不结球白菜醛酮还原酶BcAKR4C9基因的克隆及表达分析.pdf

南 京 农 业 大 学 学 报 2018,41(2):240-247 http:/nauxb.njau.edu.cnJ o u r n a l o f N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y DOI:10.7685/jnau.201705022收 稿 日 期 :2017-05-15 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目(31471886); 国 家973 计 划 子 课 题 项 目(2009CB119001-04); 江 苏 省 农 业 科 技 支 撑 项 目(BE2012325) 作 者 简 介 : 张 飞 雪, 硕 士 研 究 生。 通 信 作 者: 李 英, 教 授, 研 究 方 向 为 蔬 菜 分 子 生 物 学 与 遗 传 育 种,E-mail:yinglinjau.edu.cn。 张 飞 雪, 虞 章 红, 刘 坤 宇, 等. 不 结 球 白 菜 醛 酮 还 原 酶 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 及 表 达 分 析J. 南 京 农 业 大 学 学 报,2018,41(2):240-247. 不 结 球 白 菜 醛 酮 还 原 酶 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 及 表 达 分 析 张 飞 雪, 虞 章 红, 刘 坤 宇, 文 锴, 王 建 军, 侯 喜 林, 李 英 ( 南 京 农 业 大 学 园 艺 学 院/ 作 物 遗 传 与 种 质 创 新 国 家 重 点 实 验 室/ 农 业 部 华 东 地 区 园 艺 作 物 生 物 学 与 种 质 创 新 重 点 实 验 室, 江 苏 南 京210095) 摘 要 : 目 的 本 文 旨 在 探 究 醛 酮 还 原 酶AKR4C 亚 家 族 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 同 激 素 处 理 及 逆 境 胁 迫 中 的 表 达 模 式, 从 而 分 析 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 结 球 白 菜 作 物 中 的 生 长 代 谢 和 逆 境 胁 迫 中 可 能 发 挥 的 作 用。 方 法 以 不 结 球 白 菜 苏 州 青 为 材 料, 克 隆 了 B c A K R 4 C 9 基 因 的 全 长, 应 用 生 物 信 息 学 分 析 了 其 氨 基 酸 序 列, 并 通 过 实 时 荧 光 定 量PCR 技 术 分 析 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 同 组 织, 高 温、 低 温、NaCl 胁 迫、 伤 害 胁 迫, 以 及 水 杨 酸、 茉 莉 酸 甲 酯 和 脱 落 酸 等 处 理 下 的 基 因 表 达 变 化。 结 果 序 列 分 析 表 明, B c A K R 4 C 9 基 因 包 含1 个 长 度 为948bp 的 开 放 式 阅 读 框(ORF), 编 码315 个 氨 基 酸。 氨 基 酸 序 列 多 重 比 对 和 进 化 树 分 析 表 明, B c A K R 4 C 9 与 其 他 植 物 A K R 4 C 9 基 因 同 源 性 较 高, 具 有 高 度 保 守 性。 荧 光 定 量PCR 分 析 表 明, B c A K R 4 C 9 在 叶 片 中 的 表 达 量 高 于 根 中, 高 温 和 低 温 处 理 下 表 达 上 调, 且 具 有 相 似 的 表 达 模 式。 在020gL -1 NaCl 质 量 浓 度 范 围 内 基 因 相 对 表 达 量 随NaCl 质 量 浓 度 的 升 高 而 升 高, 伤 害 处 理 后 能 够 迅 速 产 生 应 激 响 应, 并 能 够 被 水 杨 酸、 茉 莉 酸 甲 酯 和 脱 落 酸 诱 导 表 达。 结 论 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 能 够 被 不 同 激 素 诱 导 表 达, 并 且 参 与 到 多 种 逆 境 胁 迫 响 应。 