黄瓜抗白粉病突变体筛选与鉴定.pdf

中国农业科学 2020 53 1 172 182 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2020 01 016 收稿日期 2019 06 03 接受日期 2019 10 23 基金项目 国家 十三五 重点研发计划子课题 2016YFD0100204 25 江苏省农业科技自主创新项目 CX 17 3016 江苏省农业重大新品种创制 项目 PZCZ201719 江苏高校 青蓝工程 人才项目 联系方式 亓飞 E mail qifei0115 通信作者娄群峰 E mail qflou 开放科学 资源服务 标识码 OSID 黄瓜抗白粉病突变体筛选与鉴定 亓飞 林姝 宋蒙飞 张孟茹 陈姝延 张乃心 陈劲枫 娄群峰 南京农业大学园艺学院 作物遗传与种质改良国家重点实验室 南京 210095 摘要 目的 白粉病是危害黄瓜产量 品质的最严重的病害之一 抗白粉病材料的发掘与研究 可以实现 从根本上解决病害问题 对获得的 长春密刺 突变体材料进行分析 旨在筛选出黄瓜抗白粉病突变体材料 丰 富育种群体 方法 对400 份 长春密刺 突变体材料进行苗期接种白粉病菌试验 通过叶片病斑观察结合病情 指数分析 初步筛选出抗病材料 将筛选出的抗病材料在大田环境下自然发病进一步观察表型 对初步筛选出的 抗病材料进行苗期生理鉴定 测定并分析超氧化物歧化酶 过氧化物酶 过氧化氢酶活性以及叶绿素a 叶绿素b 类胡萝卜素 可溶性蛋白含量等生理指标 通过田间自然发病进一步筛选抗病材料 并测定其蒸腾速率 胞间二 氧化碳浓度 气孔导度 净光合速率等光合作用指标及乙烯 茉莉酸 水杨酸激素含量 并通过荧光定量 PCR 分 析叶片中乙烯 茉莉酸 水杨酸 木质素 病程相关蛋白等防御信号途径中相关基因的表达 结果 与感病材料 相比 抗病材料的表面菌斑少 净光合速率 气孔导度都优于对照 长春密刺 胞间CO2浓度低于 长春密刺 在防御激素方面 抗病材料的乙烯 茉莉酸 水杨酸含量同样优于感病材料 而在成熟期叶片的防御信号途径相 关基因表达上 抗病材料的表达高于感病材料 通过苗期接种白粉病菌和田间自然发病综合筛选出了两份抗白粉 病突变体材料 Mu 86 2 Mu 58 9 结论 通过对突变体库的筛选可以获得抗白粉病新材料 这些材料的获得对 黄瓜抗白粉病的遗传研究和新品种培育具有重要价值 关键词 黄瓜 突变体 抗白粉病 筛选鉴定 Screening and Identification of Cucumber Mutant Resistant to Powdery Mildew QI Fei LIN Shu SONG MengFei ZHANG MengRu CHEN ShuYan ZHANG NaiXin CHEN JinFeng LOU QunFeng College of Horticulture Nanjing Agricultural University State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement Nanjing 210095 Abstract Objective Powdery mildew is one of the most serious diseases that effects cucumber yield and quality The discovery and research of materials resistant to powdery mildew can fundamentally solve the disease problem To screen out materials of cucumber resistant to powdery mildew and enrich the breeding population the Changchunmici mutants were investigated and analyzed in the study Method Totally 400 Changchunmici mutant lines were inoculated with powdery mildew at seedling stage and resistant materials were screened preliminarily based on leaf lesion observation combined with disease index analysis The selected resistant materials were further observed in the natural environment in the field environment Physiological indexes of resistant materials in the seedling stages were analyzed including the activities