38个茶用菊品种苗期对黑斑病的抗性鉴定.pdf

南京农业大学学报 2021 44 1 68 77 http Journal of Nanjing Agricultural University DOI 10 7685 jnau 202004012 收稿日期 2020 04 07 基金项目 国家重点研发计划项目 2019YFD1001500 中央高校基本科研业务费专项资金 KJQN201812 江苏省自然科学基金项目 BK20170722 江苏省农业自主创新项目 CX 18 2020 作者简介 柳丽娜 硕士研究生 通信作者 管志勇 教授 主要从事花卉种质资源与育种研究 E mail guanzhy 柳丽娜 刘晔 李媛媛 等 38个茶用菊品种苗期对黑斑病的抗性鉴定 J 南京农业大学学报 2021 44 1 68 77 LIU Lina LIU Ye LI Yuanyuan et al Resistance identification to black spot disease of 38 cultivars of chrysanthemum for tea at seedling stage J Journal of Nanjing Agricultural University 2021 44 1 68 77 38个茶用菊品种苗期对黑斑病的抗性鉴定 柳丽娜 刘晔 李媛媛 陈发棣 陈素梅 房伟民 管志勇 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 农业农村部景观设计重点实验室 园艺学院 江苏南京210095 摘要 目的 本研究旨在筛选茶用菊黑斑病抗性品种 用于抗病育种 方法 采用组织块分离法进行黑斑病病原菌分离 纯化 通过显微镜观察进行病原菌分生孢子形态学鉴定 并采用真菌18S rDNA ITS序列进行分子水平鉴定 基于黑斑病菌 致病力检测结果开展38个茶用菊品种苗期黑斑病人工接种鉴定 通过扫描电镜观察叶片表皮毛和气孔结构特征 结果 从黑斑病病株 福白菊 叶片上分离到F16和F20共2个菌株 经鉴定均为交链格孢菌 Alternaria alternata 对茶用 菊叶片的致病力检测显示F16与F20均具有较强致病力且致病力没有显著差异 38个品种的黑斑病抗性鉴定结果显示 有11个抗病品种 占28 95 22个中感品种 占57 89 以及5个感病品种 占13 16 进一步比较典型抗病和感病 品种的叶片结构特征差异发现 抗病品种表皮毛密度普遍大于感病品种 且气孔密度小于感病品种 结论 本研究筛选出 部分茶用菊抗黑斑病品种 发现表皮毛及气孔密度与其抗性相关 首次发现交链格孢菌能够引起菊花黑斑病 关键词 茶用菊 黑斑病 抗性鉴定 表皮毛 气孔 中图分类号 S682 1 文献标志码 A 文章编号 1000 2030 2021 01 0068 10 Resistance identification to black spot disease of 38 cultivars of chrysanthemum for tea at seedling stage LIU Lina LIU Ye LI Yuanyuan CHEN Fadi CHEN Sumei FANG Weimin GUAN Zhiyong State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement Key Laboratory of Landscaping Ministry of Agriculture and Rural Affairs College of Horticulture Nanjing Agricultural University Nanjing 210095 China Abstract Objectives The purpose of this study was to screen resistant cultivars for black spot disease resistance breeding Methods The tissue block separation method was used to separate and purify the pathogens of black spot disease The morphological identification of