番茄褪绿病毒在湖南省首次发生.pdf

番茄褪绿病毒在湖南省首次发生 王雪忠 1，2张战泓 3郑立敏 2唐 鑫 2史晓斌 2刘 勇 1，2* （ 1 湖南大学研究生院隆平分院，湖南长沙 410125； 2 湖南省植物保护研究所，湖南长沙 410125；  3 湖南省蔬菜研究所，湖南长沙 410125 ） 摘 要：2016年7月在湖南省蔬菜病害调查中发现，4种茄科蔬菜表现出叶脉间褪绿、叶片黄化等症状，疑似被番茄褪绿 病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）感染，同时叶片背面聚集了大量烟粉虱。采用ToCV热激蛋白（heat shock protein 70， HSP70）序列的特异性引物对采集的番茄、茄子、辣椒、马铃薯样品和烟粉虱样品进行RT-PCR检测，均扩增出目标条带， 且扩增序列与北京番茄ToCV分离物（KC887999.1）部分序列相似度为99.0%，确认采集样品被ToCV感染。4种茄科蔬菜 ToCV的感染率达70%100%；发病叶片上烟粉虱的带毒率为66.7%87.5%；鉴定出烟粉虱的生物类型为MED烟粉虱。这 是湖南省首次确认该病毒，需要引起关注和加强防范。 关键词：番茄褪绿病毒；茄科蔬菜；烟粉虱 等6个 科 植 物（Wintermantel & Wisler，2006； Landeo-Ros et al.，2015），其中对番茄造成的产 量损失最为显著。ToCV只能通过韧皮部侵染的方 式侵染植物，由媒介昆虫以半持久的方式传播， 其媒介昆虫包括烟粉虱（Bemisia tabaci） 、温室白 粉虱（Trialeurodes vaporariorum） 、银叶粉虱（ B.  argentifolii）和纹翅粉虱（T. abutilonea），其中以烟 粉虱的传播能力最为高效（Wintermantel & Wisler， 2006） 。目前国内外暂未获得ToCV的抗性番茄品 种（Orfanidou et al.，2016），又因媒介昆虫反复发生， 杂草清理具有难度，导致ToCV防治存在困难。 2016年7月对湖南省蔬菜研究所基地进行病 害调查发现，番茄、茄子、辣椒和马铃薯的叶片出 现褪绿黄化、叶脉仍然保持绿色等疑似ToCV感染 的症状，同时在病叶上发现了大量的烟粉虱。故分 别采集症状明显的番茄、茄子、辣椒和马铃薯叶片 样品，利用ToCV特异性引物进行分子鉴定，并检 测发病植株上烟粉虱携带ToCV的带毒率以及烟粉 虱的生物类型。 1 材料与方法 1.1 样本采集 在湖南省蔬菜研究所基地采集疑似感染ToCV 的番茄、茄子、辣椒和马铃薯植株叶片各20份， 王雪忠，女，硕士研究生，专业方向：植物病毒与昆虫互作，E-mail： 1401163317qq.com  *通讯作者（Corresponding author）：刘勇，研究员，博士生导师，专业方  向：蔬菜病毒病防治，E-mail：haoasliu163.com 收稿日期：2018-05-09；接受日期：2018-07-11 基金项目：国家自然科学基金项目（31571981，31571982， 31672003），湖南省科技计划项目（2016RS2019） 番茄褪绿病毒 （ Tomato chlorosis virus， ToCV）属于长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病 毒属（Crinivirus） ，于1998年在美国佛罗里达州首 次发现（Wisler et al.，1998）。截至目前，ToCV已 在我国台湾、北京、山东、天津、河北和河南等地 发生流行，对各地番茄生产造成了严重影响（Tsai  et al.，2004；Zhao et al.，2013；刘永光 等，2014； 周涛 等，2014；胡京昂 等，2015；孙国珍 等， 2015） 。ToCV侵染的典型症状是植株下部叶片先观 察到叶脉间黄化褪绿。发病初期叶片除叶脉仍保持 绿色外，脉间变黄，叶片变厚；发病中期，整个叶 片由边缘向内开始出现坏死斑；发病后期，整个植 株死亡，果实受到严重影响（赵黎明，2015） 。早 期感染ToCV的番茄产量损失可达到75%，甚至绝 产；中后期感染ToCV仍会对番茄造成10%40% 的产量损失（刘永光 等，2014） 。该病毒的寄主主 要有茄科（Solanaceae）和夹竹桃科（Apocynaceae）  27   新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控  27   研究论文 中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES 2018（8）：27 - 31 以健康番茄、茄子、辣椒和马铃薯叶片作为阴性对 照；以实验室ToCV侵染性克隆接种的感病叶片作 为阳性对照。采集基地内发病番茄、茄子、辣椒和 马铃薯植株上的烟粉虱，每种植株采集约100头烟 粉虱成虫。将样品置于液氮中速冻，-80 保存备用。 1.2 试验试剂 TRIzol、氯仿、无水乙醇、ddH 2 O、RNase-free  H 2 O、限制性核酸内切酶（Ase I 酶）、树脂溶液（10  mgmL -1 ）。 1.3 植物总 RNA的提取 样品总RNA的提取采用北京华越洋生物公司 多酚多糖植物RNA提取试剂盒，步骤依照试剂盒 说明书操作。 1.4 烟粉虱总 RNA的提取 烟粉虱RNA的提取采用TRIzol 法并稍作修 改。