of superoxide dismutase peroxidase and catalase activity and physiological indicators such as the contents of chlorophyll a chlorophyll b carotenoids and soluble protein 1期 亓飞等 黄瓜抗白粉病突变体筛选与鉴定 173 The resistant materials were screened by natural pathogenesis in the field and were further analyzed for the photosynthetic indexes such as transpiration rate intercellular carbon dioxide concentration stomatal conductance and net photosynthetic rate And the contents of ethylene jasmonic acid and salicylate were determined and expression of related genes in defense signaling pathways such as ethylene jasmonic acid salicylic acid lignin and disease related proteins in leaves were analyzed by real time PCR Result Compared with susceptible materials the resistant materials had less plaque The net photosynthetic rate and stomatal conductance of resistant materials were higher than those of wild type Changchunmici and the intercellular CO 2 concentration of them was lower than that of Changchunmici In terms of defensive hormones the contents of ethylene jasmonic acid and salicylate of resistant materials were higher than those in control The expression of defense signal related genes in mature leaves of resistant materials was higher compared with susceptible materials Two powdery mildew resistance materials Mu 86 2 and Mu 58 9 were screened by inoculation of powdery mildew in seedling stage and natural disease Conclusion The new materials resistant to powdery mildew could be obtained by screening mutant libraries The acquisition of these materials had the important value for the genetic research and new varieties breeding of cucumber resistance to powdery mildew Key words cucumber mutant resistance to powdery mildew screening and identification 0 引言 研究意义 黄瓜是一种非常重要的蔬菜作物 1 黄瓜在生产上易感染多种病害 其中白粉病是危害最 严重的病害之一 黄瓜的产量每年都会因白粉病的发 生而大幅度降低 2 黄瓜白粉病病菌的分布范围很广 且传播速度快 在适合的条件下 它可以迅速繁殖 3 白粉病菌一般从下部叶片开始染病 随后霉菌逐渐覆 盖整个叶片 这不但降低植株的光合效能 同时病菌 持续感染下去甚至导致整个植株萎黄枯干 早衰死亡 进而使植株产量和果实品质下降 4 目前生产上主要 使用化学杀菌剂控制 然而 过多的使用化学杀菌剂 导致白粉病菌产生抗药性 同时不利于环境保护和公 共卫生 因此 培育对白粉病菌具有抗性的品种是控 制该病的最有效和环保的措施 5 前人研究进展 国际上认为黄瓜白粉病病原菌是子囊菌亚门白粉菌属 E cichoracearum 和单囊壳属 S fuliginea 这两种白粉 病在各个国家的分布不尽相同 6 抗病黄瓜品种的选 育已经进行了几十年 