不同地区金线莲种质资源品质分析及综合评价

不同地区金线莲种质资源品质分析及综合评价 何淑敏，张静芳，谢倩，马文霞，倪玉洁，叶清华，陈清西* 福建农林大学园艺学院，福州  350002 摘 要：为筛选优质的金线莲种质资源，以13个来源于不同地区的金线莲种质为材料，分析测量了其表观性状和相关的功能成分含量。结果表明：金线莲的含水率较高，为85.07%-90.91%，醇溶性浸出物含量为13.62%-41.71%，总黄酮含量为8.15 mg/g  - 40.72 mg/g，多糖含量为2.10% - 25.61%；种质之间含水率差异较小，但醇溶性浸出物等功能成分差异显著；醇溶性浸出物含量与总黄酮含量呈正相关，含水率、多糖含量与醇溶性浸出物、总黄酮呈负相关；台湾金线莲、云南大圆叶金线莲和福建大叶金线莲综合评价得分最高；湖南郴州金线莲中醇溶性浸出物含量达41.71%、总黄酮含量为40.72 mg/g，显著高于其它品种；5种福建金线莲品种（系）的醇溶性浸出物和总黄酮含量最少，多糖含量较高。综上：台湾金线莲、云南大圆叶金线莲、福建大叶金线莲和湖南郴州金线莲利用价值高，推广前景广阔。 关键字：金线莲；种质资源；有效成分含量；品种筛选  中图分类号：R926；S681.9     文献标识码：A Analysis and comprehensive evaluation of the quality of Anoectochilus roxburghii germplasm resources in different regions HE Shu-min, ZHANG Jing-fang, XIE Qian, MA Wen-xia, NI Yu-jie, YE Qing-hua, CHEN Qing-xi*College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China Abstract: In order to select Anoectochilus roxburghii varieties to plant tissue culture, this experiment analyzed 13 different varieties (lines) view apparent character and functional components contents of Anoectochilus roxburghii. And it shows that different varieties of Anoectochilus roxburghii with high water content from 85.07% to 90.91%. however, it is poor in records of the level；The content of alcohol soluble extractive is 13.62%-41.71%, the content of total flavonoids is 8.15 mg/g -40.72 mg/g, the polysaccharide content in the range of 2.10%-25.61%. It shows that the alcohol soluble extractive content positively correlated with total flavonoids of roxburghii, moisture content and polysaccharide content is negatively correlated with them; there are three kinds of Anoectochilus roxburghii which possesses higher comprehensive score.  There are Anoectochilus formosanus, large circular leaf Anoectochilus Yunnanensis, Large leaf Anoectochilus Fujianensis. In Chenzhou Anoectochilus Hunanensis, gathered a lot of nutrients, soluble extract content alcohol is 41.71%, the content of total flavonoids is 40.72 mg/g, significantly higher than other varieties; And 5 varieties (lines) of Anoectochilus roxburghii from Fujians alcohol soluble extract and total flavonoids content being the lowest, the content of polysaccharide. So choosing promote  Anoectochilus formosanus, Large leaf Anoectochilus Yunnanensis, Large leaf Anoectochilus Fujianensis and Anoectochilus Chenzhou Hunanensis can be more conducive to the accumulation of effective components and ornamental material.  