牛心甘蓝蜡粉缺失突变体410M特征的研究.pdf

南 京 农 业 大 学 学 报 ，(): :/. :./. 收 稿 日 期: 基 金 项 目: 国 家 重 点 研 发 计 划 项 目() 作 者 简 介: 石 利 朝， 硕 士 研 究 生。 通 信 作 者: 严 继 勇， 研 究 员， 主 要 从 事 甘 蓝 类 蔬 菜 遗 传 育 种 与 种 质 创 新 研 究，-:.。 石 利 朝， 曾 爱 松， 李 家 仪， 等. 牛 心 甘 蓝 蜡 粉 缺 失 突 变 体 特 征 的 研 究. 南 京 农 业 大 学 学 报，():. 牛 心 甘 蓝 蜡 粉 缺 失 突 变 体 特 征 的 研 究 石 利 朝 ， ， 曾 爱 松 ， 李 家 仪 ， 王 金 香 ， ， 宋 立 晓 ， 严 继 勇 (. 南 京 农 业 大 学 园 艺 学 院， 江 苏 南 京；. 江 苏 省 农 业 科 学 院 蔬 菜 研 究 所/ 江 苏 省 高 效 园 艺 作 物 遗 传 改 良 重 点 实 验 室， 江 苏 南 京；. 中 国 农 业 大 学 生 物 学 院， 北 京) 摘 要: 目 的 本 文 旨 在 探 索 牛 心 甘 蓝 蜡 粉 缺 失 突 变 体 的 特 征 和 实 际 应 用 价 值， 以 丰 富 甘 蓝 种 质 资 源， 加 速 新 品 种 创 制 和 改 良。 方 法 调 查 牛 心 甘 蓝 野 生 型 材 料 和 蜡 粉 缺 失 突 变 体 的 农 艺 性 状， 测 定 其 营 养 品 质； 扫 描 电 镜 观 察 其 叶 表 超 微 结 构； 以 蜡 粉 缺 失 突 变 体 材 料( ) 与 其 野 生 型( ) 为 亲 本 分 别 配 制 世 代 群 体， 分 析 蜡 粉 缺 失 性 状 的 遗 传 规 律； 筛 选 出 个 在 拟 南 芥 中 参 与 蜡 粉 合 成、 转 运 的 基 因， 并 利 用 实 时 荧 光 定 量 对 其 在 和 中 的 表 达 模 式 进 行 分 析。 结 果 蜡 粉 缺 失 甘 蓝 叶 色 亮 绿， 突 变 体 球 叶 和 外 叶 的 维 生 素 含 量 显 著 高 于 野 生 型； 其 他 表 型 及 主 要 营 养 成 分 与 野 生 型 无 明 显 差 异。 叶 表 超 微 结 构 观 察 显 示， 突 变 体 叶 表 面 光 滑， 蜡 粉 严 重 缺 失； 野 生 型 叶 表 蜡 粉 分 布 致 密， 晶 体 结 构 主 要 为 片 状 和 线 状。 对 世 代 群 体 分 离 比 例 进 行 检 测， 结 果 表 明 蜡 粉 缺 失 性 状 为 隐 性 单 基 因 遗 传。 在 参 与 拟 南 芥 蜡 粉 生 物 合 成、 转 运 的 个 基 因 中， 共 有 个 基 因 在 野 生 型 中 的 表 达 显 著 高 于 突 变 体。 结 论 蜡 粉 缺 失 突 变 体 遗 传 稳 定， 商 品 性 好， 为 育 种 和 蜡 粉 分 子 基 础 研 究 的 优 良 材 料。 关 键 词: 甘 蓝； 蜡 粉 缺 失 突 变 体； 农 艺 性 状； 超 微 结 构； 遗 传 规 律； 蜡 粉 基 因 中 图 分 类 号:. 文 献 标 志 码: 文 章 编 号:() - ， ， ， ， ， ， ， (.，；.， /， ，；.，) : ，-. ，- ().，-， ， ， ，-()().， -. ，- .， ，. ， .， ，-.， -.- ，-. ， - .，- ，. ，- . :； 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 结 球 甘 蓝(.) 简 称 甘 蓝， 是 十 字 花 科 芸 薹 属 甘 蓝 种 中 的 一 个 变 种。 其 叶 色 绿 至 深 绿， 外 叶 及 外 层 球 叶 表 面 均 有 一 层 蜡 粉 覆 盖。 