关 键 词 : 不 结 球 白 菜; 醛 酮 还 原 酶AKR4C 亚 家 族; 序 列 分 析; 非 生 物 胁 迫 中 图 分 类 号 :S634.3 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :1000-2030 (2018 )02-0240-08 Cloningandexpressionanalysisofaldo-ketoreductasegene B c A K R 4 C 9fromnon-headingChinesecabbage ZHANGFeixue,YUZhanghong,LIUKunyu,WENKai,WANGJianjun,HOUXilin,LIYing (CollegeofHorticulture/StateKeyLaboratoryofCropGeneticsandGermplasmEnhancement/ KeyLaboratoryofBiologyandGermplasmEnhancementofHorticulturalCropsinEastChina, MinistryofAgriculture,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China) Abstract:ObjectivesThepurposeofthisstudywastoexploretheexpressionpatternof B c A K R 4 C 9geneofAKR4Csubfamily underdifferenthormonetreatmentsandstressconditions,soastoanalyzethepossibleroleof B c A K R 4 C 9geneingrowthdevelopment andstressinnon-headingChinesecabbage.MethodsThewholecDNAsequence B c A K R 4 C 9genewasclonedfromnon-heading ChinesecabbageSuzhouqing,anditsaminoacidsequencewasanalyzedbybioinformatics,andreal-timefluorescencequantitative PCRtechnologywasusedtoexploreitsexpressionpatternunderdifferenttissues,differentstressconditions(hightemperature,low temperature,NaCl stress,wound stress)and different hormone treatments(salicylic acid,methyl jasmonate and abscisic acid). ResultsThesequenceanalysisshowedthatthe B c A K R 4 C 9genecontainedanopenreadingframe(ORF)withalengthof948bp, encoding315aminoacids.Theaminoacidsequencemultiplealignmentandmappingphylogenetictreeshowedthat B c A K R 4 C 9gene washighlyhomologoustothe A K R 4 C 9genesfromotherplantsandhighlyconserved.Real-timefluorescencequantitativePCRanaly- sisshowedthattheexpressionof B c A K R 4 C 9geneintheleaveswashigherthanthatintheroots,anditwasup-regulatedathigh temperatureandlowtemperatureandhadsimilarexpressionpatterns.Itsexpressionincreasedwiththeincreaseofsaltconcentration from0to20gL -1 . Theexpressionof B c A K R 4 C 9alsocouldbeinducedbysalicylicacid,methyljasmonateandabscisicacid. ConclusionsThenon-headingChinesecabbage B c