葡萄伤流液中内生菌分离鉴定与抗病功能分析.pdf

园艺学报， 2018， 45 (11)： 2106 2120. Acta Horticulturae Sinica   2106                                                 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0125； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2018 07 08； 修回日期 ： 2018 10 30 基金项目 ： 中央高校基本科研业务费项目（ KYZ201736） ；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（ CARS-29-yc-1） ；国家自然科学基金面上项目（ 31672131） ；江苏省自然科学基金青年基金项目（ BK20140708） ；江苏省农业科技自主创新项目 CX（ 18） 2008 * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： jiahaifengnjau.edu.cn， fanggg njau.edu.cn）  葡萄伤流液中内生菌分离鉴定与抗病功能分析  郑  婷，张培安，张克坤，纠松涛，朱旭东，宋长年，贾海锋*，房经贵*（南京农业大学园艺学院，江苏省果树品种改良与种苗繁育工程中心，南京  210095）  摘  要： 为探究葡萄树液中内生菌的种类，对白罗莎里奥葡萄伤流液中的内生菌进行分离纯化，得到 4 株普遍存在的有益菌株，根据形态特征、生理生化特性及 16S rDNA 序列同源性对其进行鉴定，并针对葡萄灰霉病病原菌进行抑菌测试。结果表明， 4 种内生菌分别为粘红酵母菌、隐球菌、水拉恩式菌、变形斑沙雷菌；平板抑菌试验显示，隐球菌、水拉恩式菌、变形斑沙雷菌均对灰霉病菌有一定的拮抗作用。对葡萄果粒的病菌侵染试验表明，隐球菌、水拉恩式菌、变形斑沙雷菌均能使果粒失水速率降低、灰霉病病斑缩小，抗菌物质类黄酮、总酚以及 SOD、 CAT、 POD、 PPO 活性升高，灰霉病抗病相关基因VvHSF 和 VvDR 下调， VvPR17、 VvDW、 VvChi 和 VvWRKY 上调，且上调程度与抗病能力呈正相关，进一步表明了隐球菌、水拉恩式菌、变形斑沙雷菌对灰霉病菌有一定的抑制作用，在葡萄灰霉病防治中具有良好的应用潜力。  关键词： 葡萄；伤流液；内生菌；鉴定；抗病；灰霉病菌  中图分类号： S 663.1        文献标志码： A         文章编号： 0513-353X（ 2018） 11-2106-15 Isolation and Identification of Endophytes from Grape Bleeding Sap and Their Disease Resistance Function Analysis  ZHENG Ting， ZHANG Peian， ZHANG Kekun， JIU Songtao， ZHU Xudong， SONG Changnian，JIA Haifeng*， and FANG Jinggui*（ College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Fruit Crop Variety Improvement and Seedling Propagation Engineering Center of Jiangsu Province， Nanjing 210095， China）  Abstract： In order to explore the roles of grape endophytes played in grey mould resistance， four universal endophyte strains（ Rhodotorula mucilaginosa， Cryptococcus， Rahnella aquatilis and Serratia proteamaculans） were closely related， but far from Rhodotorula mucilaginosa and Cryptococcus） were isolated and purified from grape bleeding sap. Morphological observation， physiological characterization and 16S rDNA sequence analysis suggested Rahnella aquatilis and Serratia proteamaculans were closely related， but far from Rhodotorula mucilaginosa and Cryptococcus. In vitro antibacterial effects of