刺五加种苗质量分级标准及其方法的优选.pdf

中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae ISSN 1005-9903,CN 11-3495/R 中国实验方剂学杂志网络首发论文 题目： 刺五加种苗质量分级标准及其方法的优选 作者： 付士朋，沈宏伟，王谦博，张爽，刘悦，王振月 DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.201920 收稿日期： 2019-01-18 网络首发日期： 2019-06-12 引用格式： 付士朋，沈宏伟，王谦博，张爽，刘悦，王振月刺五加种苗质量分级标准及其方法的优选J/OL中国实验方剂学杂志.  https:/doi.org/10.13422/j.cnki.syfjx.201920 网络首发：在编辑部工作流程中，稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶段。录用定稿指内容已经确定，且通过同行评议、主编终审同意刊用的稿件。排版定稿指录用定稿按照期刊特定版式（包括网络呈现版式）排版后的稿件，可暂不确定出版年、卷、期和页码。整期汇编定稿指出版年、卷、期、页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件。录用定稿网络首发稿件内容必须符合出版管理条例和期刊出版管理规定的有关规定；学术研究成果具有创新性、科学性和先进性，符合编辑部对刊文的录用要求，不存在学术不端行为及其他侵权行为；稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑、出版的技术标准，正确使用和统一规范语言文字、符号、数字、外文字母、法定计量单位及地图标注等。为确保录用定稿网络首发的严肃性，录用定稿一经发布，不得修改论文题目、作者、机构名称和学术内容，只可基于编辑规范进行少量文字的修改。 出版确认：纸质期刊编辑部通过与中国学术期刊（光盘版）电子杂志社有限公司签约，在中国学术期刊（网络版）出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版，以单篇或整期出版形式，在印刷出版之前刊发论文的录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿。因为中国学术期刊（网络版）是国家新闻出版广电总局批准的网络连续型出版物（ISSN 2096-4188，CN 11-6037/Z），所以签约期刊的网络版上网络首发论文视为正式出版。 收稿日期 20190118（ 010）  基金项目 “十三五 ”国家重点研发计划项目 （ 2016YFC0500303）； 黑龙江省国家科技重大专项和重点研发项目省级资助项目 （ GX17C006）  第一作者 付士朋，在读硕士，从事刺五加种子种苗质量标准研究， E-mail： 1196683291qq.com 通信作者 *王振月，教授，博士生导师，从事中药资源研究， Tel： 0451-87266873， E-mail： wangzhen_yue163.com 刺五加种苗质量分级标准及其方法的优选  付士朋 1，沈宏伟 1，王谦博 2，张爽 1，刘悦 1，王振月 1* （ 1.黑龙江中医药大学，哈尔滨  150040； 2.广东药科大学  附属第一医院，广州 510000）  摘要 目的 ：研究刺五加种苗质量，制定分级标准，并优选最佳分析方法。 方法 ：观察并测量一年生不同产地（宝清、林口、七台河、东方红、依兰、阿城、饶河及亚布力）刺五加实生苗的株高，径粗、叶面积，根长，叶绿素含量等主要农艺性状。分别采用 K-聚类分级法，主成分评价因子 K-聚类分析法，标准差法进行分级，以不同级别种苗成活率为 指标来评价 3种分级方法。 结果 ：直接 K-聚类分析方法进行刺五加种苗的质量分级为最优方法 ， 将刺五加种苗分为 3级 ， 其中 I级种苗株高 13 cm， 茎粗 0.37 cm， 根长 8 cm， 叶面积 28 cm2， 叶绿素含量 31， 主要所属产地为宝清 ， 七台河地区 ； II级种苗株高 813 cm， 茎粗 0.300.37cm， 根长 68 cm， 叶面积 1328 cm2，叶绿素含量 3132，主要所属产地为阿城，东方红，饶河地区； III级种苗株高 58 cm，茎粗 0.260.30 cm，根长 56 cm，叶面积 513 cm2，叶绿素含量 3238，主要所属产地为亚布力、依兰、林口。 结论 ：该实验初步建立了刺五加种苗的质量分级标准，并确定了宝清县和七台河为黑龙江省内育苗选种的优质产区，为刺五加种苗种植及人工栽培提供质量评价依据。  关键词 刺五加；种苗；质量标准；分级方法  中图分类号 R289； R285； R22； R2-031 文献识别码 A doi 10.13422/j.cnki.syfjx.201920 Study on Quality Grading Criteria and Optimize Methods of Acanthopanax senticosus Seedlings FU Shi-peng1， SHEN Hong-wei1， WANG Qian-bo2， ZHANG Shuang1， LIU Yue1， WANG Zhen-yue1* (1.Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China ;  2.The First Affiliated Hospital， School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510000， China) Abstract Objective： To study the quality of Acanthopanax senticosus seedlings， develop grading standards and optimize the best analytical method. Methods： Observing and measuring the plant height， diameter， leaf area， root length， chlorophyll content and other main agronomic traits of Acanthopanax senticosus seedlings from different habitats（ Baoqing， Qitaihe，Dongfanghong， Yilan， Acheng ， Raohe Linkou and Yabuli）  in each year. K-cluster grading method， principal component evaluation factor K-cluster analysis method， standard deviation method for grading， three classification methods were evaluated with different levels of seedling survival rate as indicators. Result： The direct K-cluster analysis method was used to determine the quality of Acanthopanax senticosus seedlings as the best method. The seedlings of Acanthopanax senticosus were divided into 3 grades， among In the first level the seedling height is13 cm， the stem diameter is 0.37 cm，the root length is 8 cm， the leaf area is 28 cm2， the chlorophyll content is 31， the main origin is Baoqing， Qitaihe area; In the second level the seedling height is 8-13 cm， the stem diameter is 0.30-0.37 cm， the root length is 6-8 cm， the leaf area is 13-28 cm2， the chlorophyll content is 31-32， and the main origin is Acheng， Dongfanghong， Raohe area. In the third level the seedling height is 5-8 cm， the stem diameter is 0.26-0.30 cm， the root length is 5-6 cm， the leaf area is 5-13 cm2， the chlorophyll content is 32-38， and the main origin is Yabuli， Yilan and Linkou. Conclusion： In this experiment， the quality grading standards of Acanthopanax senticosus seedlings were preliminarily established， Baoqing and Qitaihe can be used as a high-quality production area for breeding seeds in the Heilongjiang province.which provided the basis for quality evaluation of Acanthopanax senticosus seedling planting and artificial cultivation. Key words Acanthopanax senticosus； seedling； quality standard； classification method 网络首发时间：2019-06-12 14:00:37网络首发地址：http:/kns.cnki.net/kcms/detail/11.3495.r.20190610.1540.002.html刺五加为五加科植物刺五加的干燥根及根茎或茎，是我国临床常用大宗中药材。