黄皮转录组SSR挖掘及其可用性分析.pdf

园艺学报， 2018， 45 (1)： 149 158. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0342； http： /www. ahs. ac. cn                                                   149 收稿日期 ： 2017 09 04； 修回日期 ： 2017 12 27 基金项目 ： 国家自然科学基金项目（ 31501729） ；广东省科技计划项目（ 2015A030302041， 2016B020201004） ；广东省优稀水果产业技术体系项目（ 2017LM1071） ；农业部热带作物种质资源保护项目（ 16RZZY-20） ；广东省农业科学院院长基金项目（ 201605）  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： lzxf200126.com； panjianping_2003163.com）  黄皮转录组 SSR 挖掘及其可用性分析  陆育生，陈  喆，常晓晓，邱继水，林志雄*，潘建平*（广东省农业科学院果树研究所，农业部南亚热带果树生物学及遗传资源利用重点实验室，广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广州  510640）  摘  要： 利用 MISA 软件筛选黄皮（ Clausena lansium）转录组测序获得的 68 998 条 Unigene，共检测出单核苷酸至六核苷酸重复类型的 SSR位点 11 825 个， 分布于 11 000 条 Unigene中， 出现频率为 17.14%，平均分布距离为 4.41 kb。 6 种 SSR 位点类型中主要为单、二、三个核苷酸重复，分别占总 SSR 位点的41.48%、 24.92%和 27.53%。 11 825 个 SSR 位点中共发现 207 种重复基序，重复次数在 4 24 次之间，其中出现频率高的基序有 A/T、 AG/CT、 AT/AT、 AAG/CTT 和 AAT/ATT。位点序列长度分布在 12 25 bp之间，其中 12 15 bp 最多，占 50.95%（ 6 025 个 SSR 位点） 。通过 Primer 3 设计得到 6 102 对 SSR 引物，随机选择 30 对引物进行多态性验证分析，结果显示 24 对有效扩增引物中， 13 对引物在 16 份不同黄皮种质中表现出多态性。以上结果表明，黄皮转录组测序产生的 Unigene 信息可作为开发 SSR 标记的有效来源，开发的大批量 SSR 标记可为黄皮种质资源遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择。  关键词： 黄皮；转录组； SSR；可用性分析  中图分类号： S 667.5       文献标志码： A        文章编号： 0513-353X（ 2018） 01-0149-10 Excavation and Usablility Analysis of SSR from Transcriptome of Clausena lansium LU Yusheng， CHEN Zhe， CHANG Xiaoxiao， QIU Jishui， LIN Zhixiong*， and PAN Jianping*（ Institution of Fruit Tree Research， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Resource Utilization， Ministry of Agriculture， Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical and Subtropical Fruit Tree Research， Guangzhou 510640， China）  Abstract： In this study， a total of 68 998 Unigenes from transcriptome of Clausena lansium were used for screening of SSR loci using MISA software. 