研磨棒充分研磨虫体后加入1 mL TRIzol振 荡15 s，室温放置4 min；加入200 L氯仿， 漩涡振荡30 s，室温放置3 min；4 下12 000  rmin -1 离心15 min；移取上清液500 L至新 的RNase free离心管中，加入等体积异丙醇，轻 轻颠倒混匀，-20 放置30 min；4 下12 000  rmin -1 离心10 min；弃上清液，用现配的75% 乙醇洗涤沉淀，8 000 rmin -1 离心3 min；重复 洗涤1次；弃上清液，8 000 rmin -1 离心30 s， 小心吸出上清液；室温晾干3 min，取30 L  RNase-free H 2 O溶解，测定OD 260 /OD 280 值，检 测RNA的含量和纯度，-80 保存备用。试验重  复3次。 1.5 cDNA的合成 以提取的总RNA为模板，反转录反应的体 系步骤参照Vazyme生物公司Hiscript 1st Strand  cDNA Synthesis Kit产品说明书进行：在RNase free 离心管中分别加入1 L RNase-free H 2 O，4 L  Radom hexamers，3 L 总RNA；65 加热5 min， 迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2 min；向上一 步混合液中加入10 L 2RT Mix，2 L Hiscript   Enzyme Mix；混匀后按照25 5 min，50 15  min，85 5 min合成cDNA，-20 保存备用。 1.6 RT-PCR和电泳检测 ToCV的检测采用ToCV特异性引物ToCV-3 （表1）进行PCR扩增。PCR扩增体系为：ddH 2 O  7 L，2Taq Master Mix（Dye Plus）10 L， ToCV-3R 1 L（10 molL -1 ），ToCV-3F 1 L（10  molL -1 ），cDNA模板1 L。PCR程序为：95   5 min；95 30 s，56 30 s，72 1 min，35 个循环；72 延伸10 min，4 保存。PCR产物经  1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在凝胶成像系统上 观察并记录结果，产物纯化回收后送生工生物工程 （上海）股份有限公司测序分析。 表 1 引物信息 引物名称 引物序列（5 -3 ） ToCV-3 F：AAACTGCCTGCATGAAAAGTCTC R：GGTTTGGATTTTGGTACTACATTCAGT WT F：CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT R：CCTTCCCGCAGAAGAAATTTTGTTC 1.7 烟粉虱带毒率的检测 从每种植株上采集的烟粉虱中随机选取8头， 采用ToCV特异性引物ToCV-3（表1）进行ToCV 检测，每种植株3次重复，统计烟粉虱的带毒率。 烟粉虱带毒率 = 携带ToCV的烟粉虱数目/ 检测烟粉 虱数目100% 1.8 烟粉虱生物类型的鉴定 烟粉虱总DNA的提取：取3 L蛋白酶K于 封口膜上，将每只烟粉虱置于其中研磨成匀浆后移 至PCR管中，加入20 L 10 mgmL -1 的树脂溶液 混匀，然后置于37 孵育1 h，96 10 min。 PCR扩增体系为20 L：2Taq Master Mix  10 L，上、下游引物WT（表1）各1 L（10  molL -1 ），模板1 L，ddH 2 O 7 L。PCR程序： 95 预变性5 min；95 15 s，53 45 s，72 1  min，35个循环；72 10 min，PCR产物取5 L 进行琼脂糖凝胶电泳检测。 酶切体系：加入Ase I 0.5 L，3.1buffer 2  L，ddH 2 O 7.5 L，与10 L扩增产物混匀后置 于37 34 h，酶切后取5 L产物进行琼脂糖 凝胶电泳检测。 从每种植株上采集的烟粉虱中随机选取20头 进行检测，试验重复3次。 2 结果与分析 2.1 茄科蔬菜田间感染 ToCV的症状 与健康植株相比，田间番茄、茄子、辣椒、  28   新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控  28   研究论文 中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES 马铃薯病株的叶片表现出底部叶片黄化，叶脉浓 绿而脉间褪绿黄化，叶片变脆且易折。感病严重 的植株整株褪绿黄化、果实不能正常膨大，颜色 偏白；叶片脉间褪绿黄化，变厚、变脆且易折 （图1）。 2.2 茄科蔬菜 ToCV的发生率 对4种茄科蔬菜上疑似感染ToCV的样品进 行RT-PCR检测，扩增出条带大小为449 bp的特 异性条带，与目标条带一致（图2） 。对目标条带 纯化回收测序后在NCBI上进行比对，结果显示与 北京番茄ToCV分离物（KC887999.1）部分序列相 似度达到99.0，表明所扩增到的基因片段属于 ToCV的基因序列，确认此次采集的样品被ToCV 感染。检出率结果显示，番茄样品的ToCV感染率 为100%，茄子、辣椒和马铃薯样品的感染率分别 为80%、85% 和70%（图2）。 2.3 烟粉虱体内 ToCV的带毒率检测 收集病叶上的烟粉虱，并进行ToCV的RT- PCR检测，PCR扩增得到条带大小为446 bp的特 异性条带，与目标片段大小一致（图3） 。从采集 的烟粉虱中，每种植株随机选取8头进行ToCV带 毒率检测（表2） ，番茄上烟粉虱ToCV的平均感染 率最高，为87.5%，其次为茄子和马铃薯，辣椒上 烟粉虱ToCV的平均感染率最低。 图 1 4种茄科作物感染 ToCV的症状 A，感病番茄；B，感病辣椒；C，感病马铃薯；D，感病茄子；E，健康番茄；F，健康辣椒；G，健康马铃薯；H，健康茄子。彩色图版见中 国蔬菜网站：www.cnveg.org。 