光亮果皮番茄品种选育的分子标记及其应用.pdf

19 中华人民共和国 国家知识产权局 12 发明专利申请 10 申请公布号 43 申请公布日 21 申请号 202010510611 6 22 申请日 2020 06 08 71 申请人 华中农业大 学 地址 430000 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 72 发明人 欧阳波 周玉红 高虎 于会 洋 陈蓉 石春美 卢永恩 叶志彪 74 专利代理机构 武汉蓝宝石专利代理事务所 特殊普通 合 伙 42 242 代理人 严超 51 Int Cl C12Q 1 6895 2018 01 C12N 15 11 2006 01 A01H 1 04 2006 01 54 发明名称 光亮果皮番茄品种选育的分子标记及其应 用 57 摘要 本发明涉及番茄分子标记育种领域 具体涉 及光亮果皮番茄品种选育的分子标记及其应用 本发明利用番茄自发突变体glossy与野生番茄 LA1375构建F2分离群体 利用BSR定位策略及连 锁分析将glossy基因定位在1号染色体600kb范 围内 并获得与之紧密连锁的分子标记GLS 利用 该分子 标记及其引物进行番茄品种选育 为特殊 番茄品种的开发提供了资源 并为果实发育生物 学研究奠定 了 基础 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 111621588 A 2020 09 04 CN 111621588 A 1 光亮果皮番茄品种选育的分子标记 其特征在于 以2 5版本的番茄参考基因组为 准 所述分子标记为位于番茄1号染色体85257792bp处的58bp核苷酸插入片段 该分子标记 的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示 2 检测权利要求1所述分子标记的扩增引物或杂交探针 3 根据权利要求2所述的检测权利要求1所述分子标记的引物 其特征在于 所述引物 的核苷酸序列如下所示 正向引物 TCCTAGACTTCTAGAAATACGTGTGG 如SEQ ID NO 2所示 反向引物 TGGAAAAGAAAGGAGAAAGGATGAC 如SEQ ID NO 3所示 4 权利要求1所述的分子标记获取方法 其特征在于 包括以下步骤 将glossy突变体与番茄野生种质LA1375杂交 获得F1代 F1代自交获得F2 F2果实绿熟时鉴别果实表型 确定glossy是单隐性基因 选取表型分别为野生型和突变型的不同植株的果实 切取果实表皮等量混样 提取 RNA 进行RNA seq 利用BSR基因定位策略进行初定位 将glossy定位于1号染色体4M范围 内 利用glossy和LA1375的重测序数据 设计并筛选多态性标记 分析F2群体中的重组事 件 将目的区段锁定在0 798M范围内 扩大F2群体 进一步开发分子标记 将目的区段锁定在600kb范围内并获得与之紧密连 锁的分子标记GLS 5 权利要求1所述的分子标记在光亮果皮番茄品种选育中的应用 6 如权利要求1所述的分子标记在光亮果皮番茄品种选育中的应用 其特征在于 番茄 育种中所用的供体材料包括glossy突变体 7 一种用于检测权利要求1所述分子标记的试剂盒 8 根据权利要求7所述的用于检测权利要求1所述分子标记的试剂盒 其特征在于 包 括权利要求2所述的引物 9 由权利要求1所述的分子标记筛选到的光亮果皮番茄在制备果干果脯产品中的应 用 权 利 要 求 书 1 1 页 2 CN 111621588 A 光亮果皮番茄品种选育的分子标记及其应用 技术领域 0001 本发明属于番茄育种领域 具体涉及光亮果皮番茄品种选育的分子标记及其应 用 背景技术 0002 番茄表皮即角质膜 它是植物自我保护的第一级屏障 在植物的生长发育中发挥 着重要作用 角质膜是植物与环境的作用界面 它能封闭植物细胞 减少植物遭受生物和非 生物胁迫 如减少气孔蒸腾以外的水分散失 减少病菌侵染和昆虫取食 角质膜也能有效阻 挡机械伤害 角质层里的多糖能影响植物角质的紧密度和坚硬度 进而影响植物外表皮的 张力和致密度 番茄表皮既能影响果实的抗性 耐贮性 也能很大程度上影响果实的感观品 质和风味 特别是影响食用口感 0003 果脯和果干作为传统食品 在现代社会依旧备受青睐 番茄可作为蔬菜和水果 也 可以进一步加工成果脯和果干 常规番茄果脯或果干的加工过程需要经过清洗 