但到目前为止尚未对潜在的抗 性基因进行功能性鉴定 7 长春密刺 是典型的华 北市场型黄瓜自交系 具有高收获性 对白粉病病原 体敏感 是一种易感基因型品种 周凤珍等 8 在对黄 瓜白粉病抗性鉴定的研究中发现 在使用浓度为 4 8 10 5 6 10 5 mL 的孢子悬浮液接种黄瓜第二真 叶期幼苗发现材料的感病率达到 100 对于白粉病 的分级大多采用 5 个级别表示不同的染病情况 根 据病情指数作出相应的抗性分级 植物病原菌侵入 植物体后会引起很多复杂的变化 除了肉眼可见的 外表变化外 在寄主植物体内还会发生复杂的生理 生化变化 9 以抵御外来病原菌的入侵 植物在逆境 胁迫条件下 体内活性氧产生和消除的代谢平衡受到 破坏 这将导致活性氧过剩 继而引发和加剧膜脂过 氧化作用 从而破坏膜的结构与功能 对植物产生毒 害 10 11 同时 病菌入侵植物体后还会使植物光合作 用能力下降 叶绿素含量降低 12 导致植物产量下 降 严重会造成植株死亡 在遭受病菌入侵后 植物 能够通过细胞膜上的受体来识别病原菌从而触发复 杂的信号传导途径 以此来应对入侵 最主要的有 ET SA JA 介导的 3 条信号途径 这 3 条信号途径 分别参与不同的互作类型 引发不同的防御反应 13 14 而植物通过自身发生不同的防御反应来共同抵御外 来病原物的入侵 本研究切入点 近年来 随着人 们生活质量的不断提高 对于蔬菜品质的要求也越来 越高 加上长期使用杀菌剂使白粉病菌产生抗药性 15 人们迫切希望能通过育种工作来选育优良品种 通过 人工诱变育种来获得优良品种是一种有效的方式 拟解决的关键问题 本研究利用已经建立的 长春 密刺 突变体库 通过苗期接种白粉病菌处理 依照 病级以及病情指数 幼苗相关的生理指标分析筛选出 苗期抗白粉病的突变体单株 然后在大田环境下进一 步观察 在表型观察的基础上 分析其光合指标及防 御相关激素及与防御信号途径相关基因的表达 综合 各项指标 最终筛选出抗性好的黄瓜突变体材料 1 材料与方法 试验于 2017年 10月至 2019年 3月在南京农业大 学园艺学院进行 1 1 材料与处理 本试验所用材料由南京农业大学葫芦科作物遗传 与种质创新实验室提供 前期已获得华北型黄瓜品种 174 中 国 农 业 科 学 5 3 卷 长春密刺 经甲基磺酸乙酯诱变处理后自交三代的 突变体材料 挑选饱满度和整齐度都较高的种子用于 试验 苗期抗病性筛选 对 400份突变体材料进行编号 每个编号取 5 粒籽粒饱满 大小一致的种子置于纸杯 中 用 56 的温水浸泡 6 h 后将水倒掉 置于光照培 养箱中进行催芽 种子出芽后将种子播于 72 孔穴盘 中 待长到二片真叶时进行人工接种 接种用的病原 菌孢子取自当季病叶 用毛笔将病叶上的病原孢子刷 下来 收集到无菌水中 搅拌均匀后用血球计数板测 定孢子浓度 所用的孢子悬浮液浓度为 5 10 5 个 mL 采用喷雾法进行接种 喷至叶片上沾满水珠为止 重 复 3 次 接种后将材料放于温室中 温度控制在白天 22 26 夜晚 18 20 湿度在 80 左右 接种后 进行病情指数统计 病情指数分级采用 SAKATA等 16 的方法 田间抗病性筛选 将从苗期筛选出的抗病突变体 材料播种催芽 催芽方式与苗期筛选相同 将突变体 材料与抗性对照材料 IL52 17 种植于南京农业大学白 马基地 自然发病 进行田间观察 在结果期对植株的 功能叶进行光合参数和防御相关激素含量的测定分析 1 2 显微观察 取接种后 7 d 的叶片 用磷酸缓冲液冲洗样品 采 用 Lecia DVM6 数码视频显微镜对叶片表面病菌进行 显微观察 取接种后 7 d 的叶片 用磷酸缓冲液清洗 样品 清洗后将样品切成 1 cm 2 的小块 用 2 5 戊二 醛固定 样品制备参考康振生 18 的方法 样品制备完 成后在日立 S 3000N 扫描电子显微镜下观察并拍照 1 3 酶及叶绿素 可溶性蛋白含量的测定 超氧化物歧化酶 SOD 活性测定采用氮蓝四唑 光化还原法 过氧化物酶 POD 活性测定采用愈创 木酚法 过氧化氢酶 CAT 活性测定采用紫外分光 光度计法 叶绿素含量测定采用乙醇溶液浸提法 可 溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法 1 4 光合参数测定 采用 LI 6400XT光合仪 在晴天中午光强为 6 000 lx 时选取不同编号同一部位的第 7 8 节叶片测量净 光合速率 蒸腾速率 胞间 CO 2 浓度 气孔导度 1 5 内源激素测定 取第 7 8 节叶片 功能叶 0 5 g 采用 ELISA 法 19 测定乙烯 茉莉酸 水杨酸含量 试剂盒由南京 森贝伽生物科技有限公司提供 每份样品进行 3 次重 复 1 6 RNA 提取 反转录和实时荧光定量 PCR 在成熟期采植株第 7 8 节叶片 总 RNA 的提取 采用 Trizol 法 反转录利用反转录试剂盒 TaKaRa 合成 CTR EIN2 ETR EDS5 NPR1 CCR PAL COI1 PDF PR2 及内参基因 Action 的引物 20 利用 CFX96 荧光定 