收载 于 2015年 版 中国药典，具有益气健脾，补肾安神之功效 1，能调节机体内外环境的平衡，增强机体的抵抗力，具有扶正固本的作用；可以调节免疫内分泌、血液循环、神经心脑血管等方面功能；对神经衰弱、脑栓塞、心脏病有较好的疗效，特别是对白细胞减少症和糖尿病有显著的疗效。近年由于我国以刺五加为原料的药品和保健品的大量开发，导致刺五加用量逐年增高， 刺五加野外生长缓慢，种子繁殖成活率低， 高强度采挖下，使刺五加野生资源匮乏，已被列为了渐危物种2，而人工规模化种植，不仅可以护刺五加野生资源，还能有效缓解市场供需。  中药材种子种苗质量 的标准化是中药材标准化的源头及基础，中国人民共和国种子法对 中药材本身的特殊性缺乏明确的规 定 3，导致中药材质量标准的监管力度远远落后于农业 4。目前刺五加只有两个行业标准，未对刺五加种苗制定统一的国家标准。随着人们对刺五加价值的认识不断提高，刺五加人工栽培的规模也逐渐加大，栽培过程中刺五加种苗的质量决定了刺五加药材的质量和产量，尤其是尚未达到采收年限的多年生药材，人工栽培迫切需要评价药材种苗质量标准。选择测定指标时考虑到后续种苗的移栽实验，所以测定指标要确保种苗在不受破坏的基础上，选择有代表性的，并 可测量的性状，为此，本实验测定了不同产地刺五加实生苗的株高，茎粗，根长，叶面积，叶绿素含量等主要农艺性状，并进行分级研究，以其成活率为评价指标来优选出最适刺五加种苗的分级方法，为人工培育刺五加及刺五加种苗进一步研究提供参考依据。  1 材料  2018 年 3 月 20 日，分别对采集于宝清（ BQ） ， 林口（ LK） ， 东方红（ DFH） ， 七台河（ QTH） ， 依兰（ YL） ，阿城（ AC） ， 饶河（ RH）及亚布力（ YBL） 8个产地的刺五加种子进行层积处理得到 360株刺五加一年生种苗 5。  FYZ-160型 恒温培养箱（杭州汇尔公司）； BDZ-246型 电热鼓风干燥箱（上海博迅集团）； METTLER AE240型1/10万天平 泰多利斯科学仪器（北京）有限公司 ； CD730型 游标卡尺（无锡锡工量具有限公司）； SPAD-502 Plus型 叶绿素仪（柯尼卡美能达投资有限公司）； Microtek Scan Maker 9700XL LA-S系列植物图像扫描仪（杭州万深科技有限公司）。  2 方法  2.1 种苗主要农艺性状参数观测   8个产地的刺五加种苗随机抽取 45株编号并挂牌，用卷尺分别测量其株高及根长；用游标卡尺测量其 径粗；用手持叶绿素仪在每株叶片上随机测量 3次，取平均值作为该植株最终叶片叶绿素含量值；Microtek Scan Maker 9700XL获取叶片图像，万深 LA-S型 叶面分析系统对幼苗叶片进行处理 6。  2.2 质量分级方法  2.2.1 K-聚类分级方法   采用 Excel 2013对实验数据进行初步计算，采用 IBM SPSS Statistics 19.0软件进行方差分析、K-均值聚类分析研究，制定刺五加实生苗分级标准， 其中每一项均符合规定标准才可纳入该标准等级 （下同）。  2.2.2 主成分评价因子 K-聚 类分析方法 7  采用 IBM SPSS Statistics 19.0软件进行方差分析、相关性分析，主成分分析并提取到 2个主成分，计算主成分的累积贡献率，进而获得主成分的特征向量和特征根，得到种苗评价因子（ F）计算公式，采用该公式计算所测得评价因子并进行 K-聚类分析，制定分级标准。  2.2.3 标准差法 8  采用 Excel 2013对实验数据进行初步计算，获得各参数的均值和标准差；采用标准差法对刺五加种苗进行分级处理，分级原则为各性状的平均值加标准差作为 一 ， 二 级的分界点，平均值是 二 ， 三 级种苗的分界点，平均值减标准差作为三级的最低值，低于三级的最低值即为等外种苗，以此作为分级标准。  2.2.4 种苗分级方法的比较   360株刺五加种苗移栽后进行统一的田间管理，于 3个月后统计每个等级种苗的存活情况；对 3种刺五加种苗分级方法进行评价，以期找到最优方法。  3 结果与分析  3.1 移栽参数数据   移栽当日共记录 360株刺五加种苗移栽后的生长情况，并测量了株高，茎粗，叶绿素含量，根长，具体数据见表 1。 8个产地实生苗图像扫描图见图 1。  表 1 刺五加实生苗植株参数统计描述 （ n=360）  Table 1 Statistical description of the parameters of Acanthopanax senticosus seedlings (n=360) 参数  最小值  最大值  均值  标准差  变异系数  株高 /cm 3.700 15.375 7.339 1.776 0.242 茎粗 /cm 0.223 0.398 0.288 0.012 0.052 根长 /cm 2.678 8.871 6.138 1.442 0.235 叶面积 /cm2 2.475 30.517 12.099 2.819 0.233 叶绿素 /SPAD值  25.125 45.000 34.884 8.093 0.232 A.宝清； B.七台河； C.阿城； D.东方红； E.饶河； F.亚布力   G.依兰   H.林口  图 1 八个产地实生苗扫描  Fig. 1 Scanning images of eight different origins seedlings 3.2 刺五加种苗质量分级方法的优选  3.2.1 种苗参数 K-聚类分析   采用 SPSS 19.0进行刺五加种苗参数 K-聚类，以株高，茎粗，根长，叶面积，叶绿素含量为主要指标，划分为三个等级， 由 表 2可以看出二、三等级刺五加种苗数量最多，约占刺五加总数的 75.0%，主要所属产地为阿城，东方红，饶河和亚布力、依兰、林口；一级占刺五加种苗总数的 25.0%，其中一等刺五加种苗主要属于宝清，七台河。  表 2 K-最终聚类中心和所属等级比例及产地  Table 2 K-final cluster center and its grade ratio and origin 等级  种苗参数  株高 /cm 茎粗 /cm 根长 /cm 叶面积 /cm2 叶绿素 /SPAD值  各等级种苗占比 /% 所属产地  一  12.9 0.373 7.9 27.7 31.0 25.0 BQ， QTH 二  8.5 0.299 6.4 12.6 31.7 37.5 AC， DFH， RH 三  5.1 0.258 5.5 4.7 38.2 37.5 YBL， YL， YK 3.2.2 刺五加种苗参数主成分分析结合聚类分析   采用 SPSS 19.0软件对刺五加种苗的株高 、 茎粗 、 根长 、 叶面积 、叶绿素含量 5个指标参数进行相关性分析，结果表明各参数之间的相关性均有统计性意义，株高与茎粗、根长、叶面积，茎粗与根长、叶面积，根长与叶面积 、 呈极显著正相关（ P<0.01），株高、茎粗、根长、叶面积与叶绿素含量呈显著负相关（ P<0.05）。说明这 5中种苗参数都能真实的反映刺五加种苗的质量信息，为刺五加实生苗分级的适合指标。 见表 3。  表 3 刺五加实生苗主要参数的相关系数 （ n=360）  Table 3 Correlation coefficient of main parameters of Acanthopanax senticosus seedlings（ n=360）  参数  株高  茎粗  根长  叶面积  叶绿素含量  株高  1.000 0.836* 0.751* 0.938* -0.645* 茎粗   1.000 0.770* 0.830* -0.532* 根长    1.000 0.674* -0.536* 叶面积     1.000 -0.694* 叶绿素含量      1.000 注： *P<0.01， *0.05< P<0.01，  由主成分分析结果可知，前 2个累积方差贡献率达到 91.969%，说明这两个主成分基本代表了全部指标信息，取前两个特征值，并计算相应的特征向量。 见 表 4。  表 4 主成分变量解释  Table 4 Explanation of principal component variables 主成分  初始特征值  被提取的载荷平方和  合计  方差贡献率 /% 累积方差贡献率 /% 合计  方差贡献率 /% 累积方差贡献率 /% 1 3.906 78.114 78.114 3.906 78.114 78.114 2 0.543 13.855 91.969 0.543 13.855 91.969 3 0.342 3.846 95.815    4 0.160 3.197 99.012    5 0.049 0.988 100    2个主成分 ， F1=0.257株高 +0.467茎粗 +0.460根长 +0.143叶面积 +0.471叶绿素含量 ， F2=0.053株高 -0.286茎粗 -0.304根长 +0.222叶面积 -1.065叶绿素含量 。 评价因子 F的计算公式为 F=F10.7811+F20.138 6。 计算所有种苗的评价因子 F并对其进行 K-聚类分析，把 120株刺五加种苗分为 3等，根据实际参数得出二等种苗的数目最多，占39%；一、三等种苗则分别占 24%， 37%。 见 表 5。  表 5 刺五加种苗评价因子聚类中心和所属苗数比例及产地  Table 5 Clustering Center of Acanthopanax senticosus seedling evaluation factor and the proportion and origin of seedlings 等级  F值  初始聚类中心  最终聚类中心  各等级苗数占比 /% 所属产地  一  23.445 22.706 24 BQ， QTH 二  20.119 20.908 39 AC， DFH， RH 三  16.802 18.203 37 YBL， YL， LK 3.2.3 刺五加种苗分析标准差法   以刺五加种苗的株高 、 茎粗 、 根长 、 叶面积 、 叶绿素含量为指标参数统计，采用标准差法对刺五加种苗进行分级处理，分级原则见 2.2.3，获得各等级参数范围。合格种苗约占总数的 87.5%，等外种子占比 12.5%。其中三等种苗的比例最大为 62.5%，所属产地为阿城、东方红、饶河、亚布力、依兰。 见 表 6。  