不同菌剂处理对葡萄叶片细菌多样性的影响.pdf

北方园艺（）：研究简报第一作者简介：郭继平（），女，博士，副教授，研究方向为植物病理。：责任作者：马光（），男，博士，副教授，研究方向为植物生物技术。：基金项目：河北省青年拔尖人才支持计划资助项目（）；河北省高等学校青年拔尖人才研究计划资助项目（）。收稿日期：不同菌剂处理对葡萄叶片细菌多样性的影响郭继平，马光，王志杰，齐善厚，王宝梅（衡水学院生命科学系，河北衡水；宝鸡市农业科学院，陕西宝鸡）摘要：以喷施砖红微杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌剂后的葡萄叶片为试材，采用方法研究葡萄叶片表面细菌多样性，以期阐明种菌剂对葡萄叶片细菌多样性的影响。结果表明：经过扩增出大小约为的细菌可变区。经电泳共标记出条带，其对应葡萄叶片上的种已知细菌包括芽孢杆菌属（）、微球菌属（）、假单胞菌属（）、链霉菌属（）等和种非可培养细菌。其中砖红微杆菌菌剂的细菌种类更为丰富，其中条特有条带所代表的细菌类群包括微杆菌属（）、马杜拉放线菌属（）、黄假单胞菌（）和简单芽孢杆菌（）。聚类分析表明，菌剂处理后与对照及菌剂处理的叶片在细菌多样性方面有明显差别，而菌剂的处理与对照没有差别。系统发育分析表明，葡萄叶片喷施菌剂后，其表面细菌仍维持一定的多样性。砖红微杆菌菌剂可显著提高葡萄叶片的细菌多样性，而解淀粉芽孢杆菌对葡萄叶片细菌多样性无显著性影响。关键词：葡萄叶片；菌剂；细菌多样性；中图分类号：文献标识码：文章编号：（）葡萄（）是世界上普遍种植的重要水果和酿酒原料之一。随着葡萄无公害生产技术的推进，生物拮抗菌剂在葡萄病害防治中的应用越来越广泛。生物菌剂的使用会影响葡萄叶片的微生物生态体系，改变葡萄叶片上的微生物多样性。植物叶片微生物多样性是衡量其群落结构稳定性的重要指标。对葡萄叶片和果实微生物群落多样性的研究已有相关报道。等通过技术研究了法国地区不同葡萄园中“美乐”葡萄上的附生细菌，发现其优势菌群为假单胞杆菌属（）和鞘脂单胞菌属（）。张世伟等采用高通量测序技术对不同品种酿酒葡萄表皮的微生物群落进行了分析，结果显示，细菌主要分布在变形菌门（）、放线菌门（）、厚壁菌门（）等个门，优势细菌主要是欧文氏菌属（）、假单胞菌属（）、芽孢杆菌属（）等个属。目前，利用变性梯度凝胶电泳（）技术进行微生物多样性研究越来越多。以技术结合的技术高效快速，并且可重复性高，可在短时间获取图谱，并直观的反映出样品中各组分的丰富度。该研究采用技术，对葡萄叶片喷施砖红微杆菌（）和解淀粉芽孢杆菌（）菌剂，研究不同菌剂对葡萄叶片表面细菌多样性的影响，以期为生防菌剂防治葡萄病害提供生产指导，并为生物防治机理的研究提供数据支撑。材料与方法试验材料供试砖红微杆菌和解淀粉芽孢杆菌由衡水学院生命科学系微生物学实验室前期研究筛选并保存，种细菌对葡萄霜霉病菌和白腐病菌均具有拮抗作用。试验方法菌剂制备砖红微杆菌菌剂：将活化好的砖红微杆菌接入液体培养基中，、振荡培养，当发酵液中的活芽孢含量为亿时，加入吐温、山梨醇。解淀粉芽孢杆菌菌剂：将活化好的解淀粉芽孢杆菌接入液体培养基中，、振荡培养，当发酵液中的活芽孢含量为亿时，加入吐温、山梨醇。葡萄植株的菌剂喷施和取样选择年生葡萄树株，将上述种菌剂分别稀释倍，在：以后向葡萄叶片正反面和果实均匀喷洒，次重复。对照组不喷洒稀释菌液，保证其它条件与试验组一致。从月日起，每间隔喷洒次，共喷洒次，月日取样进行测定。每组处理分别随机采摘个葡萄叶片，次重复。基因组的提取和纯化将叶片的反正面均用无菌水冲洗次，收集冲洗后的水溶液，离心，弃上清收集菌体，再按试剂盒说明提取总，并采用天根的凝胶回收试剂盒基因组进行纯化。细菌区的扩增以样品基因组为模板，采用细菌通用引物和扩增样品高变区序列。引物：；引物：。扩增体系（）：；（）；酶（）；（）；（）；模板；补至。扩增程序为预变性；变性，复性，延伸，个循环；最终延伸。产物采用公司纯化回收。