the isolated endophytes were tested via plate co-cultivation and grape berry co-infection of both grey mould and the individual endophyte. The results indicated strong inhibition of grey moulds growth by Cryptococcus， Rahnella aquatilis and Serratia proteamaculans. In addition， berries co-infected with Botrytis cinera and the endophyte showed reduced rate of water loss， increased anti-disease metabolites  郑   婷，张培安，张克坤，纠松涛，朱旭东，宋长年，贾海锋，房经贵 . 葡萄伤流液中内生菌分离鉴定与抗病功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 (11)： 2106 2120.                                                                                 2107 （ flavonoids and total phenols） and the increment activities of SOD， CAT， POD， and PPO， together with the increased expression of disease resistant genes VvPR17， VvDW， VvChi and VvWRKY. These shed lights on the pathways endophytes participating in Botrytis cinera resistance. These results are of practical interest for improving grapevine resistance to grey mould. Keywords： grape； bleeding sap； endophyte； identification； disease resistance； Botrytis cinera 由灰葡萄孢（ Botrytis cinerea）侵染引起的葡萄采后灰霉病常造成很大经济损失（陈宇飞  等，2006； Latorre et al.， 2015） 。传统的农业和化学防治措施对生态环境和人体安全存在一定隐患（石延霞  等， 2014） ，随着生态农业的发展，生物防治成为病害防治的研究热点（周登博  等， 2017；Rahman et al.， 2018） ，开发新型生物农药成为当前发展趋势（ Thandavelu et al.， 2003） 。目前已有数种微生物被证实对葡萄灰霉病菌具有拮抗作用， 如枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis（ Rotolo et al.， 2017） 、绿色木霉 Trichoderma viride（康萍芝  等， 2007） 、 粉红粘帚霉 Gliocladium roseum（孟祥东  等， 2015） 、假丝酵母 Candida guilliermondii（ Zahavi et al.， 2000） 、季也蒙毕赤氏酵母 Pichia guilliermondii（ Saligkarias et al.， 2002） 、罗伦隐球酵母 Ctyptocccus laurentii（ Yu et al.， 2008）等，其抑菌率达20% 80%。传统的生物防治仅仅依赖于外源微生物，这导致外源微生物本身和次级代谢产物的安全性无法保证，因此筛选出植物自身内生菌进行生物防治显得尤为重要（周泠璇和刘娅， 2016） 。  内生菌是生活在植物体内而不会引起植物产生明显病害病症的一类真菌或细菌（ Hartley et al.，2015； Wani et al.， 2015） 。内生菌来源广，种类多，其合成物大多具有抗菌、生物防治等活性（刘慧芹  等， 2014； Nair & Padmavathy， 2014； Azad & Kaminskyj， 2016； Yang et al.， 2016；王春伟  等，2018） 。葡萄上关于内生菌的研究多数是围绕根、茎、叶片、果梗、果肉和果皮等展开的（ Chambers et al.， 2010； Yang et al.， 2016） ，本研究中以葡萄休眠期树液为材料，分离其伤流液中普遍存在的内生菌，通过抑菌测试寻找对灰霉病菌具有拮抗作用的内生菌，为开发葡萄天然生物抑菌剂提供科学依据。  1  材料与方法  1.1  试材与内生菌分离纯化  试材为江苏省句容市陈武镇江苏省农博园（ 119.2E， 32.0S）内 5 年生白罗莎里奥葡萄树液流动期的树液（即伤流液） 。 