烫漂 去 皮 硬化 渗糖 晾晒或烘干等工艺 排除果实内丰富的水分并促进糖分的渗入 但是在去皮 过程中 会造成维生素和番茄红素的流失 0004 基于此 开发一种能够快速选育出果皮嫩薄 易失水 适于制作果干果脯的番茄品 种的分子标记 并将其应用于番茄育种领域 具有重要意义 发明内容 0005 基于此 本发明的目的在于提供一种光亮果皮番茄品种选育的分子标记及该分子 标记在番茄育种中的应用 0006 本发明解决上述技术问题的技术方案如下 0007 本发明提供一种光亮果皮番茄品种选育的分子标记 以2 5版本的番茄参考基因 组为准 所述分子标记为位于番茄1号染色体85257792bp处的58bp的核苷酸插入片段 该分 子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示 0008 本发明的保护范围还涉及到所有能够检测上述分子标记的扩增引物或杂交探针 所有能够检测上述分子标记的引物或探针均能够用于光亮果皮番茄品种的选育 0009 具体地 其中一对分子标记的引物核苷酸序列如下所示 0010 正向引物 TCCTAGACTTCTAGAAATACGTGTGG 如SEQ ID NO 2所示 0011 反向引物 TGGAAAAGAAAGGAGAAAGGATGAC 如SEQ ID NO 3所示 0012 本发明还提供了上述分子标记的获取方法 包括以下步骤 0013 1 突变体的发现以及鉴定 0014 该突变体是番茄品种Alisa Craig在组织培养过程中自发产生的 突变体果实表 现为果皮薄而光亮 食用时化渣性好 入口即化 口感佳 命名为glossy glossy番茄表皮嫩 薄 易散失水份同时外源物质也容易渗透进去 可作为果脯和果干的原料 加工时无需去 皮 可以减少营养物质的流失且能使加工品具有良好的外观形态 另外 其嫩薄的表皮也使 说 明 书 1 5 页 3 CN 111621588 A 得这类番茄鲜食口感较佳且外观鲜亮 具有吸引人购买的有利性状 突变体果实表型如附 图1所示 经遗传研究发现glossy可以稳定遗传 为一个稳定的变异 0015 2 glossy紧密连锁的分子标记开发 0016 利用glossy突变体与番茄野生种质LA1375杂交 获得F1代 F1代自交获得F2 定植 563株F2单株 到番茄果实绿熟时即可准确鉴别果实表型 群体中果实表现为glossy的单 株有138株 利用卡平方检验发现卡平方值为0 8657 小于自由度为1的卡平方临界值 判断该突变符合3 1的分离比 表明glossy受隐性单基因控制 0017 3 基因定位及分子标记开发 0018 在果实绿熟期选择果实表型为野生型和glossy的植株各30株 每株选择一个果 实 切取果实的表皮等量混样 提取RNA 送公司进行RNA seq 计算两个混池中单核苷酸多 态性位点的基因型频率及其差值 通过差值的统计分析获取glossy的大致位置 该定位策 略即为BSR 根据BSR的初定位的结果 将glossy定位于1号染色体末端 0019 利用glossy和LA1375的重测序数据对比番茄参考基因组 提取插入 缺失类型的 变异位点 设计引物并筛选多态性标记 将目的区段锁定在0 798M范围内 扩大F2群体至 2586株 并进一步开发分子标记 将目的区段锁定在600kb范围内并获得与之紧密连锁的分 子标记GLS及其检测引物 所述分子标记GLS的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示 0020 本发明还提供了上述分子标记在光亮果皮番茄品种选育中的应用 其中 在该应 用中所用的供体材料包括glossy突变体 0021 本发明的目的还在于提供一种用于检测上述分子标记的试剂盒 其中 所述试剂 盒包括上述引物 0022 本发明的目的还在于提供上述分子标记筛选到的光亮果皮番茄在制备果干果脯 产品中的应用 0023 本发明利用番茄自发突变体glossy与野生番茄LA1375构建F2分离群体 利用BSR 定位策略和连锁分析将glossy基因定位在1号染色体600kb范围内 并获得与之紧密连锁的 分子标记GLS 利用该分子标记及其检测引物进行番茄育种选育 为特殊番茄品种的开发提 供了资源 并为果实发育生物学研究奠定了基础 0024 在常规育种方法中 光亮果皮或果干果脯番茄品种的选育要等到果实成熟期 浪 费大量的时间和精力 且选择效率低下 而通过检测本发明中与其相关的分子标记 