山东省番茄尖孢镰刀菌的分离及鉴定.pdf

山 东 农 业 科 学 20 19 51 12 7 8 8 1 Sha n d o ng A g r i c ul t u r a l S c i e nc e s D O I 1 0 1 4 0 8 3 j i s s n 1 0 0 1 4 9 4 2 2 0 1 9 1 2 0 1 6 收 稿 日 期 2 0 1 9 0 9 0 7 基 金 项 目 山 东 省 现 代 农 业 产 业 技 术 体 系 项 目 S D A I T 0 5 0 2 山 东 省 自 然 科 学 基 金 项 目 Z R 2 0 1 4 C Q 0 3 4 山 东 省 农 业 良 种 工 程 项 目 2 0 1 7 L Z G C 0 1 3 青 岛 市 民 生 科 技 计 划 项 目 1 8 6 1 1 1 4 n s h 作 者 简 介 张 秀 1 9 9 4 女 山 西 昔 阳 人 硕 士 主 要 从 事 蔬 菜 遗 传 育 种 及 生 物 技 术 研 究 E m a i l z h a g n x i u q w e r 1 2 3 4 1 6 3 c o m 通 讯 作 者 王 富 1 9 6 6 男 黑 龙 江 明 水 人 博 士 教 授 研 究 方 向 为 蔬 菜 遗 传 育 种 及 生 物 技 术 E m a i l w a n g f u a b c d 1 6 3 c o m 山 东 省 番 茄 尖 孢 镰 刀 菌 的 分 离 及 鉴 定 张 秀 刘 蕾 王 辉 李 文 丽 王 富 青 岛 农 业 大 学 园 艺 学 院 青 岛 市 遗 传 改 良 与 育 种 重 点 实 验 室 山 东 青 岛 2 6 6 1 0 9 摘 要 本 研 究 以 山 东 省 单 县 番 茄 枯 萎 病 及 临 淄 寿 光 胶 州 即 墨 海 阳 莱 阳 等 地 区 的 番 茄 颈 腐 根 腐 病 发 病 植 株 为 主 要 试 验 材 料 对 病 原 菌 进 行 分 离 纯 化 及 培 养 并 利 用 分 子 检 测 技 术 对 供 试 菌 株 进 行 生 理 小 种 鉴 定 结 果 显 示 山 东 单 县 番 茄 枯 萎 病 的 致 病 菌 为 番 茄 枯 萎 病 菌 生 理 小 种 1 其 他 地 区 番 茄 颈 腐 根 腐 病 致 病 菌 为 番 茄 枯 萎 病 菌 生 理 小 种 3 关 键 词 山 东 省 番 茄 分 子 检 测 尖 孢 镰 刀 菌 中 图 分 类 号 S 4 3 2 4 4 文 献 标 识 号 A 文 章 编 号 1 0 0 1 4 9 4 2 2 0 1 9 1 2 0 0 7 8 0 4 I s o l a t i o n a n d I d e n t i f i c a t i o n o f T o m a t o F u s a r i u m o x y s p o r u m i n S h a n d o n g P r o v i n c e Z ha n g X i u L i u L e i W a n g H ui L i W e nl i W a ng F u C o l l e g e o f H o r t i c u l t u r e Q i n g d a o A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y K e y L a b o r a t o r y o f G e n e t i c I m p r o v e m e n t T o m a t o M o l e c ul a r m a r ke r s F us ar i um o x y s p o r um 番 茄 枯 萎 病 和 番 茄 颈 腐 病 是 危 害 番 茄 生 产 的 主 要 土 传 病 害 尤 其 在 华 北 东 北 地 区 发 病 较 为 严 重 1 有 研 究 表 明 引 起 番 茄 枯 萎 病 和 颈 腐 病 的 病 原 菌 均 为 尖 孢 镰 刀 菌 2 尖 孢 镰 刀 菌 不 同 生 理 小 种 在 不 同 植 株 上 具 有 特 定 的 致 病 性 3 7 不 同 专 化 型 和 生 理 小 种 引 起 的 病 害 需 要 不 同 的 防 治 方 法 所 以 准 确 确 定 专 化 型 和 生 理 小 种 对 预 防 治 理 由 尖 孢 镰 刀 菌 引 起 的 病 害 尤 其 重 要 虽 然 尖 孢 镰 刀 菌 的 类 型 可 以 通 过 选 择 性 培 养 基 上 表 现 的 形 态 特 征 来 确 定 8 9 但 是 尖 孢 镰 刀 菌 的 致 病 类 型 