11 825 SSRs， including the types of 1 6 nucleotide repeats distributed in 11 000 Unigenes were identified， with occurring frequency of 17.14% and mean distance of 4.41 kb. The major types of SSR loci were 1 3 nucleotide repeats， accounting for 93.93% of the SSR loci， of which mono-， di- and tri- nucleotide repeats were 41.48%， 24.92% and 27.53%，respectively. Two hundred and seven repeat motifs with iteration numbers from 4 to 24 were discovered from the 11 825 SSR loci， and the most abundant motif were A/T， AG/CT， AT/AT， AAG/CTT and  Lu Yusheng， Chen Zhe， Chang Xiaoxiao， Qiu Jishui， Lin Zhixiong， Pan Jianping Excavation and usablility analysis of ssr from transcriptome of Clausena lansium. 150                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 149 158. AAT/ATT. The lengths of repeat nucleotide sequences for all SSR loci ranged from 12 to 25 bp， with most from 12 to 15 bp， accounting for 50.95% of all SSR loci. A total of 6 102 SSR primers were designed and 30 primers were selected randomly for PCR amplification tests， of which 24 primers amplified effective and 13 primers showed polymorphism in sixteen different wampee germplasm. The results indicated that the Unigenes generated from trasncriptome sequencing in C. lansium could be used as an effective source to develop SSR markers. The large quantities of SSR markers will provide reliable markers for map structure， genetic polymorphism analysis for wampee germplasm resource. Keywords： Clausena lansium； transcriptome； SSR； usability analysis 中国是黄皮（ Clausena lansium）的原产地，黄皮种质资源丰富。开展黄皮遗传多样性研究，全面梳理和揭示其种质资源的亲缘进化关系，可为其进一步收集保存提供借鉴，并为新种质的创制提供基本数据，提高育种效率，具有重要的理论和现实意义。 DNA 分子标记是鉴定种质资源遗传多样性的重要手段，但目前在黄皮上的运用局限于 RAPD（刘小梅  等， 2007；蒋素梅  等， 2008）和 ISSR（李开拓  等， 2009）等通用的分子标记技术。 SSR（ simple sequence repeat）即简单重复序列，又称微卫星 DNA（ microsatellites） ，是由 1 6 个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列。作为第二代分子标记的代表， SSR 分子标记具有技术简便、稳定性高、共显性、多等位性等特点，且数量丰富，几乎覆盖整个基因组，已被广泛用于遗传多样性研究、品种鉴定、遗传图谱构建及 QTL 定位。传统的 SSR（ genomic-SSR）引物的开发通常需要经过基因组文库构建、探针杂交、克隆、测序等繁琐步骤，不仅耗时耗力，成本高，效率低，而且还存在同位素污染等问题。近年来，随着新一代测序技术的飞速发展，大量增长的转录本数据为 SSR分子标记（ EST-SSR）的开发提供了新的途径。 EST-SSR 标记不仅具有传统 SSR 标记的优点，且开发廉价、高效；更为重要的是其来源于基因组的转录区域，是一种有功能的分子标记，可为基因提供“绝对”的标记（ Keyser et al.， 2009） 。目前，基于转录组序列开发 EST-SSR 标记已在砂梨（ Yue et al.， 2014） 、刺梨（鄢秀芹  等， 2015） 、中国樱桃（宗宇  等， 2016） 、枇杷（郑婷婷  等， 2015） 、杧果（罗纯  等， 2015） 、蓝靛果忍冬（张庆田  等， 2016） 、李（方智振  等， 2016）等多种果树中均有报道。  