量 PCR 仪 Bio Rad 公司 以及 SYBR Green1 试剂盒 TaKaRa 进行扩增 反应条件为 95 3 min 95 10 s 60 30 s 共 40 个循环 对 PCR结束后样品进行 熔解曲线分析 确定为特异性扩增 所有样品进行 3 次重复 采用 2 CT 法进行基因相对表达量分析 2 结果 2 1 黄瓜突变体苗期抗白粉病材料的筛选 2 1 1 抗病性病情指数分析 在黄瓜幼苗长到二叶 一心 用 5 10 5 个 mL 浓度的白粉病原菌悬浮液对幼 苗进行喷洒接种 观察发现 不同编号材料的抗病性 表现不一 依照病情指数将 400 份突变体材料分类 其中高抗材料 3 份 占接种材料总数的 0 75 中抗 材料 8 份 占 2 中感材料 30 份 占 7 50 其余 的为感病材料 共 359份 占总数的 89 75 根据病情指数分析 将选出的 3 份抗性材料和 8 份中抗材料进一步进行幼苗期抗性相关指标的鉴定分 析 表 1 表1 初步筛选的抗病突变体的病情指数分析 Table 1 Analysis of disease index of primary screening resistant mutants 编号 Code 病情指数 Disease index 抗性类型 Disease resistance 编号 Code 病情指数 Disease index 抗性类型 Disease resistance Mu 86 2 2 22 抗R Mu 104 2 20 20 中抗 MR Mu 58 9 3 33 抗R Mu 106 3 22 22 中抗 MR Mu 50 10 4 18 抗R Mu 59 8 22 22 中抗 MR Mu 9 9 9 00 中抗MR Mu 150 3 23 23 中抗 MR Mu 60 5 10 00 中抗MR Mu 118 2 24 24 中抗 MR Mu 84 8 15 56 中抗MR 1期 亓飞等 黄瓜抗白粉病突变体筛选与鉴定 175 2 1 2 感染白粉病菌叶片的显微观察 通过接种白 粉病菌 7 d 后在对照幼苗叶片部位可以清楚的观察到 一层白粉 取其中的一份抗病材料 Mu 58 9 通过显 微观察在抗病材料未能观察到菌丝体 图 1 A 而 在感病材料 长春密刺 叶片上能清楚的观测到病原 菌丝体 图 1 B 通过扫描电镜观察发现在不同病级的材料上 白 粉病菌丝的生长情况不同 在高抗材料 Mu 86 2 叶片 上未观察到菌丝体 图 2 A 在中抗材料上仅观察 到很少的孢子 随着感病程度加强 病原菌丝体也逐 渐明显 在感病材料上能观察到从菌丝中出现长且为 圆柱形的分生孢子 孢子直立地分开分枝 直至布满 整个叶片 2 1 3 生理生化指标 如表 2 所示 与对照 CK 长春密刺 相比 黄瓜突变体材料中叶绿素 a 叶绿素 b 类胡萝卜素含量均有不同程度变化 其 中 除 Mu 104 2 Mu 9 9 Mu 50 10 的叶绿素 a 和叶绿素 b 指标低于对照 其他材料的 3 种色素指 标均高于对照 且叶绿素 a 和叶绿素 b 的变化较类 胡萝卜素明显 A Mu 58 9 B 长春密刺 Changchunmici 图1 接种病菌处理后在显微观察下的白粉病菌丝生长情况 Fig 1 Growth of Podosphaera fusca mycelium under microscopic observation after inoculation 表2 接种白粉病菌后对黄瓜突变体幼苗色素含量影响 Table 2 Effect of inoculation of Podosphaera fusca on the pigment content of cucumber mutant seedlings 编号 Code 叶绿素 a含量 Chlorophyll a content 叶绿素 b 含量 Chlorophyll b content 类胡萝卜素 Carotenoids content CK 13 556 1 089abcd 4 713 1 081b 2 420 0 987b Mu 86 2 14 869 0 521abc 5 536 0 179ab 2 946 0 195ab Mu 58 9 16 723 0 536a 6 298 0 504ab 2 887 0 484ab Mu 50 10 11 825 3 908d 4 566 0 756ab 2 501 0 942b Mu 9 9 11 597 2 778bcd 4 291 0 886b 2 526 0 450b Mu 60 5 14 317 2 577abc 5 342 0 709ab 2 853 0 356ab Mu 84 8 14 921 2 864abc 5 635 1 691ab 2 950 0 296ab Mu 104 2 11 845 1 490cd 4 557 0 526b 2 609 0 475b Mu 106 3 14 333 2 758abc 5 599 0 923ab 2 993 0 292ab Mu 59 8 15 372 3 327abc 5 930 1 