Key words: Anoectochilus roxburghii; germplasm resources; functional components; variety selection 金线莲（Anoectochilus roxburghii）为兰科开唇兰属的多年生草本类植物，主要分布于网络出版时间：2018-04-20 17:17:11网络出版地址：http:/kns.cnki.net/kcms/detail/51.1335.Q.20180420.1716.010.html福建、台湾、广东、广西、海南、云南等亚热带及热带地区。金线莲有“药王”、“金草”、“乌人参”等美称，全草可作药用，具有清热凉血、除湿解毒功效1。已报道金线莲的有效成分有很多，其中黄酮类和多糖被推测为该药材中的主要活性成分2。 由于野生型金线莲对生存环境要求高，加上人为过度开采，导致野生型金线莲总量日趋减少。目前多采用植物组织离体培养技术进行大规模培育，用来弥补野生金线莲的不足3,4。刘润东等5研究野生金线莲与部分组培苗有效成分含量的差异，指出虽然野生型多糖含量优于组培型金线莲，总体而言组培金线莲可以补足野生种的市场份额。近年来由于市场上组培金线莲品种众多，品种之间的差别及各品种间的功效成分含量如何鲜有报道。本研究采用引进的13个金线莲资源为试验材料，通过对形态指标和生理指标的观测，对金线莲种质资源进行评价，为选育、推广优良组培品种金线莲提供理论依据。 1  材料与方法 1.1  供试材料 2012年始，福建省漳浦县扬基园艺发展有限公司（下称扬基公司）分别从不同地区引进了13个金线莲资源（编号如表1），经茎段组织培养后，种植在扬基大棚进行培养，每批苗生长周期为4个月。分别于2016年8月、10月进行采样。采集的金线莲样品使用双蒸水洗净后观测形态指标，冻干测量含水率，再粉碎至60目于-40 保存待用。 表 1  金线莲种质资源编号与植株主要性状 Table 1  The number and main characters of Anoectochilus roxburghii  编号 No 中文名 Chinese name 引种地区 Introduction area 叶片形状 Vane shape 叶片颜色 Leaf color 叶脉颜色 Vein color 1 红霞金线莲Hongxia 福建南靖 Fujian.Nanjing 椭圆 Ellipse 墨绿 Blackish green 金色 Golden 2 大圆叶金线莲 Dayuanye 云南石屏 Yunnan.Shiping 卵圆 Oval 墨绿 Blackish green 金色 Golden 3 台湾金线莲 Taiwan 台湾台北 Taiwan.Taipei 卵圆 Oval 深绿 Bottle green 银色 Silver 4 尖叶金线莲 Jianye 福建南靖 Fujian.Nanjing 卵圆 Oval 墨绿 Blackish green 金色 Golden 5 圆叶金线莲 Yuanye 福建南靖 Fujian.Nanjing 卵圆 Oval 墨绿 Blackish green 金色 Golden 6 大叶金线莲 Daye 福建南靖 Fujian.Nanjing 卵圆 Oval 墨绿 Blackish green 金色 Golden 7 广西金线莲 Guangxi 广西河池 Guangxi.Hechi 卵圆 Oval 墨绿 Blackish green 金色 Golden 8 福建金线莲 Fujian 福建漳浦 Fujian.Zhangpu 心形 Heart-shaped 绿色 Green 金色 Golden 9 郴州金线莲 湖南郴州 窄卵 墨绿 银色 Chenzhou Hunan.Chenzhou Narrowly ovoid Blackish green Silver 10 韶关金线莲 Shaoguan 广东清远 Guangdong.Qingyuan卵圆 Oval 墨绿 Blackish green 金色 Golden 11 海南金线莲 Hainan 海南 Hainan 卵圆 Oval 墨绿 Blackish green 金色 Golden 12 清远金线莲 Qingyuan 广东清远 Guangdong.Qingyuan椭圆 Ellipse 墨绿 Blackish green 金色 Golden 13 安徽金线莲 Anhui 安徽六安 Anhui.Liuan 窄卵 Narrowly ovoid 深绿 Bottle green 银色 Silver 1.2  仪器与试剂 四环LGJ-25C冷冻干燥机；FW177中草药粉碎机；UV WinLab V6型紫外可见分光光度计；KQ-600DE型数控超声波清洗器； XMTD-8222型电热恒温水浴锅；Allegra 64R型高速冷冻离心机；XMTD-8222精密型强制对流干燥箱。