利用前期黄皮转录组测序（ RNA-Seq）所获得的数据，运用生物信息学方法进行大规模 SSR 标记挖掘，分析其分布规律、组成特征，并对其可用性进行初步评价，以期为利用 SSR 标记进行黄皮种质资源多样性、品种鉴定及亲缘关系研究等奠定基础。  1  材料与方法  1.1  植物材料及 DNA 提取  用于引物筛选和可用性评价的材料为农业部广州黄皮种质资源圃（广东省农业科学院果树研究所）中保存的中国各产区的 16 份黄皮种质，其中 9 份来源于广东， 4 份来源于广西， 2 份来源于海南， 1 份来源于福建（表 1） 。  于 2016 年 4 月每份种质取健康幼嫩叶片，采用天根生化科技有限公司植物基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA， 20 保存备用。  陆育生，陈   喆，常晓晓，邱继水，林志雄，潘建平 . 黄皮转录组 SSR 挖掘及其可用性分析 . 园艺学报， 2018， 45 (1)： 149 158.                                                                                      151 表 1  黄皮材料  Table 1  List of wampee 序号  No. 名称或编号  Name or code 来源  Source 序号No. 名称或编号  Name or code 来源  Source 1 早丰  Zaofeng 广州  Guangzhou 9 金丰  Jinfeng 广州  Guangzhou 2 迟熟甜皮  Chishu Tianpi 广州  Guangzhou 10 琼 2 号  Qiong 2 海口  Haikou 3 金球  Jinqiu 广州  Guangzhou 11 琼变 1 号  Qiongbian 1 海口  Haikou 4 郁南无核  Yunan Wuhe 广东云浮 Yunfu， Guangdong 12 阳山独核  Yangshan Duhe 广东清远  Qingyuan， Gaugndong 5 广西圆皮  Guangxi Yuanpi 南宁  Nanning 13 湛江 1 号  Zhanjiang 1 广东湛江  Zhanjiang， Guangdong 6 广西冰糖  Guangxi Bingtang 南宁  Nanning 14 兴宁 4 号  Xingning 4 广东梅州  Meizhou， Guangdong 7 金鸡心  Jinjixin 广州  Guangzhou 15 闽 2 号  Min 2 福建厦门  Xiamen， Fujian 8 大丰 1 号  Dafeng 1 广州  Guangzhou 16 东兴 1 号  Dongxing 1 广西防城港  Fangchenggang， Guangxi1.2  转录组数据来源  采集黄皮主栽品种金鸡心幼嫩叶片、枝条、花蕾和果实，提取 RNA 并等量混匀后委托华大基因公司进行 RNA-Seq 转录组测序，采用 Trinity 进行 De novo 组装（ Grabherr et al.， 2011）得到68 998 条 Unigene，作为分析背景数据。  1.3  转录组 SSR 位点鉴别及 SSR 引物设计  使用 MISA 软件（ http： /pgrc.ikp-gatersleben.de/misa.html）对 Unigene 序列进行 SSR 位点搜索。搜索标准为：重复单元长度 1 6 bp，单核苷酸重复次数至少 12 次；二核苷酸重复次数至少 6 次；三、四核苷酸重复次数至少 5 次；五、六核苷酸重复次数至少 4 次。  只保留 SSR 重复单元在 Unigene 上前后序列均不小于 150 bp 的 SSR，采用 Primer 3.0 引物批量设计程序进行引物设计及评价，每条 SSR 产生 5 条引物。引物序列长度 12 25 bp，预计 PCR 扩增产物在 80 250 bp， GC 含量 40% 65%，退火温度 55 65 ，上下游引物的退火温度相差不大于3 ，尽量避免出现发卡结构、错配和引物二聚体等。  设计好的引物按以下方式进行筛选： （ 1）去除所有单核苷酸重复位点引物； （ 2）引物不能存在SSR； （ 3）引物的 5端允许有 3 个碱基的错配， 3端允许有 1 个碱基的错配； （ 4）去掉比对到不同Unigene 上的引物，只保留唯一匹配的引物。  从最终获得的引物中随机挑选 30 对二核苷酸至六核苷酸引物交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。  1.4  PCR 扩增  PCR 反应体系为 20 L， 其中包括 2 Dream Taq green PCR master mix（ Thermo scientific） 10 L，10 mol L-1正、反向引物各 0.5 L， 30 mg L-1 DNA 模板 1 L， ddH2O 8 L。 