产物的变性梯度凝胶电泳（）分析制备浓度为，即变性梯度范围为的聚丙烯酰胺凝胶，取产物进行变形梯度凝胶电泳（）分析，在缓冲液中、下电泳。采用银染法染色，使用紫外凝胶系统拍照，并用软件分析结果。图谱中优势条带的回收与测序根据图谱中样品条带数目及每个条带的强度（灰度），采用软件对每样品的电泳条带数目、条带密度进行数字化分析，确定测序条带。采用公司回收目的条带。以回收产物为模板，为引物进行扩增。扩增体系（）：；（）；酶（）；（）；（）；模板；补至。扩增程序：预变性；变性，复性，延伸，个循环；最后，延伸。将重新扩增的片段切胶回收、纯化后，连接到载体上，并转化至感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行序列测定。数据分析测得的序列在数据库进行相似性比较。将测序结果和代表性菌株的部分序列用程序进行序列比对测序，依据戴斯相似系数并采用软件构建进化树，分析亲缘关系及相似性，对各样品中细菌多样性等指标进行分析。第期北方园艺结果与分析细菌可变区的扩增采用细菌通用引物和扩增出的目的片段大小均约为（图）。条带经过琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收后满足电泳的条件。注：；对照。：；图细菌可变区的扩增细菌的图谱分析由图可知，图谱均可以分离出清晰的电泳条带，说明葡萄叶片上的细菌多样性较高。个处理和对照的条带的相对强度和迁移率不完全相同，说明三者中既存在共有细菌种群，又存在特有细菌。在图谱分析软件给出的条条带（图）中，与对照相比，喷施砖红微杆菌菌剂特有的电泳条带有条，说明喷施该菌剂后改变了叶片局部的微生态环境，使细菌菌群的种类更加丰富。与对照相比，喷施解淀粉芽孢杆菌菌剂后的电泳条带与对照无显著差异，说明喷施菌剂后叶片的细菌种群无明显变化，也进一步反映对葡萄叶片的微环境的影响较小。图对照和处理组细菌的图谱测序结果分析对图中标注的条条带进行了克隆和测序。由表可知，种条带所代表的细菌与表葡萄叶片细菌条带测序结果测序条带编号比对结果序列登录号相似度微杆菌属马杜拉放线菌属黄假单胞菌简单芽孢杆菌产氧光合细菌食烷菌灰色链霉菌枯草芽孢杆菌地衣芽孢杆菌葡萄假单胞菌非可培养细菌藤黄微球菌短杆菌属非可培养细菌解淀粉芽孢杆菌固氮菌属微球菌属北方园艺月（下）公布的序列的最大相似度均在以上。包括种已经被培养鉴定的细菌和种尚未被鉴定的非可培养细菌。与对照和喷施解淀粉芽孢杆菌菌剂的葡萄叶片相比，喷施砖红微杆菌菌剂的葡萄叶片的细菌种类更为丰富，其中特有的条带所代表的微生物类群为微杆菌属（）、马杜拉放线菌属（）、黄假单胞菌（）和简单芽孢杆菌（）。聚类分析从图可以看出，对照和处理的重复样品一共分为类，第一类为菌剂处理的次重复样品，第二类为和菌剂处理的次重复样品。处理单独在一个枝上，说明其与对照及菌剂处理的叶片表面在细菌多样性上具有明显差别。而喷施菌剂处理与对照聚在一个枝上，说明二者在叶片表面细菌多样性上没有差别，这也与中图谱的结果相对应。图处理和对照的聚类分析系统发育分析由图可以看出，所测序列分为个大枝。条带和藤黄微球菌（：）聚为一个大枝。另一个大枝分为组：条带、和聚为一组；条带、和聚为一组；条带和为一组；条带、和为一组。从系统发育树可看出，聚在一枝的序列均是相近种属，该发育树的多个分支代表不同的细菌，体现出一定的多样性。可见葡萄叶片喷施菌剂后其表面的细菌仍维持一定的多样性。注：数字代表表中的测序条带编号。：图葡萄叶片上细菌的系统发育分析讨论从目前研究看，对葡萄果实上的细菌类群的研究更多一些。葡萄叶片和果实上的附生细菌种类既存在相似性，但又有各自独特的类群。如张世伟等通过研究不同品种酿酒葡萄表皮的微生物群落发现，优势细菌主要是欧文氏菌属（）、假单胞菌属（）、芽孢杆菌属（）、丙酸杆菌属（）、和小双孢菌属（）等个属。等发现“霞多丽”葡萄上的优势菌属为假单胞菌属（）。等发现“美乐”葡萄上的优势菌属为假单胞菌属（）和鞘脂单胞菌属（）。