2017 年 3 月中旬（树液流动期） ，选择健壮枝条，在其顶端剥离韧皮部5 cm 左右， 露出木质部， 用乙醇和无菌水冲洗， 用脱脂棉包裹韧皮部顶端， 使用经高温灭菌的 50 mL开口离心管收集伤流液 15 mL，然后在无菌条件下用不结合蛋白质的 0.22 m 微滤膜过滤。  采用平板分离法，参考李太元和许广波（ 2015）的方法制作 PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）用于培养真菌和牛肉膏蛋白胨培养基用于培养细菌，取 200 L 伤流液均匀涂板，以涂蒸馏水作为对照，置于 28 恒温培养箱中。培养 2 4 d 后挑取平板上的单菌落分别接种于 PDA 培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中继续培养，历时 3 4 代经反复纯化得到较纯的菌株。  1.2  内生菌鉴定  1.2.1  形态学与生理生化鉴定 使用 Leica TL 3000 Ergo 体视显微镜通过 NA 0.73 分辨率观察内生菌的外观形态，使用 Leica Zheng Ting， Zhang Peian， Zhang Kekun， Jiu Songtao， Zhu Xudong， Song Changnian， Jia Haifeng， Fang Jinggui. Isolation and identification of endophytes from grape bleeding sap and its disease resistance function analysis. 2108                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2106 2120. DM4 B 正置显微镜 10 目镜、 40 物镜观察内生菌的细胞形态， 20 物镜通过结晶紫（初染）碘液（酶染）酒精（脱色）蕃红（复染）鉴定内生菌的革兰氏属性，对其形态学特征加以描述。  参考李太元和许广波（ 2015）的方法对内生菌进行碳源（葡萄糖、木糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇、棉子糖、侧金盏花醇）利用测定，并对 pH 值、硝酸盐还原、氨基酸、 H2S 产气等相关生理生化指标进行测定。  1.2.2  分子生物学鉴定 参考丁延芹等（ 2014）报道的总 DNA 提取方法。模板采用挑取菌落制成的菌液，真菌鉴定 28S rDNA，引物为 ITS 1（ TCCGTAGGTGAACCTGCGC）和 ITS 4（ TCCGTAGGTGAACCTGCGC） ；细菌鉴定 16S rDNA， 引物为 27 F（ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG） 和 1492 R（ TACGGCTACCTTGTA CGACTT） 。扩增采用 25 L 反应体系（ 2 L 模板菌液、 12.5 L mix、 1 L Primer 1、 1 L Primer 2、8.5 L ddH2O） ，反应过程： 94 预变性 5 min， 94 变性 30 s， 55 退火 30 s， 72 延伸 90 s， 35个循环后 72  10 min。 PCR 产物采用 AXYGEN AP-GX-50G AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收，与 pMD19-T Vector 载体连接， 转化 Trans 5 的感受态细胞。 按照下列组分配制连接反应液： pMD19-T Vector 0.5 L，回收产物 5 L， Solution I 4.5 L。反应条件： 16 连接过夜。用含 100 mg L-1氨苄霉素的 LB 选择培养基筛选阳性菌落，提取重组子质粒的 DNA，经通用引物 PCR 验证送上海生工测序。测序结果用 NCBI BLAST 软件进行序列分析，搜索相似性最高的序列，并利用 MEGA 7 软件制作系统发育树，鉴定出内生菌。  1.3  内生菌对灰霉病菌抗性鉴定  1.3.1  与灰霉病菌的平板检测 灰霉病菌来自本实验室保存，使用时将斜面菌种转接至 PDA 平板， 28 培养，待产孢子后挑取菌块至无菌水中， 用双层纱布过滤获得分生孢子悬浮液并稀释为 105分生孢子   mL-1的孢子悬浮液。  每组 4 个处理：分别吸取内生菌 100 L 涂于 PDA 培养基平板上，在平板中央接种灰霉病菌菌块 3 mm 3 mm（即内生菌病原菌） ；吸取灰霉病病原菌菌液 100 L 凃板，中央接种内生菌菌液50 L（即病原菌内生菌） ；另外分别凃板内生菌和灰霉病病原菌菌液作为对照。每个处理 3 组重复。观察平板的生长状况，使用 0.1 mm 游标卡尺测定抑菌圈大小。  1.3.2  与灰霉病菌互作的离体验证 培养内生菌的悬浮液以及灰霉病菌的孢子悬浮液，利用血球计数板计算浓度，将孢子含量控制在 108 mL-1左右。  