草莓、辣椒枯萎病菌的分离、鉴定及化学防治.pdf

第14卷第09期 南方农业 2020年3月 Vol 14 No 09 South China Agriculture Mar 2020 135 135 近年来 辣椒 草莓的种植面积越来越大 已成为 我国主要的经济作物 辣椒是人们餐桌上较为普遍的食 材 其种植面积仅次于大白菜 草莓因果实色泽亮丽 营养价值较高 而备受栽培者和消费者的喜爱 1 4 但随 着辣椒的连年种植及种植面积的逐年增多 辣椒病害发 生也越发严重 其中由镰刀菌引起的辣椒枯萎病是辣椒 生产栽培中最典型的病害之一 我国辣椒枯萎病发病率 一般为 15 30 个别地区严重时高达 70 80 造成巨大经济损失 随着草莓种植面积的不断扩大 品种 的不断更新 频繁地调种 引种以及连作也导致了草莓枯 萎病蔓延 再加上草莓灰霉病 白粉病 蛇眼病 炭疽病 红中柱根腐病 根结线虫病 病毒病和革腐病等不断发生 且越发严重 给栽培者带来较大的经济损失 5 7 目前 国内外关于辣椒枯萎病 草莓枯萎病致病菌 的报道有很多 对由尖孢镰刀菌引起的辣椒枯萎病 草 莓枯萎病的防治方法一般仍以化学防治为主 常用恶霉 灵 多菌灵和甲基托布津和代森锰锌等杀菌剂进行灌根 防治 但因连年使用这些药剂 防治效果逐年降低 甚 至达到无法控制的程度 8 9 由于该病害很难通过植物抗 病防御及抗性育种的方法防治 因此研究选用化学杀菌 剂氟硅唑 吡唑醚菌酯和氰烯菌酯对辣椒枯萎病和草莓 枯萎病进行了药剂实验 据报道 氰烯菌酯对小麦赤霉 病及水稻恶苗病均有良好的防治效果 但对辣椒枯萎病 的防治是否有效果还未见报道 氟硅唑 吡唑醚菌酯在 番茄颈腐病与根腐病的防治上有较好的防治效果 7 但 对草莓枯萎病的防治是否有效鲜有报道 1 材料与方法 1 1 实 验材料 实验品种为淮安红椒 红颜草莓 供试杀菌剂为氟硅唑 吡醚菌酯和氰烯菌酯 由江 苏农药研究所提供 药剂存放于 0 4 环境中 1 2 尖孢镰刀菌专化型的分离纯化与鉴定 从植株根际土壤中分别采取辣椒与草莓土样 10 g 各采取 5组土样 放入 250 mL三角瓶中 加入 90 mL的 无菌水 在 25 的条件下进行离心 然后吸取 1 mL悬 浮液 采用浓度梯度法按照 10 3 10 4 10 5 和 10 6 浓度 进行稀释 并均匀涂布于含有硫酸链霉素的马铃薯葡萄 糖琼脂培养基 PDA 平板上进行培养 菌落生长完整后 从中筛选出镰刀菌并保存 1 2 1 真菌菌丝培养和 DNA 提取 将分离纯化得到的菌株全都转接到 PDA平板上 在 25 温度不变的条件下培育 3 5 d后 在菌落边缘打 取直径为 5 mm的菌碟 10 15个 放入配制好的 PDB 培养基中 在 28 的条件下振荡培养 再经过多次过滤 离心等操作后可得到尖孢镰刀菌菌丝 将得到的菌丝在 0 4 下冷藏 作为提取真菌 DNA的干组织 采用真 菌 DNA提取试剂盒对真菌 DNA进行提取 1 2 2 PCR 与琼脂糖凝胶电泳分析 对不同专化型的尖孢镰刀菌种群的IGS序列 经 Primer 5设计了一对特异性引物对P1 P2 P1为 5 CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG 3 P2 为 5 GACGGATTTGGCGAACCTACCCT 3 引物由南京金斯 瑞生物科技有限公司合成 通过该引物对 P1 P2对尖孢 镰刀菌 IGS序列进行 PCR扩增 1 3 尖孢镰刀菌专化型对各组杀菌剂的敏感性测定 用菌丝生长速率法测定尖孢镰刀菌对各种杀菌剂的 敏感性 将氟硅唑 吡唑醚菌酯和氰烯菌酯分别溶解在 甲醇中 药剂浓度梯度为 0 1 mg mL 1 0 2 mg mL 1 0 4 mg mL 1 和 0 8 mg mL 1 将尖孢镰刀菌在 28 条件 下恒温培养 3 5 d 挑选生长均匀的菌落 在菌落边缘 打取直径为 5 mm的菌碟 然后将菌碟接种到含有氟硅唑 吡唑醚菌酯和氰烯菌酯不同浓度梯度的 PDA平板上 测 试菌株对药剂的敏感性 25 条件下恒温连续培养 5 d后测量各菌株的菌落 