PCR 扩增程序为：94 预变性 4 min， 94 变性 30 s，适宜退火温度（退火温度因不同引物而异，在 55 60 之间）30 s， 72 延伸 30 s， 35 个循环；最后 72 延伸 10 min。  扩增产物利用 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶检测， 160 V 电压， 90 min，银染显色。  Lu Yusheng， Chen Zhe， Chang Xiaoxiao， Qiu Jishui， Lin Zhixiong， Pan Jianping Excavation and usablility analysis of ssr from transcriptome of Clausena lansium. 152                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 149 158. 2  结果与分析  2.1  黄皮转录组中 SSR 位点的数量及分布特点  利用 MISA 软件对通过转录组测序获得的 68 998 条黄皮 Unigene（序列总长度 52 226 735 bp）进行分析查找，发现含有符合条件的 SSR 的 Unigene 有 11 100 条，发生频率（含有 SSR 的 Unigene数 /总 Unigene 数）为 16.09%。其中， 10 434 条 Unigene 含有单个 SSR 位点，占含有 SSR 序列总条数的 94%， 含有两个及以上 SSR 位点的 Unigene 序列有 667 条， 占 6%。 共找到 SSR 位点 11 825 个，分布频率（检出的 SSR 位点数 /总 Unigene 数）为 17.14%，其中平均 4.41 kb 就具有一个 SSR 位点（表 2） 。  黄皮转录组 SSR 类型丰富，单核苷酸至六核苷酸重复类型均存在，但不同类型 SSR 的比例差异较大，主要集中在单核、二核和三核苷酸重复上，占总 SSR 位点数的 93.93%。单核苷酸重复类型的数量最多，为 4 905 个，占总 SSR 位点数的 41.48%；其次是三核苷酸和二核苷酸重复类型，分别为 3 277 个和 2 974 个，占总 SSR 位点数的 27.53%和 24.75%；四、五、六核苷酸重复类型的数量很少，总共仅占总 SSR 位点数的 6.07%。  不同类型 SSR 位点在 Unigene 中的出现频率与其比例一致，单核苷酸重复类型分布频率最高，达 7.11%；其次为三核苷酸和二核苷酸重复类型，六核苷酸重复类型最低。不同 SSR 位点类型在Unigene 中的平均距离则与其分布频率相反，最大的为六核苷酸重复类型，平均为 227.07 kb，最小的为单核苷酸重复类型，为 10.65 kb。  黄皮转录组中 SSR 位点的序列总长度为 193 180 bp， 位点平均长度 16.34 bp。 不同重复类型 SSR位点的平均长度各不相同，单核苷酸重复平均长度为 15.68 bp，二、三、四、五和六核苷酸类型 SSR位点的平均长度分别为 15.42、 16.95、 20.78、 20.49 以及 24.00 bp。  表 2  黄皮转录组中 SSR 的基本分布情况  Table 2  Distribution of SSR loci in the transcriptome of wampee SSR 类型  SSR type 数量  Number 比例 % Percentage 出现频率 % Distribution frequency 平均距离 /kb Average distance 平均长度 /bp Average length 单核苷  Mono-nucleotide  4 905 41.48 7.11 10.65 15.68 二核苷酸  Di-nucleotide  2 974 24.92 4.27 17.72 15.42 三核苷酸  Tri-nucleotide 3 255 27.53 4.72 16.05 16.95 四核苷酸  Tetra-nucleotide  232 1.96 0.34 225.12 20.78 五核苷酸  Penta-nucleotide 256 2.16 0.37 204.01 20.49 六核苷酸  Hexa-nucleotide 230 1.95 0.33 227.07 24.00 总计 Total 11 825 100.00 17.14 4.41  如图 1 所示，在黄皮转录组 SSR 位点中，以 5 次重复次数最多，达 1 984 个位点，占总 SSR 位点的 16.78%；其次为 6， 7 和 12 次重复，位点个数分别为 1 906， 1 127 和 1 010。统计 4 12 次重复的 SSR 位点共有 7 915 个，占总 SSR 位点的 66.93%， 13 24 次重复的 SSR 位点共有 3 910 个，占 33.07%。  