075ab 3 042 0 938a Mu 150 3 14 749 0 876abc 5 594 0 886ab 2 858 0 466ab Mu 118 2 15 839 1 838ab 6 100 0 822a 2 783 0 185ab CK 对照 长春密刺 不同字母表示不同处理间差异显著 P 0 05 下同 CK Control Changchunmici The different letters indicate significant difference at 0 05 level among different treatments The same as below 176 中 国 农 业 科 学 5 3 卷 A Mu 86 2 B Mu 150 3 C Mu 1 5 D 长春密刺 Changchunmici 图2 接种白粉病菌后不同材料的SEM 扫描电镜 观察 Fig 2 SEM observation of different materials after inoculation with Podosphaera fusca 如表 3 所示 有 3 个材料的 POD 活性显著高于对 照 4 个突变体材料 SOD 活性显著高于对照 4 个突 变体材料 CAT 活性显著高于对照 其中 Mu 86 2 和 Mu 58 9 的这 3 种酶活性显著高于对照 在这 3 种活 性酶中 突变体材料与 长春密刺 相比 SOD CAT 上升较少 POD 的活性比对照上升明显 表3 接种白粉病菌后对黄瓜突变体幼苗抗氧化酶活性的影响 Table 3 Effects of inoculation of Podosphaera fusca on the activities of antioxidant enzymes in cucumber mutants 编号Code POD活性 POD activity U g 1 min 1 SOD活性 SOD activity U g 1 CAT活性 CAT activity U g 1 min 1 CK 0 876 0 011bc 0 331 0 041bcde 13 104 0 381c Mu 86 2 2 143 0 651a 0 450 0 108b 16 906 0 565ab Mu 58 9 2 186 0 311a 0 415 0 028bc 18 800 2 630a Mu 50 10 1 836 0 526b 0 588 0 024a 14 960 0 876bc Mu 9 9 1 588 0 503b 0 309 0 003cde 13 120 0 155c Mu 60 5 1 208 0 520b 0 358 0 085bcde 14 040 0 501bc Mu 84 8 1 245 0 497b 0 302 0 115bcde 18 506 0 966a Mu 104 2 0 832 0 119bc 0 327 0 049bcde 11 920 0 969d Mu 106 3 0 589 0 237c 0 441 0 091bc 15 093 1 927ab Mu 59 8 2 272 0 404a 0 247 0 046e 13 040 0 855c Mu 150 3 0 977 0 228bc 0 268 0 087de 14 640 1 222bc Mu 118 2 0 964 0 152bc 0 380 0 031bcd 14 340 0 650bc 如图 3 所示 不同突变体可溶性蛋白质含量存在 差异 其中 Mu 58 9 Mu 86 2 Mu 50 10 幼苗的可 溶性蛋白的含量显著高于对照 抗性更好 Mu 84 8 Mu 106 3 的可溶性蛋白含量显著低于对照 其他突变 体材料与对照相比无显著差异 2 2 黄瓜抗白粉病突变体田间筛选 2 2 1 突变体材料田间抗病性的表型观察 通过苗 期筛选得到的材料在田间进行观察 发现除 Mu 86 2 Mu 58 9 外 其他材料抗性较差 在田间自然状态下 抗病材料 Mu 58 9 相对于感病材料叶片表面白粉病斑 更少 感病材料白粉病斑浓厚 严重的导致植株死亡 图 4 2 2 2 光合指标测定 如表 4 所示 在对田间自然发 病品种的光合指标测定分析中发现 抗性材料 Mu 58 9 Mu 86 2 IL52在净光合速率 气孔导度方 面都优于对照 其中 Mu 58 9的净光合速率相比 长 春密刺 上升 6 366 mol m 2 s 1 升高 38 气孔导 度上升 0 604 mmol m 2 s 1 升高 106 Mu 86 2 比 长春密刺 净光合速率上升 6 366 mol m 2 s 1 升 高 38 气孔导度上升 0 255 mmol m 2 s 1 升高 45 IL52比 长春密刺 净光合速率上升 7 1 mol m 2 s 1 升高 43 气孔导度上升 0 22 mmol m 2 s 1 升高 38 而蒸腾速率与对照相似 胞间 CO 2 浓度低于 对照 1期 亓飞等 黄瓜抗白粉病突变体筛选与鉴定 177 bc bcd bc d bc d bc