯 磺 隆 除 草 剂 . 因 此 , 本 研究 选 择 此 区 域 作 为 测 试 单 碱 基 编 辑 系 统 的 靶 标 位 点( 图 1B), 并 按 照 图 1A 中 所 示 方 法 将 其 克 隆 到 pHEE901中 国 科 学 : 生 命 科 学 2017 年 第 47 卷 第 1 1 期 : 1 196 1 199SCIENTIA SINICA V itae lifecn.scichina.com快 报 基 因 组 编 辑 在 遗 传 治 疗 和 农 业 上 的 应 用 专 题中 国 科 学 : 生 命 科 学 2017 年 第 47 卷 第 1 1 期1 197图1 单碱基编辑技术创制抗除草剂拟南芥种质A: pHEE901 载 体 的 T-DNA 区 域 以 及 靶 点 的 克 隆 方 法 示 意 图 . EC1.2en-EC1.1p(EC1fp) 卵 母 细 胞 特 异 性 融 合 启 动 子 , 启 动 经 过 玉 米 密 码 子 优 化的 BE3, Pol- 启 动 子 U6-26p 启 动 sgRNA 基 因 . RB/LB: T-DNA 右 / 左 边 界 ; E9t: rbcS E9 终 止 子 ; Hyg: 潮 霉 素 抗 性 基 因 ; B: sgRNA 及 其 靶 标 基 因的 序 列 对 比 . 图 中 注 明 了 预 期 的 C 到 T 突 变 后 编 码 的 氨 基 酸 . 红 色 箭 头 标 注 了 Cas9n 在 非 编 辑 链 (sgRNA 的 互 补 链 ) 产 生 缺 口 的 位 置 . HR: 除 草剂 抗 性 ; C: 4 个 含 有 C 到 T 突 变 的 T 1 代 单 株 在 “ 编 辑 窗 口 ” 的 测 序 峰 图 . 峰 图 下 方 是 PCR 克 隆 测 序 所 揭 示 的 等 位 基 因 序 列 及 编 码 的 氨 基 酸 . 红色 字 体 表 示 突 变 的 碱 基 和 氨 基 酸 ; D: 基 因 编 辑 的 T 1 植 株 的 T 2 后 代 表 现 出 明 显 的 除 草 剂 抗 性 . 图 片 只 选 取 了 有 代 表 性 的 #3-T 2 代 株 系 ; E: 具有 纯 合 G202D 突 变 植 株 ( 表 2 中 #1-7) 的 测 序 峰 图 , 显 示 出 了 P AM 区 序 列 TGG 被 编 辑 为 TGA, 很 可 能 是 单 碱 基 编 辑 系 统 的 新 靶 点 ; F: 未编 辑 的 T 1 株 系 , 在 T 2 代 出 现 抗 除 草 剂 植 株 . 播 种 8 天 后 喷 施 13.5 g ai hm 2 苯 磺 隆 , 并 于 除 草 剂 处 理 10 天 后 拍 照 ; G: 作 物 中 Pro197 的 保 守序 列 ; H: 作 物 ALS 基 因 上 “Pro197” 密 码 子 中 C 到 T 突 变 预 期 产 生 抗 除 草 剂 的 氨 基 酸 突 变载 体 上 . 构 建 好 的 载 体 转 入 农 杆 菌 GV3101 后 , 用 蘸 花法 转 化 拟 南 芥 . 收 获 的 种 子 在 含 有 25 mg/L 潮 霉 素 的MS 培 养 基 上 筛 选 后 , 将 幼 苗 移 栽 到 营 养 土 中 , 随 后 提取 单 株 DNA, 并 通 过 PCR 扩 增 含 有 靶 点 的 片 段 ( 所 用 引物 见 表 1), 来 检 测 单 碱 基 编 辑 情 况 .测 序 结 果 表 明 , 在 240 株 T 1 代 植 株 中 , 有 4 株 (#14)发 生 C 到 T 的 定 点 突 变 , 均 位 于 “ 编 辑 窗 口 ” 中 ( 图 1C),因 此 T 1 代 植 株 C 到 T 的 突 变 率 约 为 1.7%. 