A K R 4 C 9genecanbeinducedbydifferenthormonesandisinvolvedinavariety ofstressresponses. Keywords:non-headingChinesecabbage;aldo-ketoreductaseAKR4Csubfamily;sequenceanalysis;abioticstress 第2 期 张 飞 雪, 等: 不 结 球 白 菜 醛 酮 还 原 酶 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 及 表 达 分 析在 植 物 生 长 发 育 的 各 个 阶 段, 植 物 会 不 可 避 免 地 遇 到 一 些 生 物 和 非 生 物 胁 迫 1 。 研 究 表 明: 植 物 在 遭 遇 非 生 物 胁 迫 时, 活 性 氧 与 活 性 乙 醛 水 平 增 加, 导 致 植 物 的 胁 迫 诱 导 损 伤 2 , 为 了 清 除 植 物 体 内 产 生 的 活 性 氧、 活 性 乙 醛 等 有 毒 物 质, 植 物 会 利 用 大 量 具 有 氧 化 还 原 活 性 的 酶 类 使 有 毒 物 质 分 解 为 毒 性 较 小 的 乙 醇 和 碳 水 化 合 物 3 , 而 醛 酮 还 原 酶(AKR) 家 族 通 常 催 化 醛、 酮、 类 固 醇 以 及 其 他 羰 基 化 合 物 的 还 原 3 。 AKR 家 族 在 逆 境 防 御 中 起 重 要 作 用, 能 够 被 多 种 逆 境 胁 迫 诱 导 4-7 ; 在 植 物 中 它 们 起 着 反 应 性 醛 解 毒、 渗 透 压 生 成 和 次 级 代 谢 物 合 成 的 关 键 作 用 8 。 AKR 家 族, 是 以NADP(H) 为 辅 酶 而 催 化 一 系 列 醛 酮 底 物 发 生 氧 化 还 原 反 应, 具 有 经 典 的(/)8 桶 状 折 叠 结 构, 在 进 化 上 高 度 保 守。 其 中,(/)8 桶 状 结 构 羧 基 端 的3 个 环(LooPA、LooPB、LooPC) 的 不 同 组 成 和 大 小 决 定 了 其 底 物 的 特 异 性 9 。 AKR 催 化 活 性 位 点 是 由N 末 端(Asp50、Tyr55、Lys84) 所 构 成 9 , 催 化 四 联 体(Asp50、Tyr55、Lys84、His117) 被 认 为 是 醛 酮 还 原 酶 负 责 底 物 催 化 的 关 键 氨 基 酸 10 ; 另 外, 发 现C 末 端 形 成 的 高 度 保 守 的 氨 基 酸 残 基(Ser271、Arg276) 在 辅 因 子 结 合 中 起 重 要 作 用 9 。 AKR4C 亚 家 族 与 植 物 的 耐 受 性 相 关 3 。 AKR4C 能 够 被 高CO 2 浓 度 和 高 光 照 下 诱 导 表 达, 使 细 胞 内 光 合 速 率 增 强 11 。 在 单 子 叶 植 物 中 首 先 鉴 定 到 的AKR4C1 被 认 为 是 耐 旱 性 相 关 的 蛋 白 并 能 够 被 脱 落 酸 诱 导 表 达 12 。 A K R 4 C 9 为AKR4C 亚 家 族 的 成 员, 在 逆 境 胁 迫 中 能 够 起 到 醛 酮 解 毒 的 作 用 13 , 被 认 为 是 保 护 植 物 免 受 应 激 氧 化 胁 迫 的 重 要 的 候 选 基 因 3 。 在 大 麦 中 过 表 达 拟 南 芥 A K R 4 C 9 基 因 可 以 在 氧 化 胁 迫 和 镉 胁 迫 中 增 强 其 醛 酮 解 毒 反 应, 转 基 因 植 株 呼 吸 速 率 降 低, 叶 绿 素 含 量 增 加 并 且 光 合 速 率 提 高 13 ; 山 梨 醇 浓 度 相 对 于 野 生 型 提 高24 倍, 其 耐 寒 性 和 再 生 能 力 得 到 显 著 提 高 14 。 本 研 究 以 不 结 球 白 菜 品 种 苏 州 青 为 试 验 材 料, 克 隆 了 A K R 4 C 9 同 源 基 因, 并 且 进 行 了 相 关 的 生 物 信 息 学 分 析。 利 用 实 时 荧 光 定 量PCR 技 术 分 别 测 定 了 高 温、 低 温、NaCl、 伤 害 处 理 下 的 基 因 表 达 水 平, 以 及 在 脱 落 酸、 茉 莉 酸 甲 酯 和 水 杨 酸 激 素 处 理 下 基 因 的 表 达 变 化, 旨 在 进 一 步 了 解 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 结 球 白 菜 中 的 功 能。 