pathogenic conidia was observed by microscope and then molecular level identification was used to fungal 18S rDNA ITS sequence Based on the identification results of pathogens of black spot disease 38 cultivars chrysanthemum for tea were inoculated and identified The characteristics of leaf epidermal trichomes and stomata structure were observed by scanning electron microscope Results The strains of F16 and F20 were isolated from black spot disease leaves of Fubaiju and both two strains were Alternaria alternata The pathogenicity test showed that both F16 and F20 could cause black spot disease of chrysanthemum for tea and both of them had strong pathogenicity and no significant difference in pathogenicity The identification results of 38 cultivars showed that there were 11 resistant cultivars accounting for 28 95 22 moderately susceptible cultivars accounting for 57 89 and 5 susceptible cultivars accounting for 13 16 By further comparing the differences in leaf structure characteristics of typical resistant and suscep tible cultivars the results showed that the epidermal trichomes density of resistant cultivars was generally greater than susceptible culti vars and the stomatal density was less than that of susceptible cultivars Conclusions This study screened out some resistant cultivars to black spot disease and found that the epidermal trichomes and stomatal density were related to their resistance It was also the first time to find that Altermaria alternata could cause chrysanthemum leaf spot disease Keywords chrysanthemum for tea black spot disease resistance identification epidermal trichomes stomata 菊花 Chrysanthemum morifolium Ramat 起源于中国 栽培历史长达2 500多年 品种多达3 000以 上 1 是我国种植最广泛的一种传统名花 除了观赏栽培外 茶用菊和药用菊的产业规模更大 久饮菊花 茶 能够利血气 使身体轻盈 能耐老而延寿 2 在茶用菊产业化栽培中 各类真菌病害是各产区的普遍 性问题 由链格孢属 Alternaria sp 真菌引起的茶用菊黑斑病严重制约其规模化生产 且在高温高湿环 第1期柳丽娜 等 38个茶用菊品种苗期对黑斑病的抗性鉴定 境条件下破坏性更强 