参考申顺善等（ 2016）的方法在果实成熟期取长势良好且大小、成熟度基本一致的阳光玫瑰果粒，分为 5 组，每组 20 个，先用自来水冲洗 30 min，再用 75%乙醇进行表面消毒，用无菌水冲洗 3 次备用。使用灭菌解剖针在果粒表面均匀刺伤 3 个小孔，用注射器分别注射无菌水和 4 种纯化内生菌菌液 100 L，然后再将每个处理分为两组，一组 10 个果粒不处理，一组 10 个果粒待果面水分吸收后均匀喷洒灰霉病菌分生孢子悬浮液，置于 28 恒温箱进行保湿培养。观察果面染菌情况，记录病菌圈大小及颜色，用血球计数板统计孢子数，每日称量果粒质量，计算果粒失水速率： （原果粒质量称量质量） /原果粒质量。切取病斑附近 1 cm 内果肉用液氮速冻，保存于 80 冰箱备用。  参考曹建康等（ 2007）的方法测定果肉样品类黄酮、总酚含量和 SOD、 POD、 CAT、 PPO 等相关酶活性：采用氮蓝四唑（ NBT）法测定超氧化物歧化酶（ SOD）活性，紫外吸收法测定过氧化氢酶（ CAT）活性，愈创木酚法测定过氧化物酶（ POD）活性，邻苯二酚比色法测定多酚氧化酶（ PPO）活性；采用 NaNO2-Al(NO3)3比色法测定类黄酮含量， Folin-Ciocalteu 比色法测定总酚含量。  郑   婷，张培安，张克坤，纠松涛，朱旭东，宋长年，贾海锋，房经贵 . 葡萄伤流液中内生菌分离鉴定与抗病功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 (11)： 2106 2120.                                                                                 2109 利用改良 CTAB 法分别从离体侵染 4 d 后的葡萄果粒中提取总 RNA（初雪鹏  等， 2014） 。取完整性良好的总 RNA 经 RNase-Free DNase处理（ TaKaRa， Japan） ，通过 Smart SpecTMPlus 微量分光光度计（ Bio-Rad， California， USA）获得 OD230 和 OD260 以评估 RNA 样品的质量和浓度。使用 PrimeScriptTMRT 试剂盒（ TaKaRa， Tokyo， Japan） ，按照公司产品说明书操作合成 cDNA。使用Primer 5 软件（ http： /www.premierbiosoft.com/）设计的用于 qRT-PCR 的引物（表 1） ，选定 VvActin作内部对照基因，检测抗病相关基因的相对表达水平。  表 1  本研究所采用的引物序列  Table 1  Sequence of the primers used in this study 基因  Gene 上游引物（ 5 3）  Forward primer 下游引物（ 5 3）  Reverse primer NCBI 登录号  NCBI accession number VvWRKY GGAAAGGAAACCCTCTCCAG TCAGCCTTCCTCTTCCTTGA JF500755 VvRP17 ACACACATTTGGCAGTGGAA CCCATTTCTAAGGCTGTTGC JQ248075 VvHSF CGGCTGTGGACGATCTTATT CTCCTTTGCGGAAGTAGTCG GU393313 VvDW AATCCTGGATGATGGGTTCA GGCTTTCGTGGTTATGGATG LOC100266400 VvDR CGGATTCTCCATTCCAAGAA CAAACCGTGAAACGGAAACT XM_002265958.3 VvChi CCCTCAATGCCCATTCCAAG AGTCCACCGGTTCCATGAAT XM_002266547.4VvActin TGAGCAAGGAAATTACTGCC TCATCGTATTCACCCTTGGA LOC100246825 采用 Microsoft Excel 2016 软件处理数据和制图，利用 SPSS 软件进行方差分析，用邓肯氏新复极差法检验显著性， P  No.3水拉恩式菌  > No.2 隐球菌。  对葡萄果粒先行接种内生菌，再接种灰霉病病原菌，由图 3 可知，内生菌 No.1 菌株与无菌水对照处理后染菌的情况类似，病原孢子及腐烂面积持续扩增，证实 No.1 菌株抑制灰霉病菌的效果不明显；内生菌 No.2、 No.3、 No.4 菌株有不同程度的抑菌能力，病原孢子不产生或者产生较慢，且较对照果肉腐烂的范围较较小。  