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 及 处 理 供 试 材 料 为 不 结 球 白 菜( B r a s s i c a c a m p e s t r i sssp. c h i n e n s i sMakino) 品 种 苏 州 青, 由 南 京 农 业 大 学 园 艺 学 院 不 结 球 白 菜 课 题 组 提 供。 将 苏 州 青 种 植 于 南 京 农 业 大 学 人 工 气 候 室, 在 植 株4 叶1 心 期 时, 选 取 生 长 整 齐 一 致 的 幼 苗 作 为 试 验 材 料。 以42 热 激 和4 低 温 处 理 幼 苗,处 理 设 备 为RXZ 智 能 型 人 工 气 候 培 养 箱, 光 照 强 度 为100molm -2 s -1 , 处 理 后0、4、6、8 和24h 取 样,每 处 理10 株,3 次 重 复。 在 每 片 叶 上 打3 个 孔 ( 保 留 圆 片 不 致 脱 离, 孔 径 大 小 为1cm) 作 为 伤 害 处 理, 未 打 孔 的 作 为 对 照, 分 别 在0、4、8、12 和24h 后 取 样, 每 处 理10 株,3 次 重 复。 分 别 以5、10、15、20、25gL -1 的NaCl 溶 液 喷 洒 叶 片 背 面, 以 清 水 为 对 照, 然 后 用 透 光 塑 料 罩 罩 住, 处 理12h 后 取 样, 每 处 理10 株,3 次 重 复。 选 用2mmolL -1 水 杨 酸(SA)、50molL -1 茉 莉 酸 甲 酯(JA) 和50molL -1 脱 落 酸(ABA) 溶 液 分 别 喷 施4 叶1 心 期 的 叶 片, 然 后 用 透 光 塑 料 罩 罩 住, 处 理 时 间 为 0、4、8、12 和24h, 每 处 理10 株,3 次 重 复。 材 料 收 集 后 液 氮 速 冻, 存 放-80 保 存 备 用。 1.2 RNA 的 提 取 与cDNA 的 合 成 RNA 提 取 试 剂 盒 购 自 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司, 具 体 方 法 参 照RpPureNApre 植 物 总RNA 提 取 试 剂 盒 说 明 书。 用 苏 州 青 叶 片 的 总RNA 为 模 板, 按 照PrimeScriptRT 试 剂 盒(TaKaRa) 说 明 书 反 转 录 合 成cDNA。 1.3 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 根 据 大 白 菜 数 据 库(http:/brassicadb.org/brad/searchGene.php) 的 基 因 序 列 编 号Bra000018, 利 用 PrimerPremier6.0 软 件 设 计1 对 引 物, 引 物 分 别 为AKR4C9-F:ATGGCTAACGCAATTAGAT,AKR4C9-R: TTATATCTCGCCATCCCATAAGT。 以 不 结 球 白 菜 苏 州 青 叶 片cDNA 作 为 模 板 进 行PCR 反 应, 反 应 体 系 按 照TaKaRa 公 司 的 r T a q 酶 说 明 书 进 行。 反 应 程 序 为:955min;9530s,5830s,721min, 35 个 循 环;7210min,4 保 存。 PCR 产 物 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测, 用DNA 凝 胶 回 收 试 剂 盒 对 目 的 片 段 进 行 回 收、 纯 化。 回 收 产 物 用T 4 -DNA 连 接 酶 连 接 到pMD18-T-simple 载 体, 连 接 产 物 转 化 大 肠 杆 菌 DH5( 由 本 实 验 室 保 存), 涂 于 氨 苄 青 霉 素 抗 性 的LB 平 板37 暗 培 养12h, 挑 取 阳 性 单 克 隆 送 到 南 京 金 斯 瑞 生 物 科 技 有 限 公 司 测 序 分 析。 1 4 2 南 京 农 业 大 学 学 报 第41 卷 1.4 序 列 分 析 用BioEdit 软 件 查 找 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 序 列 的 开 放 阅 读 框(ORF)。 不 同 物 种AKRC49 的 氨 基 酸 序 列 从NCBI(http:/www.ncbi.nih.gov/)GenBank 数 据 库 中 搜 索 获 得, 同 源 性 计 算 利 用NCBI 网 站 BLAST 程 序。 氨 基 酸 编 码 的 蛋 白 质 相 对 分 子 质 量、 理 论 等 电 点、 不 稳 定 指 数 等 通 过 在 线 软 件Protparam tool(http:/web.Expasy.org/protparam/) 完 成。 疏 水 性 预 测 采 用 ProtScale(http:/web.expasy.org/ protscale/), 信 号 肽 预 测 采 用Signalp4.0(http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 跨 膜 区 域 预 测 采 用 TMHMM2.0(http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/), 蛋 白 质 二 级 结 构 预 测 采 用SOPMA(http:/ pbil.ibcp.fr/) 等 在 线 工 具。 蛋 白 质 三 级 结 构 分 析 通 过SWISS-MODEL(https:/www.swissmodel.expasy. org/) 完 成。 多 重 序 列 比 对 通 过DNAMAN6.0 进 行, 进 化 树 构 建 用MEGA5.2 软 件 15 进 行。 1.5 实 时 荧 光 定 量PCR 实 时 荧 光 定 量PCR 体 系 参 照SYBRPrimeScriptRT-PCRKit 试 剂 盒(TaKaRa,Japan) 说 明 书。 内 参 基 因 为 A c t i n( 登 录 号:AF111812), 内 参 引 物 序 列 为 A c t i n-F:GTTGCTATCCAGGCTGTTCT, A c t i n-R:AGCGT- GAGGAAGAGCATAAC; A K R4 C 9 引 物 序 列 为qAKR4C9-F:GCCGCAGCTGTTAAGATCGGAT;qAKR4C9-R: GGTCATGATCCGTACACCAG。 PCR 程 序 采 用 两 步 法:95 30s;95 5s,60 30s,40 个 循 环; 设 置 65 到95 的 熔 解 曲 线。 目 标 基 因 表 达 量 的 计 算 按 照 C T 法。 相 对 表 达 量 等 于2 - C T , 即 相 对 定 量 是 基 于 对 照 和 处 理 之 间, 目 标 基 因 和 内 参 基 因 表 达 量 的 比 值。 所 得 数 据 用Excel2010 软 件 分 析。 图1 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 的 核 苷 酸 序 列 及 其 编 码 的 氨 基 酸 序 列 Fig1 Nucleotidesequenceanditsencodedaminoacidsequenceof B c A K R 4 C 9gene fromnon-headingChinesecabbage方 框 内 为 催 化 四 联 体(Asp47、Tyr52、Lys81、His114) 位 点。 Theboxisacatalyticresidue(Asp47,Tyr52, Lys81,andHis114)locus. 2 结 果 与 分 析 2.1 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 和 序 列 分 析 测 序 结 果 表 明: 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 与 拟 南 芥 序 列 长 度 一 致, 序 列 相 似 度 为88.7%, 包 含1 个 长 度 为948bp 的 开 放 式 阅 读 框(ORF), 编 码315 个 氨 基 酸, 包 含AKR 家 族 共 有 的 催 化 四 联 体(Asp47、 Tyr52、Lys81、His114)( 图1)。 预 测 该 基 因 编 码 蛋 白 质 相 对 分 子 质 量 为35.12610 3 , 理 论 等 电 点 为6.61, 不 稳 定 指 数 为39.81, 属 于 不 稳 定 蛋 白。 ProtScale 亲/ 疏 水 性 预 测 显 示: 该 蛋 白 属 于 疏 水 性 蛋 白( 图2), 总 平 2 4 2 第2 期 张 飞 雪, 等: 不 结 球 白 菜 醛 酮 还 原 酶 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 及 表 达 分 析 均 疏 水 指 数(GRAVY) 为-0.440。 该 蛋 白 无 信 号 肽, 也 无 分 泌 蛋 白, 并 且 不 存 在 跨 膜 区 域。 蛋 白 二 级 结 构 预 测 结 果 显 示: 其 主 要 为 螺 旋, 无 规 则 卷 曲, 分 别 占39.37% 和31.11%, 其 余 为 转 角 和 延 伸 链。 以 拟 南 芥AKR4C9 的 结 构 为 模 型, 利 用SWISS-MODEL 进 行 同 源 建 模, 预 测 了 其 三 维 空 间 结 构。 由 图3 可 以 看 出:AKR4C9 在 不 结 球 白 菜 与 拟 南 芥 中 具 有 相 似 的 三 维 空 间 结 构, 都 拥 有 醛 酮 还 原 酶 所 具 备 的8 个(/) 8 桶 状 折 叠 结 构, 螺 旋 在 外 围, 折 叠 在 里 面, 中 间 形 成 一 个 疏 水 结 构。 其 晶 体 结 构 揭 示 了 底 物 结 合 位 点 的 开 放 性 和 适 应 性 与 广 泛 的 底 物 特 征 相 关 3 。 图2 不 结 球 白 菜BcAKR4C9 氨 基 酸 序 列 亲/ 疏 水 性 预 测 Fig2 PredictedhydrophilicandhydrophobicpropertiesofBcAKR4C9aminoacidsequences fromnon-headingChinesecabbage 图3 不 结 球 白 菜 与 拟 南 芥AKR4C9 蛋 白 的 三 维 结 构 模 型 比 较 Fig3 TertiarystructurepredictionofAKR4C9fromnon-headingChinesecabbageand A r a b i d o p s i s t h a l i a n aLooPA、LooPB、LooPC 分 别 为(/)8 桶 状 结 构 羧 基 端 的3 个 环。 下 同。 LooPA,LooPB,LooPCrepresentthethreeringsof thecarboxylterminalofthe(/)8barrelstructure,respectively.Thesameasfollows. 2.2 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 编 码 的 氨 基 酸 序 列 同 源 性 和 系 统 进 化 分 析 利 用BLASTp 对 B c A K R 4C 9 基 因 推 导 的 氨 基 酸 序 列 进 行 同 源 性 检 索 与 多 重 比 对, 结 果( 图4) 显 示, 其 与 萝 卜(XP 018465613.1)、 欧 洲 油 菜(CDY64988.1) 和 大 白 菜(XP 009133204.1) 相 似 性 达95% 以 上, 与 拟 南 芥 (3H7U)、 亚 麻 芥(XP 010509278.1) 相 似 性 分 别 为90% 和89%; 与 中 棉(XP 012458618.1)、 苹 果 (XP 008387826.1)、 野 草 莓(XP 004302704.1)、 葡 萄(XP 002273035.1)、 可 可(XP 007026918.2) 的 相 似 性 均 在80% 以 上, 表 明 同 科 植 物 的 氨 基 酸 序 列 相 似 度 较 高。 该 基 因 具 有 保 守 的 结 构 区 域, 并 且 比 对 结 果 发 现 LooPA、LooPB、LooPC 这3 个 环 在 不 同 的 物 种 中 存 在 氨 基 酸 的 不 同( 图3), 不 结 球 白 菜 与 拟 南 芥 相 比 较 LooPA 中117 位 点 处 由 丙 氨 酸 变 为 缬 氨 酸, 在LooPB 中 不 结 球 白 菜 与 拟 南 芥 不 存 在 氨 基 酸 的 变 异, 而 LooPC 中 主 要 在291、292、293 氨 基 酸 位 点 处 由 亮 氨 酸、 天 冬 酰 胺、 丙 氨 酸 分 别 改 变 为 缬 氨 酸、 苏 氨 酸 和 甘 氨 酸。 与 以 上 序 列 比 对 中 的 植 物 物 种 进 行 同 源 进 化 分 析 并 构 建 进 化 树, 结 果( 图5) 显 示: 十 字 花 科 的 拟 南 芥、 亚 麻 芥、 大 白 菜、 不 结 球 白 菜、 油 菜 各 自 聚 集 在 同 一 分 支 中, 而 蔷 薇 科 的 苹 果、 野 草 莓 同 样 聚 集 在 同 一 分 支 中。 