陆育生，陈   喆，常晓晓，邱继水，林志雄，潘建平 . 黄皮转录组 SSR 挖掘及其可用性分析 . 园艺学报， 2018， 45 (1)： 149 158.                                                                                      153 图 1  黄皮转录组中 SSR 重复次数分布图  Fig. 1  Distribution of SSR repeats frequency in wampee transcriptome 2.2  黄皮转录组中 SSR 基序重复类型和频率特征  从黄皮转录组 SSR 核苷酸基序类型 （表 3） 来看， 11 825 个 SSR 位点共观察到 207 种重复基序，其中单、二、三、四、五和六核苷酸重复各有 2、 4、 10、 26、 53 和 112 种。从 SSR 重复频率来看，单核苷酸重复主要分布在 12 24 次，二核苷酸重复主要分布在 6 12 次，三核苷酸重复主要分布  表 3  黄皮转录组 SSR 基序类型分布  Table 3  The distribution of types of SSR in wampee transcriptome SSR 类型  SSR type 基序类型数  Number of motif type 基序类型  Motif type 出现次数  Number 占总 SSR 重复基序比例 /% The ratio of total SSR repeat motif 单核苷酸  Mononucleotide 2 A/T 4 826 40.81 C/G 79 0.67 二核苷酸  Dinucleotide 4 AG/CT 1 727 14.60 AT/AT 747 6.32 AC/GT 464 3.92 CG/CG 9 0.08 三核苷酸  Trinucleotide 10 AAG/CTT 810 6.85 AAT/ATT 558 4.72 ATC/ATG 479 4.05 AGC/CTG 416 3.52 ACC/GGT 265 2.24 AAC/GTT 256 2.16 AGG/CCT 227 1.92 CCG/CGG 111 0.94 ACG/CGT 95 0.80 ACT/AGT 38 0.32 四核苷酸  Tetranucleotide 26 AAAG/CTTT 59 0.50 ACTG/AGTC 27 0.23 AAAC/GTTT 24 0.20 AAAT/ATTT 24 0.20 其他 Other 98 0.83 五核苷酸  Pentanucleotide 53 AAAAT/ATTTT 38 0.32 AAAAG/CTTTT 27 0.23 AAAAC/GTTTT 24 0.20 AACTC/AGTTG 12 0.10 其他 Other 155 1.31 六核苷酸  Hexanucleotide 112 ACCATC/ATGGTG 7 0.06 AAAATC/ATTTTG 6 0.05 AAGGAG/CCTTCT 6 0.05 AGCCTG/AGGCTC 6 0.05 其他 Other 205 1.73 Lu Yusheng， Chen Zhe， Chang Xiaoxiao， Qiu Jishui， Lin Zhixiong， Pan Jianping Excavation and usablility analysis of ssr from transcriptome of Clausena lansium. 154                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 149 158. 在 5 8 次，四核苷酸重复主要分布在 5 6 次，五核苷酸重复主要分布在 4 5 次，六核苷酸重复次数集中在 4 次。  从不同 SSR 基序出现频率来看（表 3） ，出现最多的基序是 A/T（ 4 826 个，占总 SSR 位点的40.81%） ，其次是 AG/CT 和 AAG/CTT，分别为 1 727 个和 810 个，占 14.60%和 6.85%。单核苷酸重复基序主要为 A/T 和 C/G。二核苷酸重复基序中以 AG/CT 所占的比例最高，其次为 AT/AT 和AC/GT， CG/CG 所占的比例最小。三核苷酸重复基序中以 AAG/CTT、 AAT/ATT、 ATC/ATG 和AGC/CTG 最多，共计占 SSR 总数的 19.14%。四核苷酸重复基序中以 AAAG/CTTT、 ACTG/AGTC、AAAC/GTTT和 AAAT/ATTT为主， 共计占 SSR总数的 1.13%。 五核苷酸重复基序中以 AAAAT/ATTTT和 AAAAG/CTTTT 所占的比例最多，其次为 AAAAC/GTTTT 和 AACTC/AGTTG。六核苷酸重复基序类型最多，但数量最少，出现频率最低。  