bc ab a a bc 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 CCMC Mu 86 2 Mu 58 9 Mu 50 10 Mu 9 9 Mu 60 5 Mu 84 8 Mu 104 2 Mu 106 3 Mu 59 8 Mu 150 3 Mu 118 2 编号 Code 可溶性蛋白质含量 Content of soluble protein mg mL 1 图3 接种白粉病菌后黄瓜突变体幼苗的可溶性蛋白质含量 Fig 3 Soluble protein content of cucumber mutant seedlings after inoculation with Podosphaera fusca A 长春密刺 Changchunmici B Mu 58 9 图4 田间黄瓜突变体抗性情况 Fig 4 Resistance of cucumber mutants in the field 2 2 3 防御激素含量测定 如表 5所示 3份抗性材 料的 3种激素含量都高于对照 长春密刺 Mu 58 9 的茉莉酸含量比对照上升 349 603 pmol L 1 升高 26 Mu 86 2 上升 405 906 pmol L 1 升高 30 IL52 上升 345 675 pmol L 1 升高 25 在水杨酸含量上 与对照相比 Mu 58 9 上升 154 193 pmol L 1 升高 16 Mu 86 2 上升 103 828 pmol L 1 升高 11 IL52 上升49 59 pmol L 1 升高 5 在乙烯含量上 与对 照相比 Mu 58 9 上升 30 235 ng L 1 升高 19 Mu 86 2 上升 35 185 ng L 1 升高 22 IL52 上升 63 196 ng L 1 升 高 40 表明在防御外界病原菌入侵 时 3 种激素起到了重要作用 2 2 4 防御信号途径中相关基因表达分析 如图 5 所示 利用 Real time PCR 方法分析田间自然发病条 件下防御信号途径中相关基因的表达 在黄瓜成熟期 叶片的基因表达分析显示 与对照材料 长春密刺 相比 Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52中乙烯相关基因 CTR1 EIN2 ETR 表达量均较高 且 ETR 表达最明显 水杨 酸相关基因 NPR1 在抗性材料中呈现高表达 茉莉酸 相关基因在 COI1 在抗性材料中呈现高表达 病程相 关蛋白基因 PR2 在 Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 中比在 对照中表达要高 178 中 国 农 业 科 学 5 3 卷 相对表达量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 EIN2 a b b c 0 1 0 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 CTR1 c b b a 相对表达量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 COI1 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 相对表达量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 PAL CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 相对表达量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 CCR 相对表达量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 NPR1 相对表达量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 ETR b a b c CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 相对表达量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 EDS5 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 相对表达量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 PR2 a b b c 相对表达量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 CK Mu 58 9 Mu 86 2 IL 52 PDF1 2 相对表达量 Relative erpression level 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 