专 化 型 和 种 族 却 不 能 由 此 鉴 定 目 前 最 普 遍 的 鉴 定 方 法 是 利 用 试 验 接 种 法 确 定 尖 孢 镰 刀 菌 的 专 化 型 和 相 应 生 理 小 种 但 是 这 种 方 法 耗 时 长 1 0 1 1 本 研 究 借 助 分 子 检 测 手 段 对 分 离 的 病 原 物 进 行 鉴 定 从 而 明 确 山 东 省 枯 萎 病 和 颈 腐 根 腐 病 病 原 菌 的 生 理 小 种 1 材 料 与 方 法 1 1 试 验 材 料 采 自 山 东 省 单 县 临 淄 寿 光 胶 州 即 墨 海 阳 莱 阳 地 区 番 茄 植 株 发 病 的 根 或 茎 1 2 试 验 方 法 1 2 1 真 菌 的 分 离 纯 化 及 培 养 选 用 新 近 发 病 的 番 茄 植 株 作 为 分 离 材 料 使 用 之 前 表 面 喷 70 乙 醇 将 表 皮 组 织 用 灭 菌 解 剖 刀 削 去 在 病 健 交 界 处 取 材 切 取 其 中 小 块 变 色 的 维 管 束 组 织 升 汞 灭 菌 后 用 无 菌 水 冲 洗 数 次 放 于 P D A 培 养 基 上 每 个 培 养 基 放 1 3 块 2 5 培 养 5 d 即 可 长 出 菌 落 参 照 孙 飞 龙 1 2 的 方 法 进 行 单 孢 分 离 将 纯 化 的 单 菌 落 接 种 到 P D A 培 养 基 上 培 养 5 d 观 察 菌 落 形 态 大 小 和 颜 色 等 用 移 液 枪 吸 取 P D B 液 体 培 养 基 反 复 冲 洗 吹 打 菌 落 将 冲 洗 下 来 的 孢 子 和 菌 丝 加 入 150 m L 马 铃 薯 葡 萄 糖 液 体 培 养 基 中 于 180 r m i n 的 摇 床 上 振 荡 培 养 5 d 收 集 菌 丝 用 于 D N A 提 取 1 2 2 D N A 提 取 将 液 体 培 养 的 真 菌 用 三 层 纱 布 过 滤 后 1 000 r m i n 离 心 10 m i n 弃 掉 上 清 液 保 留 沉 淀 在 烘 箱 中 35 下 烘 12 h 即 可 得 到 干 燥 的 菌 丝 使 用 真 菌 基 因 组 D N A 提 取 试 剂 盒 S o l a r b i o 提 取 真 菌 样 品 D N A 1 2 3 D N A 浓 度 的 检 测 取 5 L D N A 样 品 采 用 1 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 进 行 检 测 12 0 V 1 1 0 A 30 m i n 于 B i o R A D 自 动 凝 胶 成 像 系 统 观 察 条 带 亮 度 并 使 用 紫 外 分 光 光 度 计 检 测 样 品 D N A 浓 度 1 2 4 分 子 检 测 用 四 种 引 物 1 3 表 1 分 别 进 行 P C R 扩 增 P C R 反 应 体 系 模 板 D N A 20 8 0 ng L 2 0 L 2 P C R M i x 含 M g 2 dN T P s T a q D N A P o l y m e r a s e 等 1 0 0 L 引 物 1 0 m o l L 各 1 0 L 灭 菌 超 纯 水 6 0 L P C R 反 应 程 序 9 4 5 m i n 94 30 s 5 6 U n i 58 s p 13 s p 23 s pr l 30 s 72 30 s 35 个 循 环 72 1 0 m i n P C R 反 应 结 束 后 取 7 L 扩 增 产 物 用 1 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 进 行 检 测 采 用 B i o R A D 自 动 凝 胶 成 像 系 统 观 察 并 拍 照 记 录 扩 增 结 果 表 1 所 用 引 物 信 息 引 物 名 称 序 列 5 3 位 置 u n i f A T C A T C T T G T G C C A A C T T C A G n t 1 7 0 1 9 0 o f S a i t a m a l y 1 p g 1 u n i r G T T T G T G A T C T T T G A G T T G C C A n t 8 4 1 8 2 0 o f S a i t a m a l y 1 p g 1 s p 1 3 f G T C A G T C C A T T G G C T C T C T C n t 8 9 6 9 1 5 o f S a i t a m a r l y p g x 4 s p 1 3 r T C C T T G A C A C C A T C A C A G A G n t 1 3 4 0 1 3 2 1 o f S a i t a m a r l y p g x 4 s p 2 3 f C C T C T T G T C T T T G T C T C A C G A n t 2 4 0 2 6 0 o f S a i t a m a l y 1 p g 1 s p 2 3 r G C A A C A G G T C G T G G G G A A A A n t 7 5 7 7 3 8 o f S a i t a m a l y 1 p g 1 s p r l f G A T G G T G G A A C G G T A T G A C C n t 3 8 5 4 0 4 o f S a i t a m a r l y p g x 4 s p r l r C C A T C A C A C A A G A A C A C A G G A n t 1 3 3 0 1 3 1 0 o f S a i t a m a r l y p g x 4 2 结 果 与 分 析 2 1 真 菌 的 菌 落 形 态 病 原 菌 在 P D A 培 养 基 上 2 5 培 养 5 d 后 临 淄 寿 光 胶 州 即 墨 海 阳 莱 阳 地 区 的 病 原 菌 形 态 基 本 一 致 菌 落 颜 色 呈 淡 白 灰 色 圆 形 菌 丝 为 绒 毛 状 直 径 大 致 60 m m 单 县 分 离 的 菌 株 与 其 它 几 个 地 区 存 在 明 显 区 别 菌 落 颜 色 呈 淡 粉 白 色 圆 形 菌 丝 绒 毛 状 长 且 密 集 菌 丝 量 大 图 1 A G 分 别 为 单 县 临 淄 寿 光 胶 州 即 墨 海 阳 莱 阳 地 区 菌 株 图 1 山 东 省 不 同 地 区 病 原 菌 的 菌 落 形 态 特 征 2 2 D N A 的 质 量 与 浓 度 检 测 经 紫 外 分 光 光 度 计 检 测 样 品 D N A 的 O D 2 6 0 O D 2 8 0 值 在 1 8 2 0 范 围 内 说 明 真 菌 D N A 样 品 质 量 良 好 用 1 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 电 泳 条 带 明 亮 且 整 齐 无 拖 带 图 2 均 可 用 于 P C R 扩 增 2 3 分 子 标 记 检 测 引 物 u ni f r 和 s p 13 f r 在 所 有 菌 株 D N A 中 均 可 分 别 扩 增 出 67 0 b p 和 445 bp 的 特 异 片 段 引 物 M D L 2 0 0 0 M a r k e r 1 7 分 别 为 单 县 临 淄 寿 光 胶 州 即 墨 海 阳 莱 阳 菌 株 下 同 图 2 供 试 样 品 真 菌 D N A 电 泳 图 谱 9 7 第 12 期 张 秀 等 山 东 省 番 茄 尖 孢 镰 刀 菌 的 分 离 及 鉴 定 s pr l f r 在 所 有 样 品 中 均 未 扩 增 出 94 7 b p 的 特 异 片 段 引 物 s p 2 3 f r 在 除 单 县 外 的 其 它 地 区 菌 株 D N A 中 均 扩 增 出 51 8 b p 的 特 征 片 段 图 3 初 步 确 定 单 县 枯 萎 病 病 原 菌 为 枯 萎 病 菌 生 理 小 种 1 F u s ar i um o x y s p o r um f s p l y c o p e r s i c i r a c e 1 F o l 1 其 它 地 区 病 原 菌 为 枯 萎 病 菌 生 理 小 种 3 F u s ar i um o x y s p o r um f s p l y c o p e r s i c i r a c e 3 F o l 3 A D 分 别 为 引 物 u n i f r s p 1 3 f r s p 2 3 f r s p r l f r 的 扩 增 结 果 图 3 4 对 引 物 的 P C R 扩 增 结 果 3 讨 论 与 结 论 本 研 究 发 现 临 淄 寿 光 胶 州 即 墨 海 阳 莱 阳 地 区 的 病 原 菌 菌 落 特 征 基 本 一 致 单 县 菌 株 的 菌 落 特 征 与 其 它 地 区 有 明 显 区 别 进 一 步 利 用 分 子 检 测 技 术 进 行 鉴 定 发 现 临 淄 寿 光 胶 州 即 墨 海 阳 莱 阳 6 个 地 区 的 病 原 菌 为 枯 萎 病 菌 生 理 小 种 3 单 县 地 区 的 病 原 菌 为 枯 萎 病 菌 生 理 小 种 1 番 茄 颈 腐 根 腐 病 害 已 给 美 国 日 本 加 拿 大 墨 西 哥 以 色 列 韩 国 以 及 欧 洲 等 许 多 国 家 和 地 区 的 番 茄 生 产 造 成 重 大 损 失 1 山 东 省 于 2 01 0 年 在 寿 光 发 现 该 病 害 后 该 病 害 逐 渐 蔓 延 至 全 省 各 地 当 前 此 病 害 已 经 严 重 威 胁 到 山 东 省 温 室 大 棚 冬 春 季 番 茄 生 产 1 4 本 研 究 对 从 山 东 省 主 要 番 茄 产 区 采 集 的 番 茄 颈 腐 根 腐 病 病 样 进 行 病 原 菌 分 离 纯 化 及 鉴 定 基 本 确 定 引 起 山 东 省 番 茄 颈 腐 根 腐 病 主 要 病 原 物 为 番 茄 枯 萎 病 生 理 小 种 3 H i r a n o 等 1 3 将 日 本 地 区 番 茄 颈 腐 根 腐 病 病 原 菌 鉴 定 为 F u s ar i u m o x y s p o r u m f s p r adi c i s l y c o p e r s i c i F O R L 可 见 山 东 省 番 茄 颈 腐 根 腐 病 病 原 菌 与 日 本 地 区 不 同 参 考 文 献 1 J a c o b s A H e e r d e n S W F i r s t r e p o r t o f F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p r a d i c i s l y c o p e r s i c i i n S o u t h A f r i c a J A u s t r a l a s i a n P l a n t D i s N o t e s 2 0 1 2 7 2 9 3 2 2 耿 丽 华 李 常 保 迟 胜 起 等 番 茄 颈 腐 根 腐 病 病 原 鉴 定 及 不 同 条 件 对 其 生 长 的 影 响 J 植 物 病 理 学 报 2 0 1 2 4 2 5 4 4 9 4 5 5 3 N o g u e z M A T o k e s h i H R e v i e w o f c l a s s i f i c a t i o n o f r a c e 3 o f F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p l y c o p e r s i c i J A n a i s D a E s c o l a S u p e r i o r D e A g r i c u l t u r a L u i z D e Q u e i r o z 1 9 7 3 3 1 4 1 9 4 3 0 4 S c h m i d t S M H o u t e r m a n P M S c h r e i v e r I e t a l M I T E s i n t h e p r o m o t e r s o f e f f e c t o r g e n e s a l l o w p r e d i c t i o n o f n o v e l v i r u l e n c e g e n e s i n F u s a r i u m o x y s p o r u m J B M C G e n o m i c s 2 0 1 3 1 4 1 1 1 9 1 3 9 5 C i r u l l i M A l e x a n d e r L G A c o m p a r i s o n o f p a t h o g e n i c i s o l a t e s o f F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p l y c o p e r s i c i a n d d i f f e r e n t s o u r c e s o f r e s i s t a n c e i n t o m a t o J P h y t o p a t h o l o g y 1 9 9 6 5 6 1 3 0 1 1 3 0 4 6 G r a t t i d g e R O B r i e n R G O c c u r r e n c e o f a t h i r d r a c e o f F u s a r i u m w i l t o f t o m a t o e s i n Q u e e n s l