测 序 峰 图 表明 , 这 4 株 的 编 辑 类 型 是 杂 合 、 嵌 合 或 双 等 位 基 因 突变 ( 图 1C). 为 了 确 定 具 体 的 突 变 类 型 , 对 PCR 产 物 进 行了 克 隆 测 序 ( 图 1C). 结 果 显 示 , 株 系 #1 只 有 一 个 等 位 基因 被 编 辑 , 且 没 有 改 变 编 码 的 氨 基 酸 . 株 系 #2 是 嵌 合突 变 体 , 由 两 种 类 型 的 突 变 (P197L 和 P197F) 以 及 野 生型 组 成 . 株 系 #3 是 含 有 一 个 编 辑 过 的 等 位 基 因 (P197F)陈 易 雨 等 : CRISPR/Cas9 单 碱 基 编 辑 技 术 创 制 抗 除 草 剂 拟 南 芥 种 质1 198表1 本研究中所用引物名 称 序 列 (53)BE3-IDF catacctcccagaacacaaataagcBE3-IDR actgaagggcaatagtgaagaatgtoALS-T1F attgaagtccctcgtcgtatgatoALS-T1R aaacatcatacgacgagggacttU626-IDF tgtcccaggattagaatgattaggctE9-IDR2 ttcccaatgccataatactcaaactcagtE9-IDR cattagaggccacgatttgacacatALS-F ccttaacccgctcttcctcaALS-R ccccgtaagctcaacaaacc和 野 生 型 的 杂 合 体 . 株 系 #4 的 两 个 等 位 基 因 都 发 生 了编 辑 , 但 是 只 有 其 中 一 个 编 码 了 不 同 的 氨 基 酸 (P197S).总 之 , 通 过 一 次 转 化 , 即 获 得 了 所 有 可 能 的 3 种 氨 基 酸突 变 类 型 : 其 中 P197S 和 P197L 是 已 知 的 抗 除 草 剂 突 变 ,而 P197F 突 变 能 否 带 来 除 草 剂 抗 性 , 文 献 未 有 报 道 5 .为 了 明 确 这 些 点 突 变 能 否 有 效 的 遗 传 给 下 一 代 ,以 及 是 否 具 有 预 期 的 除 草 剂 抗 性 , 用 含 有 5 mg/L 苯 磺隆 但 不 含 潮 霉 素 的 MS 板 对 4 个 编 辑 过 的 T 1 株 系 的 T 2 代种 子 进 行 筛 选 . 株 系 #2, #3, #4 的 T 2 代 抗 除 草 剂 个 体 的比 例 分 别 为 91.3%(46 株 中 有 42 株 ), 85.1%(94 株 中 有 80株 ) 和 75.8%(124 株 中 有 94 株 )( 图 1D). T 1 代 中 株 系 #4 被编 辑 的 两 个 等 位 基 因 中 只 有 一 个 有 除 草 剂 抗 性 , 由 于靶 标 序 列 的 改 变 , 导 致 这 两 个 编 辑 过 的 位 点 很 难 在 T 2代 中 再 次 被 编 辑 . 因 此 , #4 株 系 的 T 2 代 中 理 论 上 有 75%的 个 体 具 有 除 草 剂 抗 性 . 结 果 (75.8%) 与 预 期 相 符 , 表明 T 1 代 的 点 突 变 是 能 够 通 过 生 殖 细 胞 正 常 传 递 到 下一 代 . #2 和 #3 株 系 在 T 1 代 都 含 有 未 编 辑 的 等 位 基 因 ,因 此 T 2 代 时 能 够 被 再 次 编 辑 而 产 生 除 草 剂 抗 性 . 这 在很 大 程 度 上 导 致 了 这 两 个 株 系 T 2 代 的 抗 性 植 株 比 例(#2 和 #3 分 别 是 91.3% 和 85.1%) 明 显 高 于 #4 株 系 . 