被感染的菊花在发病初期叶片上会零星分散着面积较小 呈褐色的坏死斑点 发展 后病斑逐渐扩大 形成圆形 椭圆形和不规则形的黑褐色病斑 在高温 高湿条件下 病斑上会着生稀疏的 灰白色霉层 通常数个病斑连片汇合 叶肉组织完全坏死 进而导致花形扭曲 花朵衰败甚至整株枯萎和死 亡 严重影响茶用菊的食品安全与商业价值 3 喷施农药进行防治 农药残留会对人的身体健康造成威 胁 也会造成病原抗药性问题 还会污染生态环境并阻碍绿色与环境友好型农业的可持续性发展 4 采用抗病品种进行生产是防治植物病害最经济的方法 而抗病性鉴定和抗病种质资源的筛选是抗病 育种工作的基础 也是抗性生理和遗传研究的前提 目前已有多种蔬菜 果树针对链格孢属真菌引起的叶 斑病的抗病性鉴定报道 5 6 许高娟 7 对33种菊花近缘种属植物苗期黑斑病抗性进行了鉴定 目前 还 未见针对批量茶用菊种质资源抗病性鉴定方面的报道 抗病茶用菊种质资源的发掘对推动茶用菊抗病品 种选育具有重要意义 不同茶用菊品种的抗性鉴定是获得典型抗病材料的基础 在苗期进行人工接种鉴 定是筛选茶用菊抗病品种经济有效的方法 且具有操作简单 结果可靠 周期短等优点 为抗性品种筛选的 常用方法 8 植物的防御抵抗机制主要包括物理结构抗性和化学物质抗性 其中 物理结构抗性是植物利用自身的 结构屏障 例如表皮毛 气孔 角质层和细胞壁等阻挡病原物入侵及扩散 9 对于植物而言 表皮毛是植 物与病原菌最初接触的地方 也是植物识别外来威胁并进行防御的起点 10 气孔是病原菌入侵最直接的 通道 其密度 大小 开闭程度等也会影响病原菌能否成功入侵 11 本研究基于38个茶用菊品种的抗性 鉴定结果对不同抗 感茶用菊品种叶片的表皮毛与气孔密度进行分析 探讨其对黑斑病的防御机制 为茶 用菊抗黑斑病机制解析提供一定的理论依据 1 材料与方法 1 1 试验材料 病原菌分离自茶用菊品种 福白菊 采自湖北省麻城市福田河镇纯阳山 福白菊 生产基地 供试的 38个茶用菊品种来自南京农业大学中国菊花种质资源保存中心 详见表1 表1 供试的38个茶用菊品种 Table 1 38 cultivars of chrysanthemum for tea of test 编号Code品种Cultivar编号Code品种Cultivar编号Code品种Cultivar 1杭白菊Hangbaiju 14金丝黄菊Jinsihuangju 27苏菊6号Suju 6 2福白菊Fubaiju 15皇菊Huangju 28苏菊7号Suju 7 3射阳红心菊Sheyanghongxinju 16大洋菊Dayangju 29苏菊8号Suju 8 4射阳大白菊Sheyangdabaiju 17金菊1号Jinju 1 30苏菊9号Suju 9 5滁菊Chuju 18金菊3号Jinju 3 31苏菊10号Suju 10 6七月白Qiyuebai 19亳菊Boju 32苏菊11号Suju 11 7九月菊Jiuyueju 20迟黄Chihuang 33苏菊12号Suju 12 8黄香梨Huangxiangli 21晚贡菊Wangongju 34苏菊13号Suju 13 9白小香菊Baixiaoxiangju 22黄山贡菊Huangshangongju 35苏菊14号Suju 14 10黄小香菊Huangxiaoxiangju 23白金菊Baijinju 36苏菊15号Suju 15 11小黄菊Xiaohuangju 24川百菊Chuanbaiju 37休宁贡菊Xiuninggongju 12河北香菊Hebeixiangju 25满天星Mantianxing 38休宁药菊Xiuningyaoju 13桐乡小黄菊Tongxiangxiaohuangju 26黄山黄菊Huangshanhuangju 1 2 病原菌分离 鉴定与致病力检测 1 2 1 病原菌分离 纯化及保存 采用组织块分离法分离病原菌 取 福白菊 病叶 经自来水冲洗干净 再用无菌蒸馏水冲洗5 min 此后的操作均在超净工作台中进行 将病叶置于盛有70 体积分数 乙醇 的容器中消毒30 s 再置于15 的H2O2中消毒15 min 重复消毒3次 最后用无菌蒸馏水冲洗干净 灭菌 滤纸吸干叶片表面水分 12 用组培刀将病斑部位分解成面积约为0 25 cm2的组织块 将叶片组织块接 种在马铃薯葡萄糖琼脂 PDA 培养基上 25 条件下暗培养3 d 当培养的组织块周围长出肉眼可见的菌 落时 用灭菌打孔器从单个菌落边缘取出菌饼转接到新的PDA培养基上 