图 2 4种茄科蔬菜 ToCV PCR检测结果 M，DNA marker；120，样品；A，番茄；B，茄子；C，马铃薯； D，辣椒；CK，阴性对照；P，阳性对照。 2.4 烟粉虱生物类型鉴定 对4种茄科蔬菜上采集的烟粉虱进行生物种群 鉴定，提取单头烟粉虱总DNA并进行PCR扩增， A B C D E F G H 图 3 烟粉虱体内 ToCV PCR检测结果  M，DNA marker；12，番茄上烟粉虱样品；34，茄子上烟 粉虱样品；56，辣椒上烟粉虱样品；79，马铃薯上烟粉虱样品； CK，阴性对照；P，阳性对照。 100 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CK P 5 000 bp 3 000 bp 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920CK P 500 bp 500 bp 500 bp 500 bp A B C D  29   新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控  29   研究论文 中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES 产物经 Ase I消化酶切电泳（图4） ，结果显示该基 地烟粉虱均为MED烟粉虱（Q烟粉虱）。 3 结论与讨论 本试验采集了湖南省蔬菜研究所基地4种茄科 蔬菜植株叶片，利用RT-PCR方法检测疑似发病植 株叶片感染ToCV的情况，经序列分析比对，确认 了ToCV已经侵染湖南省的茄科作物，证实该病毒 已经在湖南省发生。近年来，ToCV对我国以番茄 为主的蔬菜产量和品质造成了重大损失，目前针对 ToCV的研究工作主要在其分布、田间诊断和优化 检测技术、致病机理、病虫互作等方面展开。 2004年Tsai等（2004）在我国台湾首次发现 ToCV，随后Zhao等（2013）报道了ToCV在北京 的发生，刘永光等（2014）发现ToCV在山东暴发， 目前ToCV已在天津（高利利 等，2015）、河北（孙 国珍 等，2015）、河南（胡京昂 等，2015）、山 西、陕西、浙江、内蒙古（郑慧新 等，2016） 、吉 林、辽宁（王翠琳 等，2017） 、广东（汤亚飞 等， 2017）、海南（Tang et al.，2017）、云南（刘微 等， 2018）等地相继被发现。近年来国际贸易的频繁交 流，工厂化苗木调运可能使感染ToCV的植株进入 我国，加之烟粉虱在我国扩散流行，这些原因使得 ToCV在我国自沿海向内陆迅速蔓延。湖南省周边 省市中目前只有广东省已经报道了ToCV的发生， 由于湖南省蔬菜种植种类众多，苗木调运繁杂，这 些原因都使得调查ToCV病毒最初来源的工作巨大 且复杂，因此需要进一步分离纯化和鉴定分离物的 病毒株系，对比确认其株系来源，从而精准地对 ToCV进行防控，同时应通过加强对烟粉虱的检疫 检验，减少人为因素造成烟粉虱的传播。 在我国ToCV主要依靠烟粉虱进行传播。2003 年首次在云南省一品红（Euphorbia pulcherrima） 上发现MED烟粉虱以来（Chu et al.，2006），MED 烟粉虱现已遍布全国。目前的研究显示，与其他烟 粉虱相比，MED烟粉虱具有分布广泛、扩散能力 强、繁殖率高、抗药性强且广的特点。同时，在我 国的大多数农业系统中，MED烟粉虱已经快速取 代MEAM1烟粉虱（Chu et al.，2010；Xi，2010； Xin et al.，2016）。已有研究表明，MED烟粉虱比 MEAM1烟粉虱传播ToCV的能力更强（Shi et al.， 2017） 。因此，应正确识别烟粉虱的生物类型，从 而采取正确措施对烟粉虱进行防治，以达到治虫防 病的目的。本试验中烟粉虱ToCV的带毒率较高， 但由于本试验采集的样本数量较少，后期应扩大烟 粉虱采集数量，加强对烟粉虱携带ToCV的监测。 目前ToCV的防治仍以预防为主，可以通过选 用无病虫害的幼苗、培育ToCV抗性新品种、田间 设置防虫网、悬挂粘虫板、合理换茬，达到早预防、 早控制的效果。目前ToCV的发生和流行情况日趋 严重，本试验首次报道ToCV在湖南省的发生，表 明ToCV有从沿海向内陆扩散的趋势，因此必须提 高警惕防止ToCV的进一步蔓延，同时要加强对烟 粉虱-ToCV-植物互作的研究，为ToCV的防治和 治理奠定理论基础。 参考文献 高利利，孙国珍，王勇，高苇，张春祥，张安胜，竺晓平2015 天津地区番茄褪绿病毒的分子检测和鉴定华北农学报，30 （3）：211-215 胡京昂，万秀娟，李自娟，黄文，李武高，应芳卿2015河南番 茄褪绿病毒的分子鉴定中国蔬菜，（12）：25-28 刘微，史晓斌，唐鑫，张宇，张德咏，周序国，刘勇2018云南 番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定 园 艺学报，45（3）：552-560 刘永光，魏家鹏，乔宁，李美芹，刘晓明，竺晓平2014番茄褪 绿病毒在山东暴发及其防治措施中国蔬菜，（5）：67-69 孙国珍，高利利，陆文利，王勇，张安胜，竺晓平2015河北 省设施番茄褪绿病毒分子检测和鉴定研究北方园艺， （9） ： 95-98 图 4 烟粉虱生物类型鉴定结果 M，DNA marker；120，单头烟粉虱样品。 