该研究中葡萄叶片表面上的细菌也是以假单胞菌属（）和芽孢杆菌属（）为主，说明葡萄植株中的不同部位如叶片和果实处于相同的生态环境中，细菌类群具有一定的相似性，但叶片和果实的营养和微环境又具有各自的特点，所以又存在一定的特异性。第期北方园艺世纪年代以来，研究者一直采用分离培养的方法来研究微生物多样性，而事实上一些微生物经常处于“活的非可培养状态”。尽管研究人员利用看家基因（特别是基因）了解混合细菌群落的特征，许多新的微生物种系型被发现。但在实际研究中，只有通过分离得到纯培养物种，才能够对该物种的生理生化综合特征和潜在致病性进行充分的评价。通过实验室人工培养方法已经分离和描述的微生物物种数量仅占估计数量的，而其余的微生物类群仍然未被分离和认识。因此，对于非可培养细菌的培养一直是研究的重点和难点。通过现代分子生物技术，可以绕过纯培养的手段来研究微生物的多样性，使其进入了一个崭新的研究阶段。变性梯度凝胶电泳（）技术在微生物群落多样性和种群动态监测中得到广泛应用。该研究采用技术发现条带和条带均为非可培养细菌，需进一步进行研究鉴定。等应用技术研究了不同种植园中葡萄内生细菌多样性，特征条带测序结果显示，图谱中显示的优势细菌多数为不可培养细菌，说明非可培养细菌在葡萄植株上大量存在。参考文献，，，，（）：，，，，，，（）：张世伟，陈曦，钟其顶不同品种酿酒葡萄表皮微生物群落多样性分析生物技术通报，（）：刘蓓一，丁成龙，乔伟艳，等利用技术研究稻草与黑麦草混合青贮过程中菌群的动态变化江苏农业科学，（）：冉淦侨，张红艳，任平技术监测自然发酵葛根中微生物菌群动态变化生物技术通报，（）：刘沛应用技术研究低分子量聚乙烯粉末对土壤细菌遗传多样性的影响成都：四川师范大学，马俊孝，季明杰，孔健技术在微生物物种多样性研究中的局限性及其解决措施食品科学，（）：，：：：，，，？，：，，：张秀敏，滕忠才，任凯“非可培养的”细菌研究进展安徽农业科学，（）：，，：，（）：刘慧杰，杨彩云，田蕴基于技术的红树林区微生物群落结构微生物学报，（）：，，，，（）：，，，，（，，；，）：（）（），，，北方园艺月（下）北方园艺（）：设施园艺第一作者简介：冯争光（），男，硕士，副研究员，研究方向为果树设施栽培。：基金项目：河北省科技支撑计划资助项目（）。收稿日期：不同落叶时期和落叶方式对设施桃无需冷栽培萌芽率的影响冯争光，胡青，杨金库，王桂英，刘晓杰（廊坊市农林科学院，河北廊坊；沧州市园林绿化局，河北沧州）摘要：以年生“中农金辉”油桃为试材，在设施无需冷栽培方式下，采用不同落叶时期和落叶方式对油桃进行处理，分析了不同处理方式对油桃萌芽率的影响。结果表明：在设施桃无需冷栽培中，不同落叶时期对萌芽率的影响差别很大，从月开始，萌芽率逐渐升高，在月中下旬时萌芽率达到最高，之后萌芽率开始下降，到月下旬时萌芽率降低为；不同落叶方式同样对萌芽率的影响很大，其中避光闷棚落叶的萌芽率最高，与人工摘叶和尿素脱叶相比差异极显著。由此筛选出了设施桃无需冷栽培方式下最适宜的落叶时期为月中下旬，最适宜的落叶方式为避光闷棚落叶。关键词：落叶时期；落叶方式；设施桃；无需冷栽培；萌芽率中图分类号：文献标识码：文章编号：（）我国设施桃栽培起步较晚，世纪年代逐渐兴起，栽培区域主要集中在黄河以北，其中以山东、辽宁、河北省栽培面积最大，约占全国设施桃栽培总面积的。据年统计数据，目前我国设施桃栽培总面积约万，年产值约亿元。对设施桃栽培而言，一般上市时间越早收益越高，而一直以来，在设施桃栽培中只有满足了不同品种的需冷量之后才能升温促生产，这是目前制约设施桃成熟期无法大幅提前的根本因素，致使设施桃的成熟期一直处于月。且随着设施桃栽培规模的逐年扩大，果品集中上市的现象越来越严重，栽培效益亦越来越低。等把木本植物的休眠进程分成个阶段：“预休眠相”“内休眠相”和“环境休眠相”。等研究表明在浅内休眠期，芽的休眠状态可通过人工摘叶或化学药剂处理等打破。高东升等以年生“曙光”油桃为试材，研，，，，，：；；；