当菌落长出黄褐色霉层时 说明 已经产生孢子 可在超净工作台内挑取少量孢子 制作切片 在光学显微镜下观察并挑取单孢纯化培养 采用冷冻保存法 用灭菌打孔器沿纯化菌落边缘切取直径约为5 mm的菌块3块 置于装有800 L马铃薯 葡萄糖水 PDB 液体培养基和800 L 30 甘油的2 mL灭菌离心管中 80 冰箱中存储备用 96 南 京 农 业 大 学 学 报第44卷 1 2 2 菌株形态与分子生物学鉴定 形态鉴定 将在PDA培养基上活化分离到的菌株置于25 培养箱 中黑暗培养7 d 观察菌落形状 颜色等外观特征 再用无菌水冲洗菌落表面富集分生孢子 制作切片 并在 显微镜下观察分生孢子的形态特征 根据张天宇 13 和Lawrence等 14 的方法对链格孢菌的特征进行鉴定 分子生物学鉴定 采用真菌DNA提取试剂盒 OMEGA生物科技公司 提取所得菌株DNA 利用PCR技术 对病原菌核糖体内转录间隔区18S rDNA ITS序列进行扩增 扩增采用的引物序列为 ITS1 F 5 CTTGGT CATTTAGAGGAAGTAA 3 ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 15 由上海捷瑞生物工程有限公司合 成 PCR反应程序 94 5 min 94 30 s 56 30 s 72 30 s 35个循环 72 5 min 通过20 g L 1 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物目的片段长度是否正确 最后将PCR产物送通用生物有限公司进行测序 测序结果在NCBI官网进行BLAST序列比对 并采用MEGA 5 10软件构建系统进化树 16 1 2 3 致病力检测 采用离体菌块贴接法 采集健康新鲜的 滁菊 叶片 先用自来水冲洗掉表面的灰 尘 再浸入70 的乙醇中消毒30 s 待乙醇挥发后在叶柄上包1层无菌脱脂棉以保证100 的相对湿度 然 后置入铺有1层无菌脱脂棉和2层湿润滤纸的培养皿中 用直径5 mm的灭菌打孔器在PDA平板上生长 7 d的菌落边缘打孔 将制备好的菌饼接种在叶面固定位置 同时将等量的无菌PDA培养基圆饼贴放在健 康叶片相同部位作为对照 将培养皿密封并放入25 培养箱中进行黑暗培养48 h 然后置于光照 黑暗 时间为16 h 8 h的条件下培养 分别于接种后3 6 9 12 d观察叶片的发病情况 采用十字交叉法 17 统 计不同接种时期叶片病斑直径 1 3 茶用菊黑斑病苗期抗性鉴定 1 3 1 植物材料培养 将生长状态一致的38个茶用菊品种的扦插生根苗栽植到草炭和珍珠岩质量比为 3 1的混合基质中 缓苗后正常水肥管理 保证基质不缺水 每周施用稀释液体平衡肥 在光照 黑暗时间 为16 h 8 h的光周期下生长 昼 夜温度分别设置为25 22 相对湿度保持在68 75 培养10 d 后 每个品种选取健壮且长势一致的盆栽幼苗30株 将幼苗随机分成2组 每组15株 1组用于接种 1组 用作对照 1 3 2 菌丝悬浮液制备与接种 取培养7 d的交链格孢菌株 用灭菌打孔器沿PDA培养基菌落边缘打取 直径约5 mm左右的菌饼10 15块 放入装有40 60 mL PDB液体培养基的100 mL三角瓶 在25 摇床 上200 r min 1培养24 h 取3个培养好的菌球 尽量保证菌球大小一致 于2 mL离心管中 加入灭菌小 钢珠后上磨样机研磨 将研磨好的菌丝匀浆加入装有200 mL PDB液体培养基的三角瓶 在25 摇床上 200 r min 1培养48 h 吸取2 mL摇匀的菌丝悬浮液于直径6 cm的一次性无菌培养皿中 用灭菌毛笔挑 出菌丝涂抹于供试菊花第2或第3片真叶背面 接种后给叶片套上自封袋 注意叶片背部不要与袋子接 触 对照组用PDB液体培养基涂抹并套袋 将菊花置于培养箱中培养 培养条件设置为 温度25 湿 度80 黑暗条件培养48 h 1 3 3 病情调查与统计 在接种后48 h进行病情调查与统计 参照许高娟 7 的分级标准加以改进 将 病情分为4级 0级 叶片健康 无病害 1级 病斑面积占叶片面积比例小于25 2级 病斑面积占叶片 面积比例为25 50 3级 病斑面积占叶片面积比例大于50 按照该标准调查发病情况 统计每级 病株数 计算每个品种发病率与病情指数 DSI 其计算公式如下 发病率 病株数 处理总株数 100 DSI 病害级别 该级病株数 最高病害级别 