表 2 4种茄科蔬菜上烟粉虱带毒率统计 宿主植物 平均带毒烟粉虱数目 平均感染率/% 番茄 7.0 87.5 茄子 6.7 83.3 辣椒 5.3 66.7 马铃薯 6.7 83.3 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11121314151617181920 5 000 bp 3 000 bp 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp  30   新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控  30   研究论文 中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES 汤亚飞，何自福，佘小漫，蓝国兵2017侵染广东番茄的番茄褪 绿病毒分子鉴定 植物保护，43（2）：133-137 王翠琳，冯佳，孙晓辉，王少立，赵静，刘金亮，竺晓平2017 北方四省区番茄褪绿病毒的分子鉴定 植物保护，43（2） ： 141-145 赵黎明2015番茄褪绿病毒的分子鉴定、全基因组序列分析及检 测技术的建立硕士论文泰安：山东农业大学 郑慧新，夏吉星，周小毛，张友军2016警惕烟粉虱传播的番茄 褪绿病毒病在我国快速扩散 中国蔬菜，（4）：22-26 周涛，杨普云，赵汝娜，师迎春，原锴，范在丰2014警惕番茄 褪绿病毒在我国的传播和危害植物保护，（5）：196-199 Chu D，Zhang Y J，Brown J K，Cong B，Xu B Y，Wu Q J，Zhu G R  2006The introduction of the exotic Q biotype of Bemisia tabaci  from the Mediterranean region into China on ornamental crops Florida Entomologist，89（2）：168-174 Chu D，Wan F H，Zhang Y J，Brown J K2010Change in the  biotype composition of Bemisia tabaci in Shandong province of China  from 2005 to 2008Environmental Entomology，39（3）：1028- 1036 Landeo-Ros Y M，Navas-Castillo J，Moriones E，Caizares M C 2015Genetic diversity and silencing suppression activity of the p22  protein of Tomato chlorosis virus，isolates from tomato and sweet  pepperVirus Genes，51（2）：283-289 Orfanidou C，Pappi P G，Efthimiou K E，Katis N，Maliogka V I 2016Transmission of Tomato chlorosis virus（ToCV）by Bemisia  tabaci biotype Q and evaluation of four weed species as viral sources  Plant Disease，100（10）：10.1094/PDIS-01-16-0054-RE Shi X，Tang X，Zhang X，Zhang D Y，Li F，Yan F，Zhang Y J， Zhou X G，Liu Y2017Transmission efficiency，preference and  behavior of Bemisia tabaci MEAM1 and MED under the influence  of Tomato chlorosis virusFrontiers in Plant Science，8：2271-  2280 Tang X，Shi X，Zhang D，Li F，Yan F，Zhang Y，Liu Y，Zhou   X2017Detection and epidemic dynamic of ToCV and CCYV with  Bemisia tabaci and weed in Hainan of ChinaVirology Journal， 14：doi：10.1186/s12985-017-0833-2 Tsai W S，Shih S L，Green S K，Hanson P2004First report of  the occurrence of Tomato chlorosis virus and Tomato infectious  chlorosis virus in TaiwanPlant Disease，88（3）：311 Wintermantel W M，Wisler G C2006Vector specificity，host  range，and genetic diversity of Tomato chlorosis virusPlant  Disease，90（6）：814-819 Wisler G C，Li R H，Liu H Y，Lowry D S，Duffus J E1998Tomato  chlorosis virus：a new whitefly-transmitted，phloem-limited， bipartite closterovirus of tomatoPhytopathology，88（5）：402- 409 Xi T，Wan F H，Dong C2010Bemisia tabaci biotype Q dominates  other biotypes across ChinaFlorida Entomologist，93（3） ：363- 368 Xin L，Zhang Y，Wen X，Wu