无水葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇、芦丁、亚硝酸钠 、亚硝酸铝、氢氧化钠等，均为国药分析纯；水为双蒸水。 1.3  试验方法 1.3.1  园艺性状观测 随机选取30株金线莲鲜样进行形态指标测定，用直尺测量茎长、叶片长度、叶片宽度；用游标卡尺测量茎粗。 1.3.2  功能成分测量 1.3.2.1含水率测定 采用冻干法测量其含水率得：含水率=M2- M1M1100%（注：M1为样品冻干前的重量；M2为样品冻干后的重量）。 1.3.2.2 醇溶性浸出物的测定 醇溶性浸出物的测定方法参照中华人民共和国药典2010版（一部）附录VA项建立操作流程6。 1.3.2.3 总黄酮含量测定 总黄酮含量的制备参照李丹丹7稍加修改。以芦丁含量为横坐标（A），吸光度为纵坐标绘（C）制标准曲线:A=0.39C-0.0063 （R2=0.9983）。 称取0.200 g样品粉末于10 mL试管中，加入4 mL浓度为90%的乙醇溶液，混匀后超声提取（温度70，功率300 W）30 min。冷却后离心（8000 rpm）5 min，取上清液，重复提取两次得总黄酮提取液。吸取提取液6 mL，按照绘制标准曲线的方法，在波长500 nm下测定吸光度。按回归方程计算出溶液中总黄酮含量，根据稀释倍数及样品质量换算出样品中总黄酮的含量。重复3次。 1.3.2.4 多糖含量的测定 多糖含量测定参照张锦雀8稍加改动。以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖含量（C）为横坐标绘制标准曲线:A=0.009C-0.0066 (R2=0.9919) 。  称取样品粉末0.1 00g，加入双蒸水5 mL，混匀后超声提取（温度65，功率300 W）30 min，提取两次。提取后将样品定容至25 mL，离心（转速为6000 rmin-1）20 min后取上清液2 mL置50 mL离心管中，加入无水乙醇10 mL，摇匀，4冷藏1 h。取出样品后4离心（转速为6000 rpm）20 min，弃上清液并将沉淀物加水溶解，定容至25 mL即得样品液。取样品液1 mL，在波长630 nm下测定吸光度，重复3次，根据稀释倍数及样品质量换算出样品中多糖的含量。 1.4 数据统计与分析 利用 Excel 2013和SPSS 22.0软件进行数据统计与分析，多重比较采用Duncan新复极差法。 2  结果与分析 表 2  不同来源金线莲种质资源植株性状 Table 2  Plant traits of Anoectochilus roxburghii resources in different sources 编号 No 茎长 /cm Stem length 茎粗/mm Stem diameter 叶片长度/cm  Leaf length 叶片宽度/cm Leaf width 含水率/% Moisture content醇溶性浸出物含量/% Alcohol extraction 总黄酮含量/ mg/gTotal flavonoids 多糖含量/% Polysaccharide content 1 4.98 2.28 2.72 2.10 89.27 24.03 8.51 25.31 2 9.72 2.70 3.30 2.52 88.79 32.85 8.15 25.61 3 7.80 2.69 3.22 2.64 90.91 26.10 12.30 21.63 4 7.20 2.13 3.20 1.88 88.74 13.62 8.17 22.78 5 7.94 2.24 2.70 2.00 87.06 20.45 8.76 25.50 6 10.22 2.57 3.00 2.20 89.82 20.78 11.52 18.44 7 4.32 3.01 1.90 1.58 89.97 36.76 20.23 19.36 8 4.70 2.29 2.52 2.02 85.07 22.21 8.88 24.71 9 3.20 3.64 3.80 1.90 86.22 41.71 40.72 16.83 10 4.32 2.11 3.40 2.18 86.30 30.75 16.71 13.78 11 3.70 1.90 1.92 1.64 88.33 35.38 18.69 16.47 12 5.06 2.00 2.58 1.86 85.50 30.26 17.23 2.10 13 2.66 2.94 2.78 1.70 86.83 36.23 19.90 13.37 2.1  不同来源金线莲种质资源植株性状分析 由表2可以看出，不同来源金线莲种质资源性状差异较大。茎长分布范围在2.66-10.22 cm，其中6号植株茎最长，13号茎最短；茎粗为1.90-3.64 mm，9号茎粗最大，达到3.64 mm，11号茎粗最小；叶片长为1.90-3.80 cm，9号叶片最长，7号叶片最短；叶片宽度为1.58-2.64 cm，3号叶片最宽，7号叶片最窄。 