调查总株数 100 根据病情指数划分抗病评价等级 免疫 I DSI 0 抗病 R 0 DSI 25 00 中感 MS 25 00 DSI 50 00 感病 S DSI 50 00 1 4 扫描电镜观察表皮毛与气孔 取抗病和感病品种 抗病品种 苏菊6号 苏菊8号 滁菊 感病品种 苏菊7号 七月白 大 洋菊 植株顶端以下第2或第3片完全展开的新鲜叶片 在叶脉主脉两侧距离相同部位剪取面积约0 5 cm2的小叶块 下表皮朝上 用2 5 戊二醛溶液进行抽真空固定 固定后立即转移至4 冰箱保存 将 样品送至武汉赛维尔生物科技有限公司进行扫描电子显微镜 SU8100 HITACHI 观察 拍照 每个小叶 块观察4 6个视野 每个品种观察3个小叶块 07 第1期柳丽娜 等 38个茶用菊品种苗期对黑斑病的抗性鉴定 2 结果与分析 2 1 茶用菊黑斑病菌的分离与鉴定 从 福白菊 病叶 图1 a 上分离纯化得到2个黑斑病致病菌株 编号为F16与F20 2个菌株在 PDA培养基上的菌落均为圆形 分别呈黄褐色及黄棕色 表面生长着厚厚的茸毛状气生菌丝 菌株F16 菌落边缘没有F20平滑 且F16正 背面颜色较均一 仅菌落边缘颜色较浅 图1 b F20正面颜色较F16 偏灰 背面颜色从外向内由浅变深 且呈现轮纹状 图1 c 2个菌株分生孢子均为褐色或者浅褐色 大 多呈倒棍棒状或倒梨形 少数呈卵形或者近似椭圆形 大小为 24 5 42 5 m 9 5 13 5 m 喙或假 喙呈短圆柱状 长2 9 9 8 m 具有2 6个横的隔膜 偶尔可见1 4个纵 或斜 的隔膜 分隔处有缢缩 图1 d 根据F16和F20菌落形态与分生孢子特征并参照前人的研究结果 13 14 可初步判定其为交链 格孢菌 Alternaria alternata Fr Keissl 图1 茶用菊黑斑病病叶与致病菌株 Fig 1 Disease leaves and pathogens of Alternaria alternata in chrysanthemum for tea a 福白菊 黑斑病病叶 b 菌株F16形态 上 正面 下 背面 c 菌株F20形态 上 正面 下 背面 d 20倍 上 与40倍 下 显微镜下分生孢子形态 a Black spot disease leaves of Fubaiju b Morphology of strain F16 above front below back c Morphology of strain F20 above front below back d Conidiophores morphology under 20 times above and 40 times below microscope 图2 茶用菊黑斑病病原菌分子鉴定 Fig 2 Molecular identification of the pathogen of black spot disease in chrysanthemum for tea a 18S rDNA ITS目的基因PCR检测 b 基于18S rDNA ITS目的基因序列以邻接法构建系统发育树 a 18S rDNA ITS target gene PCR test results b Phylogenetic tree constructed based on 18S rDNA ITS target gene sequences by Neighbor joining method 为了进一步确定F16与F20在链格孢属中的分类地位 提取2个菌株的DNA 应用真菌18S rDNA ITS 序列对其进行分子水平鉴定 测序结果提交至NCBI http www ncbi nlm nih gov 官网进行BLAST比对 结果显示F16和F20与NCBI数据库中记载的交链格孢菌 Alternaria alternata 登录号 KT280010 1 相 似度达99 以上 且在系统发育树上聚为一支 图2 结合形态特征 确定F16与F20均为交链格孢菌 17 南 京 农 业 大 学 学 报第44卷 2 2 病原菌致病力检测 分别用F16和F20的菌饼接种 滁菊 离体叶片3 d时均出现明显的发病症状 随着接种时间推移病 斑面积逐渐扩展 颜色为黑褐色 并在外围出现浅黄色的晕圈 图3 病斑直径统计结果 图4 显示 随 接种时间延长病斑直径增加 表明菌株F16和F20均有较强致病力 除了接种后6 