表 6 刺五加种苗参数标准差法分级参数  Table 6 Standard parameters of acanthopanax senticosus seedling parameters 等级  种苗参数  株高 /cm 茎粗 /cm 根长 /cm 叶面积 /cm2 叶绿素 /SPAD值  各等级种苗占比/% 所属产地  一  10.9 0.341 5.2 21.0 40.3 16.7 BQ 二  7.3 0.288 3.5 12.1 34.9 8.3 部分 QTH 三  3.8 0.235 1.9 3.2 29.4 62.5 AC， DFH， RH，YBL， YL 等外  <3.8 0.235 1.9 3.2 29.4 12.5 LK 3.2.4 3种刺五加种苗分级方法的比较   刺五加药材的入药部位是根及根茎或茎，刺五加实生苗未达到用药标准，不适宜测定刺五加产量、有效成分分析。刺五加种苗的质量分级方法可以通过评价种苗的成活率来实现，从定植移栽后 3个月的存活率来看，直接 K-聚类分析方法与主成分分析评价因子 K-聚类分析方法的等级质量与存活率具有明显的正相关，其中一、二、三等级的种苗存活率分别为 81.03%， 72.32%和 44.81%。标准差法二级种苗的存活率为 80%，是其方法所有等级存活率最高值，其次为一等级种苗存活率为 75%，再次为三等，等外最低，没有呈现明显的相关性。因此从简便有效 来看，刺五加种苗参数直接 K-聚类分析是最优的刺五加种苗质量分级方法。 见 表 7。  表 7 3种刺五加种苗质量分级评价方法的对比  Table 7 Comparison of three methods for grading quality evaluation of Acanthopanax senticosus seedlings 等级  直接 K-聚类  主成分分析因子 K-聚类  标准差法  移栽苗数 /株  存活数量 /株  存活率 /% 移栽苗数 /株  存活数量 /株  存活率 /% 移栽苗数 /株  存活数量 /株  存活率 /% 一  90 72 80.0 84 69 82.4 60 45 75.0 二  135 96 62.0 141 100 70.9 30 24 80.0 三  135 65 48.0 135 56 41.5 225 115 51.1 等外        45 12 26.7 合计  360 233 64.7 360 225 62.5 360 196 54.4 4 讨论  种子（种苗）是最基本中药材生产的物质基础，种子（种苗）质量的好坏直接影响中药材的产量与质量，制定种子种苗分级标准是保障种子（种苗）质量，是提高产量的有效途径 9-10。近年来，关于中药材质量标准分级的文献很多，马伟等 11通过 K-聚类分析法进行了短瓣金莲花种子种苗的质量标准分级研究，刘洪见等 12运用主成分分析方法对杂交石竹种苗进行了质量评价，孙长生等 8采用标准差法对山豆根种苗的分级和质量标准提供了参考，本研究通过测量刺五加种苗的农艺指标，运用直接 K-聚类分析法、主成分分析法、标准差法来进行分级标 准方法的确定，以不同级别的刺五加种苗存活率为指标来评价 3种质量分级方法。最终得出直接 K-聚类分析法更适合刺五加种苗的分级标准研究。  在对刺五加种苗的调查与测定过程中，除以株高，茎粗，根长，叶面积作为常见的质量分级指标之外，还添加了叶绿素含量这一指标。叶绿素在植物光合作用中起着能量传递和捕获的作用，并指示植物生长发育状况 13-14。利用手持叶绿素仪能方便，准确的得到植株叶片的叶绿素含量。对 8个产地的刺五加种苗进行质量分级研究，优选出直接 K-聚类分析法为刺五加种苗质量分级的最适方法，考虑到实际生产及应用的可 行性将株高，根长，叶面积，叶绿素含量数值精确到整数位，茎粗变化范围较小，精确到 0.01 cm，其中 一 级种苗株高 13 cm， 茎粗 0.37 cm， 根长8 cm， 叶面积 28 cm2， 叶绿素含量 31，主要所属产地为宝清，七台河地区； 二 级种苗株高 813 cm， 茎粗 0.300.37 cm， 根长 68 cm， 叶面积 1328 cm2， 叶绿素含量 3132，主要所属产地为阿城，东方红，饶河地区； 三 级种苗株高58 cm， 茎粗 0.260.30 cm， 根长 56 cm， 叶面积 513 cm2， 叶绿素含量 3238，主要所属产地为亚布力、依兰、林口。刺五加种苗不同产地间差异显著，宝清县和七台河的刺五加种苗具有明显优势，属于 一 级刺五加种苗，种苗质量良好，可为当地刺五加育苗选择种苗方面提供一定参考。  参考文献 1. 国家药典委员会 .中华人民共和国药典 .一部 M.北京： 中国医药科技 出版社， 2015： 206-207. 2. 汪松，解焱 .中国物种红色名录 .第一卷 M.北京：高等教育出版社， 2004： 101. 3. 高娜，孙永军，张建军，等 .中药材种子种苗质量分级标准研究进展 J.中国中医药信息杂志， 2018， 25(4)： 129-132. 4. 禹娟红，张尚智 .黄芪种子种苗质量标准研究进展 J.中兽医医药杂志， 2018， 37(4)： 95-96. 5. 沈宏伟，张爽，李佳宾，等 .不同浓度的外源 NO 对刺五加种子激素及酶含量变化的影响 J.中国实验方剂学杂志， 2019， Doi：10.13422/j.cnki.syfjx.20190110. 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