2.2 不同来源金线莲种质资源功能成分分析 2.2.1  金线莲含水率的比较  从图1看出，金线莲含水率较高，含水率变化幅度在85.07%-90.91%之间，其组间含水率相差较小，品种间无显著性差异（P<0.05，下同）。8号福建漳浦金线莲含水率最低，为85.07%；3号台湾台北金线莲含水率最高，达到90.91%。 注：字母不同表示 0.05水平差异显著。(下同) Note: Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level（similarly hereinafter） 图 1  不同来源金线莲种质资源的含水率  Fig. 1  The water content of different sources of Anoectochilus roxburghii  2.2.2  金线莲醇溶性浸出物含量的比较 由图2可知，不同来源金线莲种质资源醇溶性浸出物含量变化幅度在13.62%-41.71%之间，组间相差较大，有显著性差异。其中9号湖南彬州金线莲的醇溶性浸出物含量最高达41.71%；7号、13号、11号金线莲的醇溶性浸出物含量较高，分别为36.76%、36.23%和35.38%，跟其它相比有显著差异；4号尖叶金线莲醇溶性浸出物含量最低仅为13.62%；1号、5号、6号和8号金线莲醇溶性浸出物含量较少且差异不显著。 图 2  不同来源金线莲种质资源的醇溶性浸出物含量 Fig. 2  The alcohol extraction content of Anoectochilus roxburghii with different sources  2.2.3  金线莲总黄酮含量的比较  如图3所示，13种不同来源金线莲种质资源总黄酮含量变化幅度为8.15 mg/g - 40.72 mg/g，差异显著。其中9号金线莲总黄酮含量最高，达到40.72 mg/g，显著高于其他金线莲；1号、2号、4号、5号、8号金线莲除2号来源于云南外其余来自福建，总黄酮含量皆小于10 mg/g，品种之间差异不显著，但与其他品种相比较显著小于其他品种。7号和10 - 13号金线莲总黄酮含量相比较也有显著差异，但含量也达到15%。 图 3  不同来源金线莲种质资源的总黄酮含量  Fig. 3  The total flavonoids content of Anoectochilus roxburghii with different sources 2.2.4  金线莲多糖含量的比较 图4所示，不同金线莲的多糖含量存在显著差异，多糖含量变化幅度为2.10%-25.61%。12号清远金线莲多糖含量最少，仅为2.10%，显著小于其它金线莲；2号金线莲多糖含量最高，含量为25.61%；1号、2号、5号和8号的多糖含量较高，均大于25%，且种质之间差异不显著。其余品种金线莲之间也有显著差异。 图4  不同来源金线莲种质资源的多糖含量  Fig. 4  The polysaccharide content of Anoectochilus roxburghii with different sources 2.3  不同来源金线莲种质资源的品质性状变异及相关性分析 不同种质金线莲品质性状变异情况如表3所示，含水率变异系数最小仅为2.12%，说明种质之间差异不明显；茎长和总黄酮含量的变异系数最大，分别为42.37%和58.33%，说明种质的不同对株高和总黄酮的积累影响最大；叶宽、叶长和茎粗变异系数分别为15.67%、19.40%和19.73%，醇溶性浸出物、多糖和总黄酮变异系数分别为28.38%和35.32%，功能成分的变异大于表观性状的变异，说明金线莲种质不同对这两种品质都有影响，且对功能成分的影响大于表观性状。 表 3  不同来源金线莲种质资源的品质性状变异情况 Table 3  Variation of quality traits of Anoectochilus roxburghii with different sources 性状 Character 数量Number 最小值Minimum 最大值Maximum平均值Average value 标准偏差Standard deviation 变异系数/% Coefficient of variation茎长/cm  Stem length 13 2.660 10.220 5.832 2.471 42.37 茎粗/mm  Stem diameter 13 1.896 3.644 2.499 0.493 19.73 叶长/cm  Leaf length 13 1.904 3.8 2.850 0.553 19.40 叶宽/cm  Leaf width 13 1.580 2.64 2.017 0.316 15.67 含水率/%  Moisture content 13 85.070 90.91 87.908 1.862 2.12 醇溶性浸出物含量/%Alcohol extraction  13 13.620 41.71 28.548 8.103 28.38 总黄酮含量/ mg/g Total flavonoids 13 8.150 40.723 15.367 8.963 58.33 多糖含量/% Polysaccharide  13 2.100 25.61 18.915 6.681 35.32 不同种质金线莲相关性分析，结果如表4，叶宽与茎长、叶长呈显著正相关，相关系数为0.676和0.588；醇溶性浸出物含量和总黄酮含量与茎长呈显著负相关，相关系数为-0.580和-0.604，与茎粗呈显著正相关，相关系数为0.556和0.661；总黄酮含量与醇溶性浸出物含量呈极显著正相关，相关系数达到0.776。