d 其他接种时间F16与 F20的病斑直径均无显著性差异 根据柯赫氏法则从发病的 滁菊 叶片上再次分离 纯化病原菌F16与 F20 其菌落形态 分生孢子形态与首次分离出的病原菌一致 说明原接种菌株确为致病菌 图3 茶用菊叶片接种后不同时间的发病症状 Fig 3 Symptoms at different time post inoculation on vitro leaves of chrysanthemum for tea 图4 滁菊 叶片病斑直径 Fig 4 The lesion diameter of Chuju leaves 不同字母表示同一接种时间不同菌株处理下差异显著 P 0 05 Different letters indicate significant difference at 0 05 level at the same inoculation time under different strains treatment 2 3 茶用菊黑斑病的抗性鉴定 通过叶背涂抹菌丝接种法对38个茶用菊品种进行 了2次苗期黑斑病抗性鉴定试验 根据病情指数可将38 个品种划分成抗病 R 中感 MS 和感病 S 3个类别 表2 图5 其中 有11个品种 占28 95 表现为抗 病 病情指数从小到大排名前5位的是 苏菊6号 苏 菊10号 河北香菊 苏菊15号 和 满天星 22个品 种 占57 89 表现为中感 代表品种为 苏菊9号 杭 白菊 射阳红心菊 5个感病品种 占13 16 为 黄山 贡菊 苏菊13号 大洋菊 川百菊 和 休宁药菊 其病情指数分别为53 33 56 67 56 67 60 65和75 56 用SPSS 19 0软件对2次抗性鉴定的病情指数 DSI 进行相关性分析 结果显示2次试验的DSI相关系 数为0 860 极显著相关 27 第1期柳丽娜 等 38个茶用菊品种苗期对黑斑病的抗性鉴定 图5 接种48 h后不同抗性品种的发病症状 标尺 1 0 cm Fig 5 Disease symptoms of different resistance cultivars after inoculation for 48 h bar 1 0 cm 表2 38个茶用菊品种对黑斑病的抗性鉴定结果 Table 2 Resistance identification results of 38 cultivars of chrysanthemum for tea to black spot disease 编号 Code 第1次试验The first experiment 发病率 Incidence病情指数Disease index 第2次试验The second experiment 发病率 Incidence病情指数Disease index 平均病情指数 Average disease index 抗病类型 Resistance type 27 33 33 11 11 26 67 8 89 10 00 R 31 60 00 13 33 40 00 15 56 14 45 R 12 46 67 15 56 66 67 13 33 14 45 R 36 46 67 13 33 53 33 17 78 15 56 R 25 40 00 15 56 60 00 15 56 15 56 R 7 46 67 15 56 66 67 22 22 18 89 R 5 66 67 22 22 80 00 17 78 20 00 R 19 73 33 17 78 53 33 22 22 20 00 R 29 66 67 24 44 46 67 20 00 22 22 R 10 46 67 20 00 53 33 24 44 22 22 R 23 60 00 20 00 66 67 26 67 23 34 R 30 93 33 24 44 73 33 28 89 26 67 MS 33 73 33 26 67 80 00 28 89 27 78 MS 17 60 00 26 67 80 00 28 89 27 78 MS 32 73 33 26 67 73 33 28 89 27 78 MS 14 73 33 26 67 66 67 35 56 31 12 MS 11 53 33 28 89 53 33 33 33 31 11 MS 37 86 67 33 33 80 00 33 33 33 33 MS 1 73 33 