表 4  内生菌 No.1、 No.2、 No.3 和 No.4 对葡萄灰霉病菌生长抑制作用的抑菌圈大小  Table 4  Inhibition zone of No.1， No.2， No.3 and No.4 endophytes to grape Botrytis cinera                cm 互作关系  Interaction No.1 No.2 No.3 No.4 内生菌病原菌  Endophyte Pathogen 0 （ 0.85 0.03） （ 1.35 0.04）  （ 2.34 0.15）   （ 2.48 0.08） （ 2.86 0.06） （ 3.74 0.05）病原菌内生菌  Pathogen Endophyte 0 （ 4.24 0.12） （ 1.95 0.06）  （ 6.23 0.07）   （ 4.44 0.10） （ 9.12 0.11） （ 8.54 0.11）Zheng Ting， Zhang Peian， Zhang Kekun， Jiu Songtao， Zhu Xudong， Song Changnian， Jia Haifeng， Fang Jinggui. Isolation and identification of endophytes from grape bleeding sap and its disease resistance function analysis. 2112                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2106 2120. 图 2  内生菌 No.1、 No.2、 No.3 和 No.4（ No.）对葡萄灰霉病菌（ Bc）的平板抑菌验证   Fig. 2  Plate bacteriostatic test on grape Botrytis cinera（ Bc） of No.1， No.2， No.3 and No.4（ No.） endophytes 图 3  内生菌 No.1、 No.2、 No.3 和 No.4 对葡萄灰霉病菌的防治效果图  Fig. 3  The control efficiency of No.1， No.2， No.3 and No.4 endophytes against grape Botrytis cinera in vitro 郑   婷，张培安，张克坤，纠松涛，朱旭东，宋长年，贾海锋，房经贵 . 葡萄伤流液中内生菌分离鉴定与抗病功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 (11)： 2106 2120.                                                                                 2113 从病原菌孢子数量（表 5）来看， 3 种内生菌菌株的抑菌效果表现为 No.2 > No.4 > No.3，其中No.2 基本没有病原菌孢子的产生，但腐烂面积较 No.3、 No.4 处理后大，褐变现象明显。对接种病原菌的果粒染菌圈进行统计，无菌水对照的染菌范围最大，可达 0.85 cm，接种 4 d 后 No.4 处理最小，为 0.45 cm。  表 5  病菌接种后染菌圈直径和病原菌孢子数  Table 5  Inhibition zone and pathogen spores number on grape surface 处理  Treatment 直径 /cm Diameter 4 d 时孢子数  Pathogen spores number at 4 d1 d 2 d 3 d 4 d 水 Water（对照 Control）  0.15 0.01 a 0.20 0.03 a 0.67 0.04 a 0.85 0.05 a （ 1.08 0.07） 108 a No.1 0.15 0.01 a 0.20 0.01 a 0.58 0.04 b 0.78 0.03 b （ 8.40 0.53） 107 b No.2 0.10 0.03 b 0.15 0.02 b 0.44 0.04 c 0.65 0.04 c （ 8.00 0.21） 105c No.3 0.15 0.02 a 0.18 0.01 a 0.43 0.03 c 0.53 0.03 d （ 2.10 0.53） 107d No.4 0.15 0.02 a 0.18 0.01 a 0.38 0.03 d 0.45 0.04 e （ 1.60 0.40） 106d 2.5  内生菌处理的葡萄果粒接种灰霉病菌后的生理特征变化  4 种内生菌处理过的葡萄果粒在接种病原菌后失水速率表现为 No.1 > 对照  > No.2 > No.3 > No.4 处理，且各处理的离体失水速率均呈线性变化（图 4） 。其中， No.1 处理的失水速率最快，处理后 4 d 高达 42.3%，其次为清水对照（ 38.5%） ， No.3 与 No.4 处理的失水速率较为接近，处理后4 d 分别为 15.8%和 14.2%。  图 4  内生菌 No.1、 No.2、 No.3 和 No.4 处理葡萄果粒接种灰霉病菌后失水速率  Fig. 4  Rate of water loss of berries treated with No.1， No.2， No.3 and No.4 endophytes respectively after Botrytis cinera inoculation 葡萄果粒类黄酮和总酚含量在灰霉病病原菌侵染后呈上升趋势，且上升的速率和幅度与平板检测的抗病性一致，同样表现为 No.4 > No.3 > No.2 > No.1  对照，接种 4 d 时 No.4 处理总酚含量最高（ 4.41 mg g-1） ，类黄酮含量为 7.20 mg g-1，整体来看， 4 种内生菌处理在接种后 2 4 d 的上升速率明显高于 0 2 d（图 5） 。  