3 4 2 南 京 农 业 大 学 学 报 第41 卷 图4 不 结 球 白 菜BcAKR4C9 与 其 他 物 种 氨 基 酸 序 列 同 源 性 比 对 Fig4 AlignmentofaminoacidsequencesofBcAKR4C9andhomologsfromotherplants 4 4 2 第2 期 张 飞 雪, 等: 不 结 球 白 菜 醛 酮 还 原 酶 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 及 表 达 分 析 图5 不 结 球 白 菜 与 其 他 植 物BcAKR4C9 氨 基 酸 序 列 的 系 统 进 化 树 Fig5 PhylogenetictreeofBcAKR4C9ofnon-headingChinesecabbageandotherplants 图6 不结球 白菜 B c A K R 4 C 9 基因 在 不 同组织 中 的 相 对 表 达 量 Fig6 Relativeexpressionlevelof B c A K R 4 C 9 geneindifferenttissuesfrom non-headingChinesecabbage 2.3 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 同 组 织 及 不 同 胁 迫 、 不 同 激 素 处 理 下 的 表 达 分 析 由 图6 可 见: 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 在 根 和 叶 片 中 均 有 表 达, 在 叶 中 的 表 达 量 要 高 于 根 中。 由 图7 可 见: 高 温 和 低 温 胁 迫 处 理 均 能 使 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 的 表 达 量 升 高, 且 高 温 和 低 温 处 理 下, B c A K R 4 C 9 具 有 相 似 的 表 达 趋 势, 即 在12h 表 达 量 达 到 最 高, 随 后 表 达 水 平 有 所 降 低。 在020gL -1 NaCl 质 量 浓 度 范 围 内, B c A K R 4 C 9 基 因 表 达 水 平 随NaCl 质 量 浓 度 的 升 高 而 升 高, 当NaCl 为20gL -1 时, 基 因 相 对 表 达 量 达 到 初 始 量 的70 倍 左 右。 伤 害 处 理4h, 该 基 因 表 达 量 明 显 上 升, 而12h 后 该 基 因 表 达 量 则 低 于 对 照 水 平。 图7 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 同 胁 迫 条 件 下 的 相 对 表 达 水 平 Fig7 Relativeexpressionlevelof B c A K R 4 C 9geneinnon-headingChinesecabbageunderdifferentstresses 5 4 2 南 京 农 业 大 学 学 报 第41 卷由 图8 可 见: 水 杨 酸、 脱 落 酸、 茉 莉 酸 甲 酯 均 能 诱 导 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 的 表 达。 水 杨 酸 和 茉 莉 酸 甲 酯 处 理 下, 该 基 因 具 有 相 似 的 表 达 趋 势, 即 在 处 理4h 后 表 达 量 明 显 上 升, 之 后 表 达 量 下 降, 至24h 又 急 剧 升 高。 脱 落 酸 处 理12h 时, 该 基 因 相 对 表 达 量 急 剧 增 加,24h 时 又 明 显 下 降。 图8 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 同 激 素 处 理 后 的 相 对 表 达 水 平 Fig8 Relativeexpressionlevelof B c A K R 4 C 9geneinnon-headingChinesecabbageunderdifferenthormones SA: 水 杨 酸Salicylicacid;JA: 茉 莉 酸 甲 酯Methyljasmonate;ABA: 脱 落 酸Abscisicacid. 