a n d J P l a n t D i s e a s e 1 9 8 2 6 6 2 1 6 5 1 6 6 7 S h i o m i H K o m a d a H H i g h l y v i r u l e n t i s o l a t e s o f F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p l y c o p e r s i c i r a c e 2 J A n n a l s o f t h e P h y t o p a t h o l o g i c a l S o c i e t y o f J a p a n 2 0 0 6 7 2 2 2 1 2 2 2 0 8 山 东 农 业 科 学 第 51 卷 8 L a u r e n c e M H W a l s h J L S h u t t l e w o r t h L A e t a l S i x n o v e l s p e c i e s o f F u s a r i u m f r o m n a t u r a l e c o s y s t e m s i n A u s t r a l i a J F u n g a l D i v e r s i t y 2 0 1 5 7 7 1 1 1 8 9 G h i a s i a n S A R e z a y a t S M K o r d B a c h e h P e t a l F u m o n i s i n p r o d u c t i o n b y F u s a r i u m s p e c i e s i s o l a t e d f r o m f r e s h l y h a r v e s t e d c o r n i n I r a n J M y c o p a t h o l o g i a 2 0 0 5 1 5 9 1 3 1 4 0 1 0 T r o i s i M B e r t e t t i D G u l l i n o M L e t a l R a c e d i f f e r e n t i a t i o n i n F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p c h r y s a n t h e m i J J o u r n a l o f P h y t o p a t h o l o g y 2 0 1 3 1 6 1 1 0 6 7 5 6 8 8 1 1 W o o S L Z o i n a A D e l S o r b o G e t a l C h a r a c t e r i z a t i o n o f F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p p h a s e o l i b y p a t h o g e n i c r a c e s V C G s R F L P s a n d R A P D J P h y t o p a t h o l o g y 1 9 9 6 8 6 9 9 6 6 9 7 3 1 2 孙 飞 龙 北 五 味 子 3 种 病 害 的 病 原 菌 鉴 定 及 有 效 药 剂 筛 选 D 长 春 吉 林 农 业 大 学 2 0 1 6 1 3 H i r a n o Y A r i e T P C R b a s e d d i f f e r e n t i a t i o n o f F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p l y c o p e r s i c i a n d r a d i c i s l y c o p e r s i c i a n d r a c e s o f F o x y s p o r u m f s p l y c o p e r s i c i J J o u r n a l o f G e n e r a l P l a n t P a t h o l o g y 2 0 0 6 7 2 5 2 7 3 2 8 3 1 4 程 琳 张 生 李 艳 青 等 番 茄 颈 腐 根 腐 病 病 原 菌 鉴 定 与 抗 病 种 质 材 料 的 筛 选 J 园 艺 学 报 2 0 1 6 4 3 4 7 8 1 7 8 8 1 8 第 12 期 张 秀 等 山 东 省 番 茄 尖 孢 镰 刀 菌 的 分 离 及 鉴 定