蜡 粉 的 主 要 作 用 是 减 少 非 气 孔 的 水 分 散 失， 降 低 水 分 消 耗 ， 保 护 植 物 抵 御 过 量 紫 外 线 辐 射、 低 温 冻 伤 等 逆 境 ， 还 可 有 效 抵 御 细 菌 和 真 菌 病 原 体 的 入 侵， 防 止 食 草 昆 虫 的 侵 害 等 。 同 时， 甘 蓝 植 株 表 面 的 蜡 粉 多 少 还 是 决 定 商 品 品 质 的 一 个 重 要 指 标。 蜡 粉 少 的 甘 蓝 叶 色 亮 绿， 感 官 好， 品 质 优 良， 受 到 消 费 者 欢 迎。 亮 叶 甘 蓝 由 普 通 甘 蓝 突 变 而 来， 体 表 无 或 有 少 量 蜡 粉 覆 盖， 叶 色 亮 绿， 品 质 优 良， 对 于 丰 富 甘 蓝 种 质 资 源、 培 育 优 质 甘 蓝 新 品 种 具 有 重 要 的 意 义 。 关 于 无 蜡 粉 缺 失 突 变 体 甘 蓝 的 相 关 研 究， 在 国 内、 外 仅 有 少 量 报 道 ， 而 且 发 现 的 均 是 圆 球 和 扁 球 型 突 变 体。 在 我 国 长 江 流 域 及 以 南 地 区， 牛 心( 尖 球) 类 型 甘 蓝 一 直 是 大 家 喜 欢 种 植 和 消 费 的 品 种 类 型。 牛 心 甘 蓝 普 遍 存 在 蜡 粉 较 多、 球 色 不 够 绿 的 问 题。 为 了 提 高 特 色 新 品 种 的 竞 争 优 势， 牛 心 甘 蓝 叶 色 的 改 良 成 为 育 种 工 作 者 的 一 个 重 要 课 题。 年， 在 优 良 牛 心 型 纯 合 材 料 的 群 体 中， 发 现 了 其 蜡 粉 缺 失 突 变 体 。 前 人 的 研 究 结 果 表 明， 芸 薹 属 植 物 突 变 体 缺 失 蜡 粉 性 状 遗 传 规 律 较 为 复 杂， 不 同 突 变 体 之 间 差 异 较 大， 且 由 不 同 的 基 因 控 制。 因 此， 本 文 对 首 次 发 现 的 牛 心 类 型 甘 蓝 突 变 体 的 特 征、 主 要 营 养 物 质 含 量、 蜡 粉 结 构、 遗 传 规 律 进 行 研 究， 并 且 对 拟 南 芥 中 参 与 蜡 粉 合 成、 转 运 的 基 因 在 和 中 进 行 了 表 达 水 平 分 析， 以 期 明 确 该 甘 蓝 蜡 粉 缺 失 突 变 体 的 特 征 特 性 及 其 在 育 种 中 的 实 际 应 用 价 值， 为 丰 富 甘 蓝 种 质 资 源、 新 品 种 创 制 和 改 良 提 供 理 论 依 据。 材 料 与 方 法 . 材 料 供 试 甘 蓝 野 生 型 材 料 及 其 蜡 粉 缺 失 突 变 体 由 江 苏 省 农 业 科 学 院 蔬 菜 研 究 所 叶 菜 类 蔬 菜 研 究 室 提 供。 供 试 材 料 分 别 于 年 月 和 年 月 中 旬 播 种， 月 中 旬 定 植 于 江 苏 省 农 业 科 学 院 六 合 实 验 基 地， 至 月 进 行 田 间 取 样 和 田 间 性 状 调 查； 月 上 旬 每 份 材 料 各 选 取 株 移 栽 于 大 棚， 翌 年 至 月 进 行 授 粉 留 种。 . 农 艺 性 状 观 察 于 叶 球 成 熟 期 对 熟 性、 叶 色、 株 高、 开 展 度、 外 叶 数、 球 形、 单 球 质 量、 球 径、 中 心 柱 等 农 艺 性 状 按 常 规 方 法 进 行 调 查。 . 营 养 品 质 测 定 于 叶 球 成 熟 期， 分 别 选 取 大 小 相 近、 成 熟 度 一 致、 无 病 害、 无 创 伤 的 球 叶 和 外 叶， 对 其 主 要 营 养 成 分 维 生 素、 粗 纤 维、 总 糖、 干 物 质 含 量 按 常 规 方 法 进 行 测 定。 每 重 复 取 株 叶 球 及 相 应 外 叶， 次 重 复。 . 蜡 粉 的 扫 描 电 镜 观 察 于 叶 球 成 熟 期， 取 各 材 料 的 外 叶， 避 开 叶 脉 用 直 径 打 孔 器 进 行 取 样， 然 后 将 样 品 置 于 烘 箱 中 干 燥。 烘 干 后， 用 银 胶 固 定 在 样 品 台 上， 喷 金， 置 于 扫 描 电 子 显 微 镜 下 观 察。 . 的 提 取 及 实 时 荧 光 定 量(-) 测 定 于 叶 球 成 熟 期， 取 各 材 料 的 外 叶， 采 用 试 剂 盒( 北 京 百 泰 克 生 物 技 术 有 限 公 司) 分 别 提 取 野 生 型 和 突 变 体 材 料 总， 提 取 方 法 参 照 试 剂 盒 说 明 书。 按 照- 要 求 将 反 转 录 成， 根 据 中 国 农 业 科 学 院 网 站(:/-./.) 公 布 的 甘 蓝 基 因 序 列， 利 用 拟 南 芥 各 个 基 因 序 列 进 行 比 对， 选 择 同 源 性 较 高 的 保 守 序 列， 使 用. 软 件 设 计- 引 物 ( 表)， 以 甘 蓝 的 基 因 作 为 内 参 基 因。 所 用 染 料 为()， 配 制 的 体 系: ()、 正 向 引 物( ).、 反 向 引 物( ).、 模 板() ， 加 至。 采 用 两 步 法 荧 光 定 量 进 行 扩 增。 扩 增 程 序: ， 循 环 次； ， 循 环 次， 单 点 检 测 信 号。 熔 解 程 序:， 连 续 检 测 信 号。 每 个 样 品 重 复 次。 采 用 法 对 数 据 进 行 相 对 定 量 分 析。 . 数 据 处 理 所 得 数 据 采 用. 软 件 进 行 差 异 显 著 性 分 析， 在. 水 平 上 进 行 邓 肯 氏 多 重 比 较。 第 期 石 利 朝， 等: 牛 心 甘 蓝 蜡 粉 缺 失 突 变 体 特 征 的 研 究 表 用 于 实 时 荧 光 定 量 的 引 物 - 基 因 甘 蓝 基 因 组 序 列 编 号 . 拟 南 芥 中 蛋 白 家 族 名 称 引 物 对 序 列() 反 式 烯 脂 酰 还 原 酶 -，- / 酰 基 硫 酯 酶 - / 酮 酰 还 原 酶 - / 酰 基 转 移 酶 / 长 链 酰 基 合 成 酶 - / 酮 酰 合 成 酶 - / 酰 基 结 合 蛋 白 - / 囊 泡 转 运 / 转 运 器 / 锚 定 脂 质 转 移 蛋 白 - / 类 转 录 因 子 - / - 类 基 因 - / / / 结 果 与 分 析 . 突 变 体 与 野 生 型 的 特 征 特 性 由 图 可 见: 突 变 体 与 野 生 型 表 型 相 比， 除 了 蜡 粉 缺 失 性 状 外， 其 他 表 型 均 无 明 显 差 异。 图 野 生 型 和 突 变 体 表 型 . . 幼 苗 期；. 结 球 期；. 生 殖 生 长 期 花 序。 .；.；. 对 个 材 料 整 个 生 育 期 的 特 征 特 性 进 行 观 察 发 现， 从 苗 期、 营 养 生 长 结 球 期 至 生 殖 生 长 期， 其 蜡 粉 缺 失 性 状 均 保 持 稳 定； 而 且， 突 变 体 连 续 自 交 代 后， 未 出 现 蜡 粉 性 状 分 离 现 象， 说 明 其 蜡 粉 缺 失 性 状 为 纯 合 性 状。 对 个 材 料 营 养 生 长 结 球 成 熟 期 的 农 艺 性 状 调 查 结 果 显 示， 突 变 体 与 野 生 型 成 熟 期 ( 定 植 到 叶 球 成 熟 的 时 间) 均 为 左 右， 株 高、 开 展 度、 外 叶 数、 球 形、 单 球 质 量、 球 径、 中 心 柱 长 等 农 艺 性 状 指 标 均 无 显 著 差 异( 表)。 球 叶 和 外 叶 的 维 生 素 含 量 分 别 为. 