35 56 66 67 28 89 32 23 MS 35 80 00 37 78 73 33 28 89 33 34 MS 13 66 67 31 11 73 33 37 78 34 45 MS 15 93 33 37 78 80 00 31 11 34 45 MS 8 86 67 40 00 100 00 37 78 38 89 MS 2 86 67 44 44 66 67 35 56 40 00 MS 26 93 33 48 89 80 00 33 33 41 11 MS 20 60 00 46 67 66 67 35 56 41 12 MS 9 100 00 44 44 80 00 44 44 44 44 MS 6 100 00 40 00 80 00 48 89 44 45 MS 4 86 67 42 22 93 33 51 11 46 67 MS 21 100 00 51 11 80 00 42 22 46 67 MS 3 86 67 55 56 80 00 37 78 46 67 MS 28 100 00 51 11 93 33 44 44 47 78 MS 18 73 33 57 78 73 33 40 00 48 89 MS 22 53 33 42 22 66 67 64 44 53 33 S 34 86 67 57 78 93 33 55 56 56 67 S 16 100 00 62 22 86 67 51 11 56 67 S 24 80 00 56 86 100 00 64 44 60 65 S 38 100 00 77 78 100 00 73 33 75 56 S 注 R 抗病Resistant MS 中感Moderately susceptible S 感病Susceptible 下同 The same as follows 37 南 京 农 业 大 学 学 报第44卷 2 4 抗 感品种表皮毛与气孔特征差异 2 4 1 叶片表皮毛差异 基于抗性鉴定结果 选取3个抗病品种 苏菊6号 苏菊8号 滁菊 及3个感 病品种 苏菊7号 大洋菊 七月白 进行扫描电镜观察 观察与统计结果显示 抗病品种和感病品种 的叶片下表皮表皮毛形态没有明显差异 但密度存在显著差异 表3 图6 图7 且在3个抗病品种中 表 皮毛密度与病情指数呈负相关 即表皮毛密度越大 病情指数越小 感病品种中除了 大洋菊 苏菊 7号 与 七月白 的表皮毛密度与病情指数也呈负相关 在6个品种中 抗病品种 苏菊6号 的表皮毛 密度最大 为32 75 mm 2 感病品种 苏菊7号 表皮毛密度最小 为12 96 mm 2 表3 6个茶用菊品种叶片下表皮表皮毛与气孔密度统计 Table 3 Statistics of leaf lower epidermal trichome and stomatal density of 6 chrysanthemum for tea cultivars 品种Cultivar病情指数Disease index表皮毛密度 mm 2 Epidermal trichome density气孔密度 mm 2 Stomata density 苏菊6号Suju 6 10 00 32 75 4 59a 93 02 9 86d 苏菊8号Suju 8 22 22 26 34 2 29b 96 35 8 66d 滁菊Chuju 20 00 31 08 5 38a 130 68 4 54bc 苏菊7号Suju 7 47 78 12 96 1 89d 132 89 8 66b 大洋菊Dayangju 56 67 23 24 1 61b 238 73 7 53a 七月白Qiyuebai 44 45 18 39 1 56c 121 97 9 54c 注 不同字母表示不同品种间差异显著 P 0 05 Note Different letters indicate significant differences at 0 05 level between different cultivars 图6 3个抗病品种叶片下表皮表皮毛的整体与局部 Fig 6 The overall and partial of leaf lower epidermal trichomes of 3 resistant cultivars 图7 3个感病品种叶片下表皮表皮毛整体与局部 Fig 7 The overall and partial of leaf