青浦地区生菜腐烂病原分离鉴定及致病性测定.pdf

 年第卷第期 l  收稿日期： - - 基金项目： 上海市青浦区 年度财政预算专项 作者简介： 刘彬 （）， 男， 农艺师， 硕士， 从事蔬菜植保技术研究和推广工作，  -     ：           .    。 通信作者： 王桂英 （）， 女， 高级农艺师， 本科， 从事蔬菜生产管理和种植技术推广工作 ，  -     ：       .    。 注： 感谢重庆市农业科学院茶叶研究所商靖博士对病菌分离鉴定提供的支持和帮助！ 文献著录格式： 刘彬， 王桂英， 陆鋆赟青浦地区生菜腐烂病原分离鉴定及致病性测定  浙江农业科学， ， （）： -   ： . .     . - . 青浦地区生菜腐烂病原分离鉴定及致病性测定 刘彬，王桂英 * ，陆鋆赟 （上海市青浦区蔬菜技术推广站， 上海青浦 ）  ：对青浦区生菜腐烂病原，通过病原菌分离、 致病性测定、 形态学鉴定和分子鉴定， 明确了为害青 浦生菜腐烂为真菌病害，未发现细菌和其他致病菌复合侵染， 确定该病菌为小菌核菌， 为该病害后期防治方法 的筛选提供了理论依据。    ：生菜腐烂病；分离；鉴定；致病性      ：          ：        ： - （）- - 生菜 （               ）， 又名叶用莴苣， 是 世界范围内广泛种植的绿叶蔬菜之一 。 上海为 我国生菜生产和消费最多的地区之一， 年种 植面积在   左右， 近年来上海青浦地区生 菜种植面积一直维持在   。在种植过程中， 生菜茎基部腐烂情况发生较重，发病后期茎基部分 离。春秋冬三季均有发生，尤以春季发病最重，其 发病症状与软腐病等不易区分。为此由请重庆市农 业科学院茶叶研究所对青浦地区生菜腐烂病害，进 行病原菌分离、致病性测定、形态学鉴定和分子鉴 定，以明确青浦地区生菜腐烂的病原，为病原诊断 和后期防治提供理论依据。 材料与方法  .      于年月在青浦区重固镇上海春昌蔬果 专业合作社设施大棚地采集具有典型腐烂症状的生 菜病株，并收集种植品种种子回实验室育苗作为阴 性对照。  .         参照文献 。 取典型带病株， 无菌刀片切 取病健交界处小块组织， 用      表面消毒    ，灭菌水冲洗次， 分别置于马铃薯葡萄糖 琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中， 每皿 块，置 恒温箱中培养观察。 同时将生菜种子 按相同方法处理后观察培养情况。菌丝萌发后，选 典型菌落转入新皿继续培养、纯化、保存。  .       采用注射法接种分生孢子，用注射器向健康生 菜叶片和生菜茎基部注入含有分生孢子的悬浮液 （浓度为. 个   ）  ， 用无菌纱布 覆盖保湿，接种株，并用无菌水做对照。接种后 在气候箱内保持相对湿度以上，  光照  黑暗 培养。  .           在解剖镜和显微镜下观察病原菌形态并测量大 小。按文献标准进行形态鉴定 。  .           . . 菌丝体的培养与收集 选取典型菌株     - 进行分子检测。将斜面 保存的菌株接种在    培养基上进行活化。将活化 后的菌株接种到液体    培养基，每皿均匀接种个 菌丝块，每个试管接种 个，于 培养  后， 用灭菌接种针挑取菌丝，置于 保存备用。 . . 基因组    的提取 基因组    的提取和纯化采用试剂盒方法。 . .    扩增 用真核生物核糖体    通用引物    和     进行    扩增 。 其序列为    ： -                   - ，    ： -                 l   年第卷第期     - 。 . .    反应条件    反应体系总体积为  ， 反应液组分 为：          .  ，          ，          ，        酶 .  ， 模板      ， 引物    和     （       ） 各 .  ，      .  ， 在    -    扩增仪上扩增。 扩增条件。 预变性    ； 变性    ， 退火    ， 延伸    ， 共 个循环；最后 延伸    。    产物委托上 海生工生物工程有限公司进行纯化和测序 。 结果与分析  .           通过马铃薯葡萄糖琼脂培养基分离培养，仅发 现种菌丝，经转管培养后，发现该真菌  就可 在培养基上产生肉眼可见的菌核。该病菌经显微镜 观察， 菌核相对较小， 似油菜籽状， 大小 .   ，子囊孢子椭圆形， 大小 （ ）   （ ）  。 通过牛肉膏蛋白胨培养基分离， 未 发现有细菌侵染。  .         通过注射法接种分生孢子后，健康生菜茎基部 在第天产生腐烂， 并有白色菌丝附着 （图 ）， 清水对照无任何症状；到第天时，生菜茎基部产 生.   大小的黑色菌核 （图），生菜已基本腐 烂，轻轻一提就可与根部分离。对第天和第天 的接种生菜采用 . 方法进行分离， 得到 种病 菌，培养和镜检结果与. 结果一致，所以该病菌 为青浦地区生菜腐烂的致病菌。 图 致病性测定第天结果 图 致病性测定第天结果  .        对    产物进行测序， 得到   序列， 经         比对， 与小菌核菌                 比对 结果一致，与   . 相似度达到， 小结与讨论 王晓青等 研究表明， 生菜菌核病病原菌以 核盘菌和小菌核菌为主，均属子囊菌亚门核盘菌科 真菌。病菌在发病后期形成菌核，以休眠体形式长 期存活于土壤中。 本文的研究结果与前者基本一 致， 青浦地区生菜菌核病致病菌为小菌核菌                 为主。 通过对病株和种子分离培 养，在种子中未发现该病菌， 结合田间发生症状， 该病为土壤中带菌，不是种子带菌。 青浦地区的生菜腐烂由菌核病菌引起，该病主 要发生时期在月至翌年月间发生较重， 该时 期为油菜菌核病发生重点时期，青浦地区油菜多种 植在沟渠边， 油菜菌核病和生菜菌核病是否有关 系，后期将结合生物学特性和理化分析对该病菌进 行分析，为后期防治研究提供参考。     ： 杨晓， 魏仕伟， 郭斗斗， 等上海生菜产销现状与技术关 键点分析  长江蔬菜， （）： - 方中达植病研究方法  版北京： 中国农业出版 社， 庄文颖中国真菌志  北京： 科学出版社， 段维军， 郭立新基于    技术的植物病原真菌检测技术 研究进展  植物检疫， （）： - 张祥林， 刘彬， 王翀， 等向日葵黑茎病菌分离鉴定及其     分析  新疆农业科学， ， （）： - 王晓青， 金红云， 孙艳艳， 等辣根素水乳剂土壤处 理防治生菜菌核病效果研究   中国植物病理学会 年学术年会论文集， （     ：张瑞麟）