为 了进 一 步 证 明 T 1 代 突 变 能 够 有 效 传 代 , 本 研 究 组 进 一 步鉴 定 了 部 分 T 2 代 抗 除 草 剂 植 株 的 基 因 型 ( 图 1D). 结 果表 明 , #2, #3 和 #4 株 系 的 T 2 代 均 含 有 T 1 代 的 点 突 变 . 其中 , #2 株 系 的 19 株 T 2 代 抗 除 草 剂 植 株 中 有 10 株 , #3 株系 的 20 株 抗 性 植 株 中 有 7 株 是 含 P197F 纯 合 突 变 ( 表 2),表 明 P197F 是 一 种 新 的 抗 除 草 剂 突 变 . 此 外 , 在 64 株 T 2代 抗 性 植 株 中 鉴 定 出 了 6 株 非 转 基 因 植 株 , 具 有 纯 合(P197F) 或 两 个 等 位 基 因 突 变 ( 表 2). 这 些 结 果 证 明 , 单碱 基 编 辑 产 生 的 除 草 剂 抗 性 突 变 能 够 高 效 地 遗 传 给下 一 代 .表2 T 1代及其T 2代抗除草剂单株的基因型a)株 系 基 因 型野 生 型 GTCCCT(N 1 1 )TGGT 1 #1 GTYCCT(N 1 1 )TGGT 2 #1-1, -5, -6 GTYYYT(N 1 1 )TGR#1-2, -3#1-4#1-7GTTYYT(N 1 1 )TGRGTYYCT(N 1 1 )TGRGTTCCT(N 1 1 )TGAT 1 #2 GTYYYT(N 1 1 )TGGT 2 #2-1, -2, -3, -6, -14, -16, -17 GTYYYT(N 1 1 )TGG#2-4, -5 * , -8, -9, -10 * , -1 1 * , -13, -12, -15, -18#2-7GTTTTT(N 1 1 )TGGGTTYYT(N 1 1 )TGGT 1 #3 GTYYYT(N 1 1 )TGGT 2 #3-1, -2, -7, -8, -9, -15, -16, -17, -18, -20 GTYYYT(N 1 1 )TGG#3-3, -6, -10, -1 1, -12, -13, -14#3-4#3-5#3-19GTTTTT(N 1 1 )TGGGTYYCT(N 1 1 )TGRGTYYYT(N 1 1 )TGRGTYCCT(N 1 1 )TGRT 1 #4 GTTYCT(N 1 1 )TGGT 2 #4-1, -4, -1 1, GTTTCT(N 1 1 )TGG#4-2, -7, -15, -16, -18#4-3, -5, -6 * , -8 * , -9, -10, -12, -13, -14, -17, -19 *GTTYCT(N 1 1 )TGRGTTYCT(N 1 1 )TGGa) *: PCR 鉴 定 出 的 非 转 基 因 单 株 ; R: G 和 A 的 混 合 信 号 ; Y : C 和 T 的 混 合 信 号 ; N 1 1 : “ 脱 氨 酶 编 辑 窗 口 ” 和 P AM 之 间 的 1 1 个 碱 基中 国 科 学 : 生 命 科 学 2017 年 第 47 卷 第 1 1 期1 199虽 然 #1 株 系 在 T 1 代 没 有 抗 除 草 剂 突 变 , 但 是 其7.6% 的 T 2 代 植 株 表 现 出 了 除 草 剂 抗 性 , 表 明 在 T 1 代 未被 编 辑 的 等 位 基 因 很 可 能 在 T 2 代 时 被 编 辑 成 抗 性 突 变类 型 . PCR 产 物 测 序 结 果 显 示 , 多 数 T 2 代 抗 性 植 株 的 确含 有 预 期 的 抗 除 草 剂 突 变 ( 表 2). 