3 讨 论 拟 南 芥 A K R 4 C 9 基 因 被 认 为 是 植 物AKR 家 族 中 一 个 保 护 植 物 免 受 应 激 氧 化 胁 迫 的 重 要 候 选 基 因 8 , 对 其 酶 动 力 学 参 数 研 究 表 明AKR4C9 可 以 活 化 类 固 醇, 降 解 糖 类 和 一 系 列 脂 肪 醛 等 化 合 物,X-ray 晶 体 结 构 构 建 也 证 明 了 其 具 有 广 泛 的 底 物 特 征, 并 且 比 其 他AKR 亚 家 族 成 员 有 更 开 放 和 更 适 宜 的 催 化 活 性 位 点 3 。 因 此 A K R 4 C 9 同 源 基 因 可 以 作 为 重 要 经 济 作 物 培 育 多 抗 品 种 的 目 标 4 。 本 研 究 从 不 结 球 白 菜 苏 州 青 中 克 隆 到 B c A K R 4 C 9 基 因, 发 现 与 拟 南 芥 基 因 序 列 具 有 较 高 同 源 性, 其 序 列 相 似 度 为88.7%, 序 列 同 源 性 比 对 表 明 A K R C 49 基 因 具 有 保 守 的 结 构 区 域。 蛋 白 进 化 树 分 析 发 现 不 结 球 白 菜 与 同 属 于 十 字 花 科 的 萝 卜、 油 菜 进 化 距 离 较 近, 且 同 属 于 一 个 分 支, 同 属 于 蔷 薇 科 的 苹 果 和 野 草 莓 也 被 分 到 同 一 分 支 上, 并 且 与 鼠 李 科 的 枣 具 有 相 对 较 近 的 进 化 距 离。 同 属 于 锦 葵 目 的 锦 葵 科 中 棉 与 梧 桐 科 的 可 可 树 也 具 有 相 对 较 近 的 进 化 距 离, 并 在 同 一 进 化 分 支 上, 可 以 看 出 各 科 的 进 化 关 系 均 比 较 保 守。 通 过 蛋 白 三 级 结 构 的 预 测 分 析 发 现 拟 南 芥 与 不 结 球 白 菜 具 有 相 似 的 空 间 结 构, 某 些 氨 基 酸 改 变 并 没 有 改 变AKR4C9 的 构 象, 推 测 其 存 在 相 似 功 能。 本 研 究 通 过 对 B c A K R 4 C 9 基 因 的4 低 温 处 理 和42 热 激 处 理 发 现 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 具 有 相 似 的 表 达 趋 势, 推 测 该 基 因 在 低 温 和 高 温 的 胁 迫 响 应 中 可 能 具 有 一 致 的 响 应 模 式, 推 测 A K R 基 因 与 醛 酮 解 毒 的 作 用 有 关, 其 调 控 机 制 有 待 进 一 步 明 确。 通 过 不 同 浓 度 的NaCl 处 理 发 现, 在020gL -1 的 NaCl 质 量 浓 度 范 围 内, 该 基 因 表 达 量 随NaCl 质 量 浓 度 升 高 而 升 高。 在 麻 风 树 中 表 达 J c A K R 基 因 的 细 菌 和 酵 母 细 胞 对NaCl(200mmolL -1 )、 甲 基 乙 二 醛(MG,5mmolL -1 ) 处 理 有 更 高 的 耐 受 性 16 , 表 明 A K R 基 因 在 非 生 物 胁 迫 耐 受 性 中 发 挥 作 用。 本 研 究 发 现 不 结 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 能 够 被 水 杨 酸、 脱 落 酸 和 茉 莉 酸 甲 酯 诱 导 表 达, 脱 落 酸 处 理12h, 表 达 量 迅 速 达 到 峰 值, 随 后 又 迅 速 下 降 到 接 近 对 照 水 平。 A K R 在 多 种 作 物 中 被 证 明 能 够 被 脱 落 酸 诱 导 表 达 17 。 目 前 关 于 该 基 因 与 不 同 激 素 之 间 的 作 用 并 未 见 报 道。 由 于 非 生 物 胁 迫 为 降 低 作 物 产 量 的 重 要 因 素 1 , 因 此 提 高 作 物 的 抗 逆 性 已 经 成 为 育 种 工 作 的 重 要 目 标 之 一。 不 结 球 白 菜 在 长 江 中 下 游 及 以 南 地 区 被 广 泛 种 植 18 , 不 可 避 免 会 遭 遇 高 温、 低 温、 旱 涝 等 多 种 逆 境 胁 迫, 因 此 发 掘 不 结 球 白 菜 的 抗 逆 基 因 以 及 研 究 抗 逆 基 因 的 功 能 不 仅 可 以 加 深 对 作 物 抗 逆 机 制 的 理 解, 同 时 对 于 如 何 提 高 种 质 抗 逆 性 具 有 重 要 的 意 义。 参 考 文