2.3  黄皮转录组 SSR 可用性评价  SSR标记多态性的高低是判断其可用性的重要依据， 而 SSR的长度是影响其多态性的主要因素。已有的研究结果表明，当 SSR 的长度   20 bp 时出现多态性的比例较高，长度在 12 19 bp 的 SSR多态性中等，而当长度在 12 bp 以下时多态性极低（ Temnykh et al.， 2001） 。因此，本研究中在查找SSR 时将长度小于 12 bp 的去除。  如表 4 所示，去除后黄皮转录组 SSR 位点的长度在 12 25 bp，其中长度在 12 15 bp 的 SSR位点最多，达 6 025 个，占 SSR 总位点数的 50.95%；其次是 16 19 bp 的 SSR 位点，为 3 144 个（ 26.59%） ；长度   20 bp 的 SSR 位点达到 2 656 个，其中 20 23 bp 和  > 23 bp 的分别为 2 298 和358 个，可以预测这部分多态性潜能高的 SSR 在黄皮上应具有较高的应用价值。  表 4  黄皮转录组 SSR 位点重复序列的长度分布  Table 4  Distribution of the length of repeat sequences of SSR loci in the transcriptome of wampee 长度 /bp  Length SSR 位点数   Number of SSR loci 分布比例 /%  Distribution percentage 12 15 6 025 50.95 16 19 3 144 26.59 20 23 2 298 19.43 > 23 358 3.03 2.4  黄皮转录组 SSR 引物设计与筛选  为进一步在试验中利用筛选出的黄皮 SSR， 采用 Primer 3 对上下游序列均不小于 150 bp 的 SSR位点设计引物，每个位点产生 5 对引物，去除不符合条件的引物，最终筛选获得 SSR 位点特异引物6 102 对，占总 SSR 位点的 10.77%。  随机挑选合成了 30 对引物，包括二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基序的 SSR 位点。以金鸡心黄皮材料的基因组 DNA 为模板对这批引物进行 PCR 扩增和筛选，结果表明， 30 对引物中的 24 对能够扩增出与预期产物大小相符的特异性条带（表 5） ，有效扩增率为 80%。  陆育生，陈   喆，常晓晓，邱继水，林志雄，潘建平 . 黄皮转录组 SSR 挖掘及其可用性分析 . 园艺学报， 2018， 45 (1)： 149 158.                                                                                      155 表 5  30 对黄皮 SSR 引物信息及扩增结果  Table 5  Information and amplification results of 30 pairs of primers developed from wampee transcriptome 引物编号  Primer No. 引物序列（ 5 3)）  Primer sequence 重复单元  Repeat motif 预期产物 /bp Expected size扩增带数Number of bands 多态性带数  Number of polymorphic bands 多态率 /% Percentage of  polymorphism P1 F： GTCCAGCTCTTCTTTCAGCAG；  R： TAAAGCTATGAGTCCCCATTTCA （ AAG）6158 0 0 0 P2 F： GCTGTTCAAATGTCATTCGTCTT；  R： GCCTGGAATGCCTTATTTTGTAT （ TA）8133 5 2 40.00 P3 F： CCAAACCAAACCAAACAAATAAG；R： TTTGTCAAGCTACAGATACACGC （ TA）6109 0 0 0 P4 F： GAGCTAGGGTTTGTTTTTGTTCA；  R： ATCTTCGTGTCGTTGTTGTTCTT （ CGA）7131 2 0 0 P5 F： CAGCTTCAACAACAGCTCTGTAA；R： GGTAGGTTTAAAGAAACGATCCC （ AC）9128 6 3 50.00 P6 F： CTTGTTGATTAATTGCCACTCGT；  R： TGAAGATGATGAGCCTAAGAAGG （ TCT）5127 8 6 75.00 P7 F： TTAATTTGTGGGATCAATTTTGC；  R： TCTCTCTTTCTCCCCTTTCTCTC （ GA）7127 5 1 20.00 P8 F： TCATCATCCTCTACTTGGCTCTC；  R： GGTTGATGATCATGGATGGTG （ TCA）6107 5 2 40.00 P9 F： CATAACTTTCTGCATCATCGTCA；  R： GAAGAAGAAGGAGGAGTTTGAGC（ TCA）5101 2 0 0 P10 F： AGCAAAGACAAAGAAAACAGGTG；R： TAGACACAACAAGCAAAGCAAAG （ GAACA）4136 0 0 0 P11 F： TGTAATGGTGAGAGATGGGTTTT；R： GTCTTCCTTTTTACTCGACCCAC （ ATTTTT）4159 6 3 50.00 P12 F： AACAAACTCAGAACCCACTCCTT；R： GCTTTGTCATCAGGGTTTTTAGA （ AAT）6150 5 3 60.00 P13 F： GGTTTGTTTGAGGATTCTGTTGT；  R： GGTTGTTTTCTGGTATTGCTTCA （ GGT）5129 2 0 0 P14 F： CTGCTGCAATGAGTTGATCTTTA；  R： CAACAATCAAGAAAAGGCTCAAG （ TGA）5114 2 0 0 P15 F： ATTTCAGAGTGGAGTTGTTTCCA；R： ACGAAGCATTAAAGCAGCATAAG （ TTTTA）4126 2 0 0 P16 F： AAGGATGGTAGTGACACTGAGGA；R： CCTTCTTCACCAGAACCATCTTC （ GAT）5107 5 2 40.00 P17 F： AAAGAAGATCGAGATCCTTCCAC；R： ACTCGTCTGAGCAATTTGATGAT （ TCA）6118 2 0 0 P18 F： TTTCTTGTTTCATACTCACCAACAC；R： GGAAGTTTGCAAGTTGTTATTGG （ AGC）5147 8 8 100.00 P19 F： TGGAGGTTTCTTTCTTTCTTGTC；  R： CAACAGCTCTCCTCTCAAGTTGT （ GA）8151 4 0 0 P20 F： ACAGACTATTAACGGCAGATCCA；R： AAGAGCATGAAGAAACCTCACAG （ TGA）6132 6 6 100.00 P21 F： GCTTCTTTTCCACAACAAAAGTG；R： TAAAACAAAAGGCGACAAACAAT （ AGA）5122 3 0 0 P22 F： CAATCAAAGAATCATATGCACCA；R： TTGGACAATAGGAAAAGTCTCCA （ GCC）5129 4 0 0 P23 F： CGAAAATCCCTCACCGTTACTAT；  R： CCATTGAGAAGAGAATGAGGAGA （ ATC）5118 4 3 75.00 P24 F： AGCGAAGAGGAAGAACAAAAAGT；R： CATTATCAGCCTCCACAATATCC （ AGA）5121 4 4 100.00 P25 F： GAATCACCAAACGAAATAGCAAC；R： TGGCTTTCAGGACTCAGAAATAC （ CAG）5125 6 5 83.33 P26 F： CGTTGCGTTGAGTATCCTAGTCT；  R： ATGTCTCTGTGCGCTTCTGAT （ AAAG）5102 0 0 0 P27 F： GGTAAGACAGGAGGTGAGGACTT；R： TCTTGGCTCTTCATTTCATCAAC （ TAGT）5156 3 0 0 P28 F： GTCGGCAACACTTTCACTACTTT；  R： AGACTTTGATTTTCTCCCCTCTG （ CTT）6125 0 0 0 P29 F： AAAGGCTGCGTACAAAGAAGATA；R： AGAATTTTTCACAGCATTTTTGC （ AG）6158 0 0 0 P30 F： CCTCCTCCTCTTCCTCTTGTTTA；  R： CTTGGTTTCCATGAAATGAAAGA （ TA）6152 3 0 0 Lu Yusheng， Chen Zhe， Chang Xiaoxiao， Qiu Jishui， Lin Zhixiong， Pan Jianping Excavation and usablility analysis of ssr from transcriptome of Clausena lansium. 156                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 149 158. 2.5  SSR 多态性分析  利用上述 24 对验证的 SSR 引物对 16 份不同的黄皮种质进行多态性评价，结果（表 5）表明，13 对引物呈现多态性，占有效引物的 54.17%。 13 对引物共扩增得到 73 条条带，其中多态性片段48 条，平均每对引物产生 3.69 个多态性片段，每对引物产生的多态性片段数量 1