但 是 , 64 株 T 2 代 植 株中 有 15 株 的 P AM 序 列 “TGG” 被 编 辑 成 了 “TGA”( 表 2),造 成 G202D 突 变 . 并 且 , 在 T 2 代 抗 性 植 株 中 发 现 了 一株 G202D 纯 合 植 株 ( 图 1E). 虽 然 该 植 株 ( 表 2 中 #1-7) 在“ 编 辑 窗 口 ” 有 C 到 T 突 变 , 但 未 改 变 表 达 的 氨 基 酸 , 因此 , G202D 很 可 能 是 单 碱 基 编 辑 技 术 产 生 的 又 一 新 的抗 性 突 变 类 型 . P AM 序 列 “TGG” 被 编 辑 成 了 “TGA” 的现 象 , 在 哺 乳 动 物 细 胞 3 或 T 0 水 稻 中 均 未 发 现 6 8 .用 类 似 的 单 碱 基 编 辑 系 统 编 辑 水 稻 , T 0 代 具 有2.7%40% 的 效 率 6 8 , 本 研 究 中 T 1 代 的 编 辑 效 率 (1.7%)相 对 偏 低 . 根 据 CRISPOR 9 和 CRISPRscan 程 序 1 0 的 预测 , 所 选 靶 点 的 打 靶 效 率 很 低 , 这 可 能 是 导 致 本 研 究中 编 辑 效 率 低 的 原 因 之 一 . 此 外 , 本 研 究 使 用 的 是 卵母 细 胞 特 异 性 启 动 子 , 其 瞬 时 表 达 的 特 性 可 能 是 导 致效 率 偏 低 的 另 一 原 因 . 但 是 , 卵 母 细 胞 特 异 性 启 动 子提 高 了 突 变 的 传 代 效 率 , 极 大 地 抵 消 了 T 1 代 的 突 变 效率 低 的 问 题 . 另 外 , 筛 选 抗 除 草 剂 突 变 个 体 的 通 量 高且 成 本 低 , 所 以 除 草 剂 处 理 后 在 未 被 编 辑 T 1 株 系 的 T 2后 代 中 出 现 了 大 量 ( 约 6%) 的 抗 性 植 株 ( 图 1F).最 后 , 由 于 本 研 究 中 的 ALS 基 因 靶 点 区 域 在 许 多植 物 中 高 度 保 守 ( 图 1G 和 H), 因 此 可 以 直 接 对 作 物 中的 对 应 位 点 进 行 单 碱 基 编 辑 . 值 得 指 出 的 是 , 国 外 广泛 种 植 的 非 转 基 因 抗 除 草 剂 大 豆 ( Glycine max (Linn.)Merr .), 就 是 其 ALS 基 因 上 的 P178S 突 变 1 1 , 即 本 研 究中 拟 南 芥 ALS 基 因 的 P197S 突 变 . 此 外 , 第 一 个 基 因 编辑 作 物 抗 除 草 剂 油 菜 , 已 经 被 监 管 部 门 认 定 为非 转 基 因 作 物 , 并 于 2015 年 在 美 国 推 广 种 植 1 2 . 本 研究 组 已 将 原 先 在 单 子 叶 、 双 子 叶 植 物 中 的 高 效 基 因编 辑 载 体 (pHSE401E, pBSE401, pKSE401, pHUE41 1,pBUE41 1 1 3 ) 中 的 Cas9 替 换 为 BE3, 分 别 构 建 了 名 为pHSE901, pBSE901, pKSE901, pHUE91 1, pBUE91 1 的单 碱 基 编 辑 载 体 . 这 些 单 碱 基 编 辑 载 体 为 在 单 双 子 叶作 物 中 实 现 定 点 突 变 , 包 括 定 点 抗 除 草 剂 突 变 , 提 供了 高 效 工 具 .参考文献1 Sun Y, Zhang X, W u C, et al. 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