而其他指标之间相关性不显著。 表4  不同来源金线莲种质资源各指标相关性分析  Table 4  Correlation analysis of various indicators of Anoectochilus roxburghii with different sources 项目 Items 茎长Stem length 茎粗Stem diameter 叶长Leaf length叶宽Leaf width含水率Moisture content醇溶性浸出物含量Alcohol extraction 总黄酮含量 Total flavonoids 多糖含量Polysaccharide茎长Stem length 1 -0.145 0.262 0.676*0.494 -0.580*-0.604*0.428 茎粗Stem diameter  1 0.376 0.005 0.119 0.556*0.661*0.084 叶长Leaf length   1 0.588*-0.092 -0.053 0.216 0.080 叶宽Leaf width    1 0.321 -0.294 -0.400 0.371 含水率Moisture content     1 -0.168 -0.285 0.410 醇溶性浸出物含量Alcohol extraction 1 0.776*-0.422 总黄酮含量Total flavonoids 1 -0.459 多糖含量Polysaccharide        1 注：*.相关性在 0.05 水平上显著；*.相关性在 0.01 水平上极显著 Note:*.The correlation was significant at the 0.05 level; * The correlation was extremely significant at the 0.01 level 2.4  不同金线莲种质品质性状主成分分析 由于金线莲各指标的计量单位各不相同，量纲也大不一样，对其指标进行标准化再进行主成分分析和聚类分析。遵循主成分的两个标准：特征值大于1，累计贡献率大于80%，可说明部分主成分已提供原始数据足够的信息。由表5可知，前3个因子的累计贡献率达到81.61%，且特征根都大于1，符合分析要求。则提取前三个变量作为主成分因子进行旋转处理（表6）对金线莲加以描述。 表 5  特征根与积累方差贡献率 Table 5  Eigenvalue and variance contributing rate  因子 Factor 起始特征值 Initial eigenvalue 提取平方和载入 Extracting square sum and loading 旋转平方和载入 Rotation Sums of Squared Loadings 合计Footing 方差的% Variance 累计% Cumulation合计Footing方差的% Variance 累计 % Cumulation 合计Footing 方差的% Variance 累计 % Cumulation1 3.416 42.706 42.706 3.416 42.706 42.706 2.601 32.507 32.507 2 1.960 24.497 67.203 1.960 24.497 67.203 2.018 25.226 57.733 3 1.153 14.407 81.610 1.153 14.407 81.610 1.910 23.877 81.610 4 0.661 8.269 89.879 5 0.370 4.621 94.500 6 0.255 3.183 97.683 7 0.120 1.497 99.180 8 0.066 0.820 100.000 如表6，由各指标在三个主成分中的载荷值可知，第一主成分的茎粗、醇溶性浸出物和黄酮的系数比较大，分别为0.885、0.835和0.882；第二主成分的含水率和多糖的系数较大，分别为0.892和0.726；第三个主成分得叶长和叶宽系数较大，分别为0.930和0.805。 