直径 以在不含药剂的平板上生长的菌株为对照 根据 收稿日期 2020 02 26 基金项目 江苏省高等学校自然科学研究面上项目 18KJB210001 作者简介 王文 1997 男 江苏宿迁人 本科 从事园艺学方向 的研究 为通信作者 E mail zztsdta 草莓 辣椒枯萎病菌的分离 鉴定及化学防治 王 文 李若南 单红月 居 娜 孙蜻蜓 胡庄方 郑志天 淮阴工学院生命科学与食品工程学院 江苏淮安 223003 摘 要 由尖孢镰刀菌引起的辣椒枯萎病及草莓枯萎病是为害辣椒和草莓的主要病害之一 为明确淮安地区辣 椒 草莓枯萎病的病原菌种类及防治方法 采集辣椒 草莓根际土壤样品 对其病原菌进行了分离 纯化和鉴 定 结果表明 该病原菌为尖孢镰刀菌辣椒专化型及尖孢镰刀菌草莓专化型 采用菌丝生长速率法对3种杀菌剂 进行筛选 其中氟硅唑抑制作用较好 对尖孢镰刀菌辣椒专化型的EC 50 为0 181 7 0 251 7 g mL 1 对尖孢镰 刀菌草莓专化型的EC 50 为0 076 0 0 212 8 g mL 1 且活体药效实验表明该药剂有效 关键词 辣椒枯萎病 草莓枯萎病 尖孢镰刀菌 氟硅唑 中图分类号 S436 418 S436 68 文献标志码 B DOI 10 19415 ki 1673 890 x 2020 09 068 王 文 李若南 单红月 居 娜 孙蜻蜓 胡庄方 郑志天 草莓 辣椒枯萎病菌的分离 鉴定及化学防治 136 公式 1计算菌丝生长抑制率 每个处理重复 3次 试验 重复 3次 测量菌落直径时选取生长较为均匀的菌落 取平均值 根据药剂浓度的对数 X 与抑制率对应的机 率值 Y 求出各菌株对于 3种药剂的 EC 50 mm mm 100 mm 5 对照菌落 直径 处 理 菌 落直径 抑制率 对照菌落直径 1 1 4 活体药效实验 将尖孢镰刀菌在 28 下恒温连续培养 3 5 d 在 菌落边缘打取直径为 5 mm的菌碟 10 15个 放入配置 好的 PDB培养基中 在 28 条件下恒温振荡培养 5 d 经过离心过滤等操作后可以得到尖刀镰孢菌孢子 将得到的尖刀镰孢菌孢子接种至草莓根部 接种 孢子 2 d后 处理组用各种杀菌剂分别灌根 药剂稀释 1 000倍 每株施用 100 mL 每 2 d灌药 1次 对照组采 用清水灌根 20 d后观察植株的生长发病情况 1 5 数据处理 采用 EXCEL DPS等进行数据处理和做图 2 结果与分析 2 1 草莓枯萎病菌及辣椒枯萎病菌形态学及分子生 物学鉴定 从草莓和辣椒根际土壤中分别分离到 3个菌株 编 号为草莓 0号 3号和 7号 辣椒 0号 3号和 7号 他们的菌落和形态学特征无明显差异 如图 1A所示 平 板培养结果表明 病原菌在 PDA培养基培养 5 d后 菌 落呈红色 外部为白色 气生菌丝为绒状 如图 1B常规 PCR结果显示 特异性引物 P1 P2可 稳定地从 100 pg L 1 的尖孢镰刀菌基因组 DNA模板中 扩增得到一条 1 081 bp左右的条带 而对土壤中病原菌 DNA的检测实验中 能清晰得到特异性条带 长度约为 1 100左右 即可确认实验中分离所到的菌即为尖孢镰刀菌 2 2 不同杀菌剂对草莓和辣椒枯萎病的防治效果 尖孢镰刀菌草莓专化型和辣椒专化型的抑菌作用测 定结果表明 杀菌剂氟硅唑对分离出菌株的抑制效果明 显 在设定浓度范围内 随药剂浓度的增加 抑菌效果 呈明显增强的趋势 由表 1可以看出 杀菌剂氟硅唑对分离出的尖孢 镰刀菌有很好的抑制作用 对尖孢镰刀菌草莓专化型的 EC 50 为 0 076 0 0 212 8 mg L 1 对尖孢镰刀菌辣椒专 化型的 EC 50 为 0 181 7 0 251 7 g mL 1 2 3 尖孢镰刀菌活体药效实验 将尖孢镰刀菌草莓专化型和辣椒专化型孢子分别接 种草莓和辣椒幼苗 20 d后观察幼苗发病症状 结果显示 发病初期叶片稍微卷缩 有些则呈波状 会产生畸形叶茎 老叶呈现紫红色萎蔫 后叶片逐渐变枯黄 最后全株枯死 A为尖孢镰刀菌草莓转化型和辣椒转化型菌落形态 B为尖孢镰刀菌草莓专化型和辣椒专化型IGS序列电泳图 