lower epidermal trichomes of 3 susceptible cultivars 2 4 2 叶片气孔差异 在6个试验品种中 气孔形态基本一致 气孔密度最小的是抗病品种 苏菊6号 密度为93 02 mm 2 而气孔密度最大的是感病品种 大洋菊 密度为238 73 mm 2 苏菊6号 病情指数 47 第1期柳丽娜 等 38个茶用菊品种苗期对黑斑病的抗性鉴定 最小 大洋菊 病情指数最大 表3 图8 但抗病品种 滁菊 的气孔密度与感病品种 苏菊7号 和 七 月白 之间没有显著性差异 表明气孔密度可能与 滁菊 的抗病性相关性不大 结合叶片表皮毛的分析 可知 抗病品种较感病品种具有更为密集的表皮毛和更为稀疏的气孔 表明叶片表皮毛密度及气孔密度 可能与茶用菊品种对黑斑病的抗性有一定的相关性 图8 6个茶用菊品种气孔整体形态 Fig 8 Stomata overall morphology of 6 chrysanthemum for tea cultivars a c 抗病品种 苏菊6号 苏菊8号 滁菊 d f 感病品种 苏菊7号 大洋菊 七月白 a c Disease resistant cultivars Suju 6 Suju 8 Chuju d f Disease susceptible cultivars Suju 7 Dayangju Qiyuebai 3 讨论与结论 3 1 茶用菊黑斑病菌分离与鉴定 形态学鉴定是真菌分类鉴定中应用最早且直观的方法 在半知菌群体中 链格孢菌属级特征明显 形 态学分类主要依据分生孢子的形状 大小 表面纹饰 着生方式 喙的特征 并辅助以菌丝 菌落 次生代谢 产物等特征 18 链格孢属真菌的培养特性 孢子及菌落特征 易受环境条件 光 温度和湿度等 和培养 条件 培养基质等 的影响而发生变异 影响种级鉴定的准确性 目前已经在鸭梨 19 茶树 20 莴笋 21 及 高粱 22 等物种上通过rDNA ITS序列进行了链格孢叶斑病的病原鉴定 Loganathan等 23 从番茄早疫病病 株上分离纯化了17种链格孢属真菌 通过形态观察结合rDNA ITS序列鉴定 确定有12个菌株与 A alternata JX993756 同源 5个菌株与A solani JF796068 同源 金程凡 24 对分离自油菜的黑斑病菌 FY73QF QI进行了rDNA ITS序列鉴定 系统进化分析显示其与Alternaria brassicae JN108907 1 聚为同一 支 本研究基于病原菌rDNA ITS段片长度适中 高等真菌小于1 000 bp 具保守性且在属种水平上具有 特异性的特点 鉴定 福白菊 黑斑病病原菌为交链格孢菌 A alternata 这是首次发现交链格孢菌能够引 起菊花黑斑病 与许高娟 7 分离鉴定的地被菊黑斑病病原菌极细链格孢菌 A tenuissima 不同 3 2 茶用菊对黑斑病的抗性鉴定 目前已报道的植物黑斑病抗性鉴定方法有 菌块贴接法 菌丝液涂抹法 孢子悬浮液喷雾法 陈出 新 25 在梨品种资源黑斑病抗性鉴定和抗病种质资源筛选时 将病菌饼接种于刺破的离体叶片和果皮上 最终从叶片与果皮2个角度筛选出不同比例的抗 感品种 刘东等 26 采用孢子悬浮液喷雾接种法 对50 份黄瓜种质资源进行了苗期黑斑病抗性鉴定 筛选出3份高抗材料 本研究采用人工涂抹菌丝接种法进 行抗性鉴定 相比于孢子悬浮液喷雾接种法 缩小了接种范围 固定了接种菌丝量 套袋控制了发病条件并 且对特定叶位叶片接种 避免喷雾不均匀 孢子萌发条件不好控制 易受外界环境影响 统计工作量大等 缺点 3 3 叶片表皮毛及气孔与抗性相关 作为植物最外层的天然屏障 表皮毛对植物起着重要的保护作用 本研究结果表明 抗病茶用菊品种 表皮毛密度普遍大于感病品种 推测浓密的表皮毛是菌丝接触浸染部位的物理阻隔 使其无法产生附着结 构 从而延缓菌丝入侵 这与翟艳霞等 27 和李淼等 28 的研究结果一致 但也有研究指出 拟南芥表皮毛 57 南 京 农 业 大 学 学 报第44卷 有利于真菌孢子和菌丝的吸附 在一定程度上增加了感病性 29 还有研究表明 大豆灰斑病抗 感品种叶 片的茸毛密度并没有差异 30 综上所述 表皮毛与植物抗病性相关 但在不同物种中存在差异 可能与物 种自身结构特征 病原菌种类及主要入侵方式有关 气孔也是病原菌入侵植物获取营养的重要通道 本研究结果显示 茶用菊典型抗病品种叶片下表皮 气孔密度显著小