Zheng Ting， Zhang Peian， Zhang Kekun， Jiu Songtao， Zhu Xudong， Song Changnian， Jia Haifeng， Fang Jinggui. Isolation and identification of endophytes from grape bleeding sap and its disease resistance function analysis. 2114                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2106 2120. 图 5  内生菌处理的葡萄果粒接种灰霉病菌后类黄酮物质和总酚含量  Fig. 5  Total polyphenolics and flavonoid content of berries treated with No.1， No.2， No.3 and No.4  endophytes respectively after Botrytis cinera inoculation 从图 6 可以看出， 阳光玫瑰葡萄果粒中 4 种防御酶系在接种病原菌后的变化与其抗病性呈现明显的相关性， 4 种酶基本都在接种病原菌后 2 d 开始迅速升高，其中 No.2、 No.3、 No.4 内生菌处理在接种后 1 4 d， 4 种防御酶呈现不断上升的趋势， CAT 和 PPO 在 3 4 d 上升较为缓慢。从上升幅度来看 No.4 > No.3 > No.2 处理，与平板检测的抗病性一致； No.1 菌株处理酶活的变化与清水对照基本一致，其中 SOD、 POD、 PPO 活性在病原菌接种后基本无变化或有小幅上升， CAT 活性在接种后呈下降趋势，且清水对照的下降幅度大于 No.1 处理。  图 6  内生菌（ No.1、 No.2、 No.3 和 No.4）处理葡萄果粒接种灰霉病后 SOD、 POD、 CAT 和 PPO 的活性  Fig. 6  SOD， POD， CAT and PPO activities of berries treated with No.1， No.2， No.3 and No.4 endophytes  respectively after Botrytis cinera inoculation 郑   婷，张培安，张克坤，纠松涛，朱旭东，宋长年，贾海锋，房经贵 . 葡萄伤流液中内生菌分离鉴定与抗病功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 (11)： 2106 2120.                                                                                 2115 2.6  内生菌的葡萄果粒接种灰霉病菌后相关基因表达量变化  选取葡萄抗病相关基因 VvWRKY、 VvPR17、 VvDW、 VvChi、 VvHSF 和 VvDR 进行定量检测，整体来看， No.1 处理中各抗病基因表达量普遍偏低，说明粘红酵母菌未使葡萄表现出抗病能力，与对照相比， No.2、 No.3、 No.4 处理发现葡萄 VvPR17、 VvDW、 VvChi 表达量上调，且上调程度与抗病能力呈正相关； VvWRKY 为类黄酮合成的关键基因，其在对照中表达量极低，在 4 种内生菌作用的条件下表达量急剧上升，其中 No.2 表达量最高， No.3 和 No.4 表达量相近； VvHSF 和 VvDR 为应激反应的响应基因，病菌侵染后表达量呈大幅下降趋势（图 7） 。  图 7  内生菌（ No.1、 No.2、 No.3 和 No.4）处理葡萄果粒接种灰霉病菌后抗病基因的表达  Fig. 7  Disease resistance genes expression of berries treated with No.1， No.2， No.3 and No.4 endophytes respectively after Botrytis cinera inoculation 3  讨论  葡萄内生菌菌群丰富（ Pinto et al.， 2014） ， Martn 等（ 2013）从榆树木质部汁液中分离到内生菌，前人已对内生菌的抗病机制进行了广泛和深入的研究（ Gonzlezteuber， 2016） 。水拉恩式菌和变形斑沙雷菌菌种相近，常见于土壤中，对杨树促生以及杨树溃疡病（宋芳旭  等， 2017） 、灰霉病，小麦全蚀病以及葡萄相关病害（ Habbadi et al.， 2017）有一定的防治作用，另外其具有良好的保水