可以在 苗期进行淘汰 不仅节约生产成本而且大大提高选择效率 不受环境影响 可以在早期筛选 出优良单株 减少材料种植规模和育种时间 可应用于 化渣性 好且外表鲜亮的番茄品种 选育 也可用于开发适合番茄果干果脯食品生产的番茄品种 附图说明 0025 图1为glossy突变体与野生型番茄果实表型的比较 其中glossy代表glossy突变 体 WT代表野生型番茄 0026 图2为BSR分析结果 0027 图3为实施例2中GLS分子标记的扩增产物凝胶电泳结果 其中g g表示隐性基因 型 G G表示显性基因型 g G表示杂合基因型 说 明 书 2 5 页 4 CN 111621588 A 具体实施方式 0028 以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述 所举实例只用于解释本 发明 并非用于限定本发明的范围 除非另有定义 本文所使用的所有的技术和科学术语均 属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同 本文中在本发明的说明书中所使 用的术语只是为了描述具体的实施例的目的 不是旨在于限制本发明 0029 供试材料 0030 Glossy突变体为本实验室在Alisa Craig番茄材料的组织培养过程中获得 果实 表现为果皮薄而光亮 食用时化渣性好 入口即化 口感佳 果实容易失去水分 公众可从申 请人处获得 仅可用于重复本发明实验使用 0031 番茄野生种质LA1375从番茄遗传资源中心TGRC获得 表型为果实表皮厚 色泽一 般光亮 0032 实施例1 0033 光亮果皮或果干果脯番茄品种选育的分子标记的开发 具体步骤如下 0034 S1 以glossy为母本 番茄野生种质LA1375为父本 杂交获得F1代 F1代植株自花 授粉得到F2代 0035 S2 于塑料大棚播种并定植563株F2代植株 正常管理 待果实坐果后2 3周基本可 以判断表型 绿熟期表型明显且稳定 每株调查3个以上的果实 glossy突变的果实色泽鲜 亮且触摸时有粘手的感觉 正常果实色泽呈哑光感 触摸光滑 如果3个以上果实全为光亮 且粘手状则判定为glossy表型即为隐性 否则为显性 0036 F2群体中果实表现为glossy的单株有138株 利用卡平方检验发现卡平方值为 0 8657 小于自由度为1的卡平方临界值 判断该突变符合3 1的分离比 表 明glossy为隐性单基因控制 0037 S3 在果实绿熟期选择果实表型为野生型和glossy的植株各30株 每株选择一个 果实 切取果实的表皮等量混样 提取RNA 送公司进行RNA seq 该基因定位策略即为BSR 获得混池RNA seq测序数据后 利用FastQC软件对测序数据进行质量评估 使用 Trimmomatic去除接头 低质量和含N较多的reads 对测序数据进行质量控制 之后 使用 hisat2将各reads比对到2 5版本的番茄参考基因组 获得的比对文件数据利用samtools软 件以及自主开发的Perl脚本提取多态性SNP 计算隐性池的最大等位基因型频率SNP index 以及该SNP在显性池的频率 并且计算每个SNP位点的欧几里得距离 ED值 过滤掉两池测 序深度都低于15个reads 以及SNP index都大于0 7的位点 最后对ED值取幂次方后进行线 性回归拟合并作图 以所有位点幂次方拟合值的中位值及标准差之和的3倍作为阈值线 高 于阈值线的区段作为候选区间 根据BSR的初定位的结果 如图2所示 确定glossy初定位 区间为 Chr 1 84443855至88138301 0038 S4 结合重测序数据 野生醋栗番茄种质LA1375已经重测序 相关序列信息详见 本实验室对glossy突变体已利用HiSeq4000测序平台进行基因 组重测序 利用GATK鉴定两池在候选区段中的多态性SNP和InDel 根据自主开发的程序鉴 定InDel标记并设计检测引物 结合重组单株分析 将目的区间定位在0 798M的范围内 0039 S5 利用glossy LA1375的F2分离群体大群体进一步获得与glossy紧密连锁的分 说 明 书 3 5 页 5 CN 111621588 A 子标记 0040 具体步骤如下 0041 1 扩大glossy LA1375的F2群体至2586株 0042 2 利用开发的3个多态性分子标记 其检测引物的序列分别为 0043 L F CTTATAGTCTTCTAGGTTATTCCTTTGG 0044 L R ACGACCAAGATTGACTTAACCTG 0045 M F ACACTCCAACAGTAGGATTGGTTTG 0046 M R GTGACAAATGCTATTTTGACAGCATAC 0047 R F ACTTGTTGTGCGTGCCTTAATG 0048 R R CACAATTGATCCATGAGTTTATGAGATG 0049 获得每株的基因型 共获得661株目的区段为隐性的单株 0050 3 利用上述661株隐性单株 结合分子标记鉴定 获得7株重要重组单株 经表型 鉴定确定该7个单株的果实均为glossy表型 因此将glossy定位在600kb的范围内并获得与 glossy紧密连锁的分子标记GLS GLS为一个插入 缺失标记 片段大小为58bp 其序列如SEQ ID NO 1所示 0051 4 检测上述分子标记GLS的一对引物序列为 0052 GLS F TCCTAGACTTCTAGAAATACGTGTGG SEQ ID NO 2 0053 GLS R TGGAAAAGAAAGGAGAAAGGATGAC SEQ ID NO 3 0054 上述引物序列在突变体中扩增出的序列如SEQ ID NO 4所示 0055 实施例2 0056 利用实施例1中所得到的分子标记GLS及引物序列对13份由glossy突变体作为供 体材料得到的植株材料进行鉴定 并与其果实表型进行比较 具体步骤如下 0057 1 以番茄相关株系基因组DNA为模板 引物为GLS 北京全式金生物技术有限公司 的Easy Taq聚合酶推荐的反应体系和程序进行扩增 PCR产物用2 的琼脂糖凝胶电泳检 测 0058 其中 上述技术方案中所述的PCR扩增反应体系 按总体积为15 l计 包括如下各 组分 0059 0060 PCR扩增反应条件为 94 0 预变性3min 94 0 变性30s 55 0 复性30s 72 0 说 明 书 4 5 页 6 CN 111621588 A 延伸30s 循环33次 72 0 延伸5min 4 保存 0061 2 结果分析 0062 扩增结果可能会出现如下三种情况 0063 第一种情况 出现一条195bp的条带 表明为纯合显性 表型为正常果实 0064 第二种情况 出现一条253bp的条带 为纯合隐性 表型为光亮果实 0065 第三种情况 同时出现一条195bp的条带和一条253bp的条带 则为杂合 表型为果 实表皮正常 0066 13份植株材料的结果如附图3所示 其中正常果实的为4株 光亮果实的为9株 与 成熟后果实表型一致 0067 以上所述仅为本发明的较佳实施例 并不用以限制本发明 凡在本发明的精神和 原则之内 所作的任何修改 等同替换 改进等 均应包含在本发明的保护范围之内 说 明 书 5 5 页 7 CN 111621588 A 序列表 华中农业大学 光亮果皮番茄品种选育的分子标记及其应用 4 SIPOSequenceListing 1 0 1 58 DNA InDel Tomato 1 aaattatttc atgaatttta taatgtgaga cattaaaatt aatattaatt gtgtgaag 58 2 26 DNA 人工序列 GLS F 2 tcctagactt ctagaaatac gtgtgg 26 3 25 DNA 人工序列 GLS R 3 tggaaaagaa aggagaaagg atgac 25 4 253 DNA 番茄 Tomato 4 tcctagactt ctagaaatac gtgtggataa caattttatg tttaaattaa aattaatatt 60 aattgtgtga agaaaattat ttcatgaatt ttataatgtg agacattaaa attaatatta 120 attgtgtgaa gaaattattt catgaatttt ataatgtgag acccattaca atctaacttc 180 accttcttcc taattctttc tttctttgtt cctttttctt cattttttgt catcctttct 240 cctttctttt cca 253 序 列 表 1 1 页 8 CN 111621588 A 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1 1 页 9 CN 111621588 A