Q，Wang S2016The suitability of  biotypes Q and B of Bemisia tabaci（Gennadius）（ Hemiptera： Aleyrodidae）at different nymphal instars as hosts for Encarsia  formosa Gahan（Hymenoptera：Aphelinidae） Peerj，4（4） ： e1863 Zhao R N，Wang R，Wang N，Fan Z F，Zhou T，Shi Y C，Zhou   T2013First report of Tomato chlorosis virus in ChinaPlant  Disease，97（8）：1123 First Report of the Occurance of Tomato chlorosis virus in Hunan Province WANG Xue-zhong 1，2 ，ZHANG Zhan-hong 3 ，ZHENG Li-min 2 ，TANG Xin 2 ，SHI Xiao-bin 2 ，LIU Yong 1，2* （ 1  Subcollege of Longping，Graduate School of Hunan University，Changsha 410125，Hunan，China； 2  Plant Protection  Institute of Hunan Province，Changsha 410125，Hunan，China； 3Hunan Vegetable Research Institute，Changsha  410125，Hunan，China） Abstract：During the investigation for vegetable diseases of Hunan Province in July 2016，symptoms of  intervein chlorosis and leaf yellowing were discovered on Solanaceae vegetable leaves，including tomato，pepper， eggplant and potato plants. The symptoms were suspected as Tomato chlorosis virus（ToCV）and a large number  of Bemisia tabaci were found on the back of leaves. The infected leaves of tomato，pepper，eggplant and potato  and Bemisia tabaci samples were detected by RT-PCR using gene specific primers of ToCV heat shock protein 70 （HSP70）sequence，and an expected fragment were obtained. The results of sequence analysis revealed that  the fragment shared the highest nucleotide identity at 99.0% with the isolates from Beijing（KC887999.1）. The  infection rate of ToCV of these 4 kinds of Solanaceae vegetables was 70%-100%. Viruliferous rate of Bemisia  tabaci was 66.7%-87.5%. The whitefly biotype was MED. This is the first time that Hunan Province confirms the  existing of ToCV，which needs special attention and stronger prevention. Key words：Tomato chlorosis virus；Solanaceae vegetable crops； Bemisia tabaci Pan H，Chu D，Ge D，Wang S，Wu Q，Xie W，Jiao X，Liu B，Yang  X，Yang N，Su Q，Xu B，Zhang Y2011Further spread of and  domination by Bemisia tabaci（Hemiptera：Aleyrodidae）biotype  Q on field crops in ChinaJournal of Economic Entomology，104  （3）：978-985 Garcacano E，Navascastillo J，Moriones  E，Fernndezmuoz R2010  Resistance to Tomato chlorosis virus in wild tomato species  that impair virus accumulation and disease symptom  expressionPlant Disease，100（6）：582-592  31   新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控  31   研究论文 中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES