持续多代芽变选种及其与杂交育种联合对苹果红色性状持续改良的方法 [发明].pdf

19 中华人民共和国 国家知识产权局 12 发明专利申请 10 申请公布号 43 申请公布日 21 申请号 201710092300 0 22 申请日 2017 02 21 83 生物保藏信息 CGMCC NO 13783 2017 02 17 CGMCC NO 12468 2016 12 08 71 申请人 山东农业大 学 地址 271018 山东省泰安市岱宗大街61号 72 发明人 陈学森 姜 生辉 毛志泉 姜远茂 王志刚 张宗营 王楠 徐海峰 王意 程 74 专利代理机构 北京 纪凯知识产权代理有限 公司 1 1245 代理人 关畅 何叶喧 51 Int Cl A01H 1 02 2006 01 A01H 1 04 2006 01 A01G 17 00 2006 01 54 发明名称 持续多代芽变选种及其与杂交育种联合对 苹果红色 性状持续改良的方法 57 摘要 本发明公开了一种持续多代芽变选种及其 与杂交育种联合对苹果红色性状持续改良的方 法 本发明提供的方法包括如下步骤 将苹果品 种C0进行 持续多代的芽变选种 第一代芽变选种 将苹果品种CO作为出发 品种 以后的每代芽变选 种均将上一代芽变选种得到的品种作为出发品 种 每代芽变选种从满足如下性状的芽发育出的 枝条或植株中选择目标品种 a 发生红色芽变 b 芽发育 成的枝条或植株 上生长的苹果的果 皮 的花青苷含量为出 发 品种的2倍以上 c 芽发育 成的枝条或植株 上生长的苹果的果皮的特异DNA 分子的甲基化水平为出发品种的二分之一以下 本发明对苹果红色性状的持续改良具有重要意 义 权利要求书2页 说明书12页 序列表1页 附图4页 CN 106613921 A 2017 05 10 CN 106613921 A 1 一种苹果育种方法 包括如下步骤 将苹果品种C0进行持续多代的芽变选种 第一代 芽变选种将苹果品种CO作为出发品种 以后的每代芽变选种均将上一代芽变选种得到的品 种作为出发品种 每代芽变选种从全满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株中选择目 标品种 a 发生红色芽变 b 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量 为出发品种的2倍以上 c 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的 甲基化水平为出发品种的二分之一以下 所述特异DNA分子为如下 或 或 序列表的序列1所示的DNA分子 将序列表的序列1所示的DNA分子进行一个或几个核苷酸的插入和 或缺失和 或 替换得到的DNA分子 与序列表的序列1所示的DNA分子具有90 以上同源性的DNA分子 2 如权利要求1所述的苹果育种方法 其特征在于 所述育种方法得到的苹果品种满足 如下指标 a 和 或 b a 着色速度大于苹果品种C0 b 着色指数大于苹果品种C0 3 一种苹果育种方法 包括如下步骤 将苹果品种C0进行持续多代的芽变选种 第一代 芽变选种将苹果品种CO作为出发品种 以后的每代芽变选种均将上一代芽变选种得到的品 种作为出发品种 每代芽变选种从全满足如下四个性状的芽发育出的枝条或植株中选择目 标品种 a 发生红色芽变 b 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量 为出发品种的2倍以上 c 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的 甲基化水平为出发品种的二分之一以下 d 芽发育成的枝条或植株上生长枝条的节间长 度为2cm以下 所述特异DNA分子为如下 或 或 序列表的序列1所示的DNA分子 将序列表的序列1所示的DNA分子进行一个或几个核苷酸的插入和 或缺失和 或 替换得到的DNA分子 与序列表的序列1所示的DNA分子具有90 以上同源性的DNA分子 4 如权利要求3所述的苹果育种方法 其特征在于 所述育种方法得到的苹果品种满足 如下指标 a 和 或 b 和 或 c a 着色速度大于苹果品种C0 b 着色指数大于苹果品种 C0 c 枝条的节间长度为2cm以下 5 一种苹果育种方法 包括如下步骤 1 将苹果品种A和苹果品种B进行杂交 获得杂交种子 所述苹果品种A为苹果 Malus domestica CSR6R6 666 苹果 Malus domestica CSR6R6 666 其保藏编号为CGMCC NO 13783 所述苹果品种B为权利要求1至4中任一所述方法得到的苹果品种 2 将步骤 1 得到的杂交种子播种并育苗 得到实生苗 3 将步骤 2 得到的实生苗移栽至大田 待其长出果实后不对果实进行套袋 筛选得 到目的植株 6 如权利要求5所述的方法 其特征在于 移栽第4年 在离地面20cm处对实生苗的主干 进行环剥 环剥宽度为0 5 1 0cm 深达木质部 7 如权利要求5或6所述的方法 其特征在于 移栽第5年 在实生苗的盛花期进行如下 操作 每个花序的5朵花仅保留中心花 其他全部疏除 权 利 要 求 书 1 2 页 2 CN 106613921 A 8 如权利要求5或6或7所述的方法 其特征在于 所述目的植株为果肉全红的植株 9 如权利要求5或6或7所述的方法 其特征在于 所述目的植株为满足如下 f1 和 或 f2 和 或 f3 和 或 f4 的苹果植株 f1 果肉全红 f2 果肉高类黄酮含量 f3 果肉高 花青苷含量 f4 果肉高抗氧化能力 10 苹果 Malus domestica CSR6R6 666在苹果育种中的应用 苹果 Malus domestica CSR6R6 666 其保藏编号为CGMCC NO 13783 权 利 要 求 书 2 2 页 3 CN 106613921 A 持续多代芽变选种及其与杂交育种联合对苹果红色性状持续 改良的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种持续多代芽变选种及其与杂交育种联合对苹果红色性状持续改 良的方法 背景技术 0002 医食同源 是发展方向 吃营养 吃健康 已成为人们的共识 苹果果实含有较多 的人体容易吸收的游离多酚或类黄酮 在抗氧化 预防心脑血管疾病及抗肿瘤等方面均具 有较好的作用 一天一苹果 医生远离我 世界上相当多的国家都将苹果作为主要消费果 品而大力推荐 苹果果实的红皮和红肉性状主要由花青苷发育而来 是类黄酮的主要组分 为此 进一步选