M 为DL2000 marker 图1 草莓枯萎病菌及辣椒枯萎病菌形态学及分子生物学鉴定 表1 杀菌剂氟硅唑对尖孢镰刀菌的EC 50 值和毒力回归方程 菌株 杀菌剂 毒力回归方程 EC 50 g mL 1 草莓0 氟硅唑 Y 0 629 3X 5 705 4 0 075 7 草莓3 氟硅唑 Y 0 832 9X 5 540 8 0 224 2 草莓7 氟硅唑 Y 0 736 7X 5 495 1 0 212 8 辣椒0 氟硅唑 Y 0 933 1X 5 559 1 0 251 7 辣椒3 氟硅唑 Y 0 702 1X 5 520 0 0 181 7 辣椒7 氟硅唑 Y 0 734 0X 5 716 9 0 105 5 EC 50 值为抑制菌丝生长50 时的药剂浓度 王 文 李若南 单红月 居 娜 孙蜻蜓 胡庄方 郑志天 草莓 辣椒枯萎病菌的分离 鉴定及化学防治 137 如图 2A所示 左侧为成活的无病害草莓苗 右侧 为处理组实验 20 d后情况 对照组 CK无明显发病症状 处理组孢子液蘸根并灌清水的草莓苗 20 d后枯萎死亡 处理组孢子液蘸根并经常用氟硅唑水溶液灌根的草莓苗 无发病症状 正常生长 表明氟硅唑对尖孢镰刀菌草莓 专化型具有一定的抑制活性 对于草莓枯萎病的防治有 一定的效果 如图 2B所示 左侧为成活的无病害辣椒苗 右侧 为处理组实验 20 d后的生长情况 对照组 CK无明显发 病症状 处理组孢子液蘸根并灌清水的辣椒苗 20 d后 枯萎死亡 处理组用辣椒 3号和 7号孢子液蘸根并经常 用氟硅唑水溶液灌根的辣椒苗有轻微的发病症状 用辣 椒 0号孢子液蘸根并经常用氟硅唑水溶液灌根的辣椒苗 正常生长 表明氟硅唑对尖孢镰刀菌辣椒专化型具有一定 的活体抑制效果 对于辣椒枯萎病的防治有一定的指导 意义 图2 尖孢镰刀菌活体药效试验 3 结论 草莓和辣椒枯萎病是近年来生产上遇到的较难防治 的土传病害 在我国一些主要种植区普遍发生 为害程 度也逐年加重 尤其是在多年连续种植的重茬地块发病 率更高 病害暴发严重时会直接造成毁园 实验从淮安市农科院温室草莓种植区中找到疑似枯萎 病的植株 从根际土壤中分离出来菌株 确认为草莓枯萎 病的病原菌尖孢镰刀菌 并从中选出致病性强的尖孢镰刀 菌 分别从形态学和分子生物学对其进行了验证 通过菌 丝生长速率法 发现氟硅唑对于引起草莓枯萎病的尖孢 镰刀菌防效良好 EC 50 在 0 076 0 0 212 8 g mL 1 同样对辣椒病样进行取样分离 纯化 药剂防治和活体 药效试验 发现氟硅唑对尖孢镰刀菌辣椒专化型的防效 良好 EC 50 为 0 181 7 0 251 7 g mL 1 参考文献 1 张运涛 张国珍 草莓病虫害概论 2版 M 北京 中 国农业出版社 2012 2 倪玉红 赵秋荣 赵小军 等 温度 降雨量和日照时 数对草莓生长发育及炭疽病发生的影响 J 江苏农业 科学 2014 42 2 133 134 3 赵荷娟 魏启舜 王琳 等 双孢蘑菇菌糠基质对架 式栽培草莓生长和果实品质的影响 J 江苏农业科 学 2014 42 4 120 121 4 赵海涛 李良俊 殷朝珍 等 水生蔬菜轮作对大棚草 莓连作土壤性质的影响 J 江苏农业学报 2014 30 2 289 295 5 吉沐祥 李国平 杨敬辉 等 江苏省大棚草莓生产中 存在的问题与技术创新 J 江西农业学报 2012 24 2 58 60 6 顾春波 史晓斌 姜莉莉 等 草莓枯萎病菌对多菌 灵的抗性及其抗性菌株生物学特性 J 植物保护学 报 2010 37 3 266 271 7 于红梅 赵密珍 王静 等 草莓枯萎病菌的分离 鉴 定及生物学特性 J 江苏农业科学 2013 41 11 124 127 8 杨焕青 王开远 范昆 等 草莓枯萎病菌的生物 学特性及7种杀菌剂对其抑制作用 J 植物保护学 报 2008 35 2 169 174 9 曹海潮 李秀环 王晓坤 等 吡唑醚菌酯及三唑类 杀菌剂对番茄颈腐根腐病的防治效果 J 中国农业科 学 2018 51 21 4065 4075 责任编辑 赵中正