表 6  主成分分析旋转后载荷矩阵 Table 6  Rotated component matrix of principle components 变量   因子Factor Variable 1 2 3 茎长Stem length -0.456 0.561 0.512  茎粗Stem diameter 0.885  0.220 0.235  叶长Leaf length 0.219  -0.112 0.930  叶宽Leaf width -0.222 0.353 0.805  含水率Moisture content 0.020  0.892 -0.033  醇溶性浸出物含量Alcohol extraction 0.835  -0.228 -0.211  总黄酮含量Total flavonoids 0.882  -0.377 -0.040  多糖含量Polysaccharide -0.190 0.726 0.180  根据主成分分析得出综合排名，如表7、3号台湾金线莲、2号云南大圆叶金线莲和6号福建大叶金线莲总得分最高。其中3号金线莲综合排名最高，12号金线莲排名最低；9号金线莲第一主成分和第二主成分排名均是最高；7号金线莲第三主成分排名最高。  表 7  金线莲个品种（系）综合得分 Table 7  Composite score of Anoectochilus roxburghii  编号Number 得分Score 排名 Ranking因子1 Factor1 因子2 Factor2 因子3 Factor3 主成分1 Companent1主成分2 Companent2主成分3 Companent3综合 Composite 1 0.620  -0.305  0.571  0.385  -0.215  0.413  0.207  5 2 1.028  1.193  0.032  0.637  0.840  0.023  0.520  2 3 1.042  1.183  0.364  0.646  0.833  0.263  0.591  1 4 0.976  -0.448  -0.316  0.605  -0.316  -0.229  0.076  6 5 0.791  -0.496  -0.170  0.490  -0.349  -0.123  0.052  7 6 1.026  0.412  0.152  0.636  0.290  0.110  0.375  3 7 -0.817  -0.296  2.323  -0.507  -0.208  1.681  0.225  4 8 0.217  -0.834  -0.627  0.135  -0.587  -0.454  -0.260  9 9 -1.833  2.111  -0.364  -1.136  1.486  -0.263  -0.070  8 10 -0.289  0.028  -1.524  -0.179  0.020  -1.103  -0.387  12 11 -0.702  -1.395  0.936  -0.435  -0.982  0.678  -0.279  10 12 -0.838  -1.133  -1.501  -0.519  -0.798  -1.086  -0.770  13 13 -1.221  -0.021  0.124  -0.757  -0.015  0.090  -0.280  11 3  讨论  随着医疗界对天然药物研究与应用的增多，醇溶性浸出物、多糖、总黄酮等大分子物质具有杀菌、抗氧化、治疗癌症的效果在何首乌9、白花蛇舌草10、鱼腥草11和沙棘12等有大量研究。且有研究得金线莲做药用时自身合成的多糖有降低血糖、血脂、清除体内自由基13-14的功效。本实验从测定不同种质金线莲的指标得出，不同种质金线莲的表观性状与功能成分含量均有显著性差异。从外形分析得，2号和6号金线莲生长速度最快、植株最高，但小于植物志记载株高在15-25cm的正常高度范围15；2号、3号、6号、9号和10号金线莲叶长和叶宽大于其它种质，整体外形具有很高的欣赏价值。从功能成分分析得知，金线莲含水率较高，达到85%-91%，与刘润东5所得结论一致。金线莲的多糖含量在2%-26%，品种间差异较显著，12号广东清远金线莲多糖含量仅为2%，远远小于施满容等16测得多糖含量；其余多数金线莲多糖含量在18%-26%之间，与张赛男17研究结果一致；引进的5种福建金线莲的醇溶性浸出物和总黄酮含量均较低，小于谭嘉娜等18测定结果，但醇溶性浸出物含量皆高于钟添华制定大于10%的限度19。9号湖南金线莲的醇溶性浸出物、总黄酮含量均较高，分别为41.714%和40.723 mg/g，因该品种金线莲报道较少，可以为以后的研究提供参考。 变异系数又称离散系数，反映单位均值上的离散程度，对所有金线莲的各指标进行变异系数分析可以得出种质不同对各指标的影响程度。分析得出含水率受种质的不同影响较小，其变异系数最小仅2.12%；而总黄酮含量受品种的影响最大，高达58.33%；其次是茎长和多糖含量，分别为42.37%和35.32%；醇溶性浸出物的含量也跟品种有关，变异系数为28.38%。由相关性分析得出，醇溶性浸出物含量与总黄酮含量呈极显著正相关，二者与多糖含量呈负相关。对此梁峥等20指出，醇溶性浸出物是指能溶于醇的物质，而在金线莲成分中游离总黄酮类、生物碱、甾体类化合物都能溶于醇，所以醇溶性浸出物总含量受总黄酮的影响较大；总黄酮属于次生代谢物质，多糖属于初生代谢物质，而高等植物的次级代谢与