和. ， 而 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 球 叶 和 外 叶 的 维 生 素 含 量 分 别 为. 和. ， 维 生 素 含 量 较 有 显 著 提 高。 而 在 粗 蛋 白、 粗 纤 维、 总 糖、 干 物 质 成 分 含 量 方 面， 二 者 无 明 显 差 异( 表)。 表 和 农 艺 性 状 调 查 材 料 株 高/ 开 展 度/ 外 叶 数 . 球 形 叶 色 单 球 质 量/ 叶 球 纵 径/ 叶 球 横 径/ 中 心 柱 长/ 中 心 柱 长/ 球 高 / . . . 尖 - 绿 . . . . . . . . 尖 - 亮 绿 - . . . . . 注: 同 列 数 据 后 不 同 小 写 字 母 表 示 差 异 显 著(.)。 下 同。 :. 表 和 主 要 营 养 成 分 含 量 叶 片 材 料 维 生 素 粗 蛋 白 粗 纤 维 总 糖 干 物 质 球 叶 . . . . . . . . . . 外 叶 . . . . . . . . . . . 蜡 粉 性 状 扫 描 电 镜 观 察 扫 描 电 镜 观 察( 图) 表 明， 野 生 型 和 突 变 体 蜡 粉 覆 盖 度 差 异 显 著， 与 牟 香 丽 等 、 唐 俊 等 的 研 究 结 果 一 致。 在 倍 视 野 下， 野 生 型 甘 蓝 叶 片 背 面、 腹 面 均 覆 盖 有 较 多 的 蜡 粉， 且 分 布 致 密； 在 倍 视 野 下， 可 观 察 到 其 蜡 粉 结 构 为 片 状 和 线 状。 而 突 变 体 叶 面 光 滑， 叶 背 面 和 腹 面 均 几 乎 无 蜡 粉 覆 盖， 只 有 零 星 颗 粒 状 结 构。 图 野 生 型 和 突 变 体 叶 片 腹 面 和 背 面 微 观 结 构 观 察 . -. 突 变 体 叶 片 腹 面()；. 野 生 型 叶 片 腹 面()；. 野 生 型 叶 片 腹 面()；. 突 变 体 叶 片 背 面()；. 野 生 型 叶 片 背 面()；. 野 生 型 叶 片 背 面()。 .()；.()；.()；. ()；.()；.(). 第 期 石 利 朝， 等: 牛 心 甘 蓝 蜡 粉 缺 失 突 变 体 特 征 的 研 究 . 蜡 粉 缺 失 性 状 遗 传 规 律 分 析 以 和 为 亲 本 构 建 世 代 群 体， 正 交 与 反 交 群 体 株 单 株 全 部 表 现 为 叶 面 有 蜡 粉； 群 体 有 蜡 粉 的 植 株 株， 蜡 粉 缺 失 的 植 株 株， 分 离 比 例 为.， 经 测 验 符 合( . . .) 的 分 离 比 例； 以 有 蜡 粉 的 为 回 交 亲 本 获 得 的 回 交 群 体 中， 株 单 株 全 部 表 现 为 叶 面 有 蜡 粉； 而 与 蜡 粉 缺 失 亲 本 回 交 获 得 的 回 交 群 体 中， 有 蜡 粉 的 植 株 株， 蜡 粉 缺 失 的 植 株 株， 分 离 比 例 为.， 经 测 验 符 合( . . .) 的 分 离 比 例( 表)。 表 明 的 蜡 粉 缺 失 性 状 由 隐 性 单 基 因 控 制。 表 世 代 材 料 性 状 田 间 调 查 及 测 验 - 世 代 总 株 数 . 有 蜡 粉 单 株 数 . 无 蜡 粉 亮 绿 单 株 数 . 有 蜡 粉 无 蜡 粉 亮 绿 . () () () () . . . . . . . 蜡 粉 合 成、 转 运 基 因 的- 分 析 图 和 相 关 蜡 质 合 成、 转 运 基 因 的 表 达 模 式 分 析 . 筛 选 出 个 在 拟 南 芥 中 参 与 蜡 粉 合 成、 转 运 的 基 因， 对 其 在 野 生 型 和 突 变 体 中 的 表 达 进 行 实 时 荧 光 定 量 分 析。 