0 1 0 b a b c b a b c b a b c b a b c b a b c b a b c 图5 田间自然发病条件下防御信号途径中相关基因的表达 Fig 5 Expression of related genes in defense signaling pathways under natural pathogenesis in the field 1期 亓飞等 黄瓜抗白粉病突变体筛选与鉴定 179 表4 田间感染白粉病菌后对突变体材料光合指标影响 Table 4 Effect of photosynthetic indicators on mutant materials after field infection with Podosphaera fusca 编号 Code 净光合速率 Net photosynthetic rate mol m 2 s 1 气孔导度 Stomatal conductance mmol m 2 s 1 胞间 CO 2 浓度 Intercellular CO 2 concentration mol mol 1 蒸腾速率 Transpiration rate mmol m 2 s 1 CK 16 500 1 252b 0 569 0 042b 302 666 9 865a 10 866 0 351a Mu 58 9 22 866 1 625a 1 173 0 188a 286 000 1 000b 10 666 0 650a Mu 86 2 22 866 2 281a 0 824 0 155b 278 000 10 000b 10 123 0 849a IL52 23 600 0 435a 0 789 0 074 b 295 666 3 780b 11 133 0 416a 表5 田间感染白粉病菌后对突变体材料防御激素含量影响 Table 5 Effect of defensive hormone content on mutant materials after field infection with Podosphaera fusca 编号 Code 茉莉酸含量 Jasmonic acid content pmol L 1 水杨酸含量 Salicylic acid content pmol L 1 乙烯含量 Ethylene content ng L 1 CK 1346 912 25 758b 960 066 23 283d 159 509 3 868d Mu 58 9 1696 515 31 178a 1114 259 19 026b 189 744 5 398b Mu 86 2 1752 818 51 115a 1063 894 29 433a 194 694 6 823b IL52 1692 587 47 625a 1009 656 10 652c 222 705 5 158a 3 讨论 本研究获得抗白粉病黄瓜突变体 Mu 58 9 Mu 86 2 这为进一步研究黄瓜抗病机制提供了材 料 植物在受到病原菌侵害后 病菌迅速繁殖 造成 叶片组织受损进而使其光合速率下降 叶绿素含量降 低 21 在本研究中 通过研究发现受到病菌侵害后 的不同突变体材料叶绿素 a 叶绿素 b 类胡萝卜素 均有不同程度的下降 且叶绿素 a 叶绿素 b 的含量 变化明显大于类胡萝卜素 叶绿素 a 主要存在于两 个光系统的 PS PS 核心复合物中 叶绿素 b 主要是两个光系统的天线组分 类胡萝卜素是光合 作用的辅助色素 白粉病菌侵染后 使黄瓜叶片光 合膜全链 D 电子传递受损 受损的主要部位在光系 统 22 叶绿素 a 比其他两种色素对白粉病菌更敏 感 本研究还发现 抗性材料的净光合速率 气孔 导度比对照高 黄瓜在遭受到病菌侵害后 由于叶 肉细胞光合活性下降从而造成光合速率下降 23 进 而影响植株正常生长 为抵御病原物侵染或逆境的影响 体内防御酶 活性的次生代谢物含量或发生明显变化 24 多数学 者认为植物体内防御性酶 POD SOD CAT等的活 性变化与植物的抗病性具有一定的关系 25 SOD POD CAT 能够有效清除过量的活性氧 减少对膜 结构和功能的破坏 SOD 活性的增加和减少经常与 疾病抗性和易感性相关 植物受到病原菌侵入后需 要增加 SOD 的活性来催化氧化爆发期间 H 2 O 2 的合 成以防止超氧化物的积累 26 CAT 是保护植物免受 ROS 氧化损伤的重要酶 27 几种酶共同协同来去除 O 2 和 H 2 O 2 28 通过对防御性酶的研究发现 与对照 相比 3 种防御酶的活性有不同程度的变化 高抗材 料较对照活性最强 在对材料的表型进行观察时 发现在苗期筛选得到的中抗材料在田间成熟下发病 严重 叶片上布满白粉 幼苗期的表型与成熟期有 差异 在对苗期进行病情分级时或许应该采用更严 格的分级 植物体内的防御反应机制十分复杂 植物通过多 条途径对外来的病原物产生反应 研究最深入的抗病 信号途径主要是乙烯 茉莉酸 水杨酸途径 29 植 物抗病性受到乙烯的调控 乙烯在植物抗病性上的