其 中 、 、 和 为 参 与 表 皮 蜡 质 生 物 合 成 的 基 因，、 为 参 与 蜡 质 传 输 的 基 因，、 为 参 与 蜡 质 合 成 和 传 输 的 调 控 基 因。 在 这 个 基 因 中， 中、 的 表 达 高 于 其 野 生 型，、 在 个 材 料 中 表 达 差 异 不 显 著， 其 余 个 基 因 均 为 高 于， 而 且 均 差 异 显 著。 讨 论 扁 球 类 型 和 圆 球 类 型 的 蜡 粉 缺 失 突 变 体 均 有 报 道 ， 牛 心 类 型 的 蜡 粉 缺 失 突 变 体 为 首 次 报 道。 前 人 研 究 表 明， 蜡 粉 缺 失 突 变 体 营 养 生 长 期 生 长 滞 后， 生 长 势 小 于 野 生 型； 而 且， 蜡 粉 缺 失 材 料 结 种 能 力 减 弱， 不 易 结 籽。 但 本 研 究 中 的 牛 心 突 变 体， 在 营 养 生 长 期 与 生 殖 生 长 期， 除 了 蜡 粉 缺 失 性 状 外， 在 生 长 势 和 结 种 能 力 方 面 与 野 生 型 均 无 明 显 差 异， 表 明 蜡 粉 缺 失 对 植 株 生 长 发 育 方 面 产 生 的 影 响 大 小 与 不 同 突 变 体 材 料 有 关。 在 品 质 测 定 中， 突 变 体 球 叶 和 外 叶 的 维 生 素 含 量 高 于 野 生 型。 研 究 表 明 大 部 分 植 物 中 的( 维 生 素) 含 量 与 抗 逆 性 呈 正 相 关， 可 通 过 提 高 含 量 或 促 进 氧 化 态 的 还 原 来 提 高 植 物 的 抗 逆 性 。 植 物 表 面 覆 盖 的 蜡 粉 可 抵 御 外 界 逆 境、 病 虫 害 等 伤 害， 而 蜡 粉 的 缺 失 使 得 植 物 对 外 部 各 种 逆 境 承 受 力 减 弱， 猜 测 植 物 会 应 激 性 调 动 自 身 的 防 御 系 统， 比 如 提 高 含 量 来 增 强 对 逆 境 的 抵 御。 至 于 蜡 粉 缺 失 是 否 与 甘 蓝 含 量 的 变 化 之 间 存 在 某 种 相 关 性， 还 需 进 一 步 深 入 研 究。 国 内 外 关 于 芸 薹 属 蜡 粉 缺 失 性 状 的 研 究 多 有 报 道。 芸 薹 属 作 物 的 蜡 粉 缺 失 性 状 遗 传 规 律 较 为 复 杂， 不 同 突 变 体 之 间 存 在 多 样 性， 且 由 不 同 的 基 因 控 制， 其 中 大 多 数 突 变 体 蜡 粉 缺 失 性 状 受 单 个 基 因 控 制， 其 中 以 单 基 因 隐 性 遗 传 最 为 常 见 ， 显 性 遗 传 和 不 完 全 显 性 遗 传 较 少 ； 少 数 突 变 体 受 双 基 因 控 制 。 在 甘 蓝 蜡 粉 缺 失 突 变 体 中， 初 莲 香 等 在 甘 蓝 品 种 迎 春 中 发 现 了 一 株 蜡 粉 缺 失 突 变 体， 对 其 遗 传 效 应 分 析 表 明， 这 一 蜡 粉 缺 失 性 状 是 由 一 对 隐 性 纯 合 基 因 控 制 。 李 景 涛 对 份 圆 球 蜡 粉 缺 失 突 变 体- 和 的 遗 传 规 律 进 行 分 析， 结 果 表 明 这 份 突 变 体 蜡 粉 缺 失 性 状 均 为 隐 性 单 基 因 遗 传， 但 其 无 蜡 粉 亮 绿 基 因 位 于 不 同 的 遗 传 位 点。 其 后 该 研 究 团 队 又 报 道 了 受 单 基 因 显 性 控 制 的 无 蜡 粉 材 料 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 - 的 发 现 。 本 试 验 中， 突 变 体 配 制 的 世 代 群 体 的 分 离 比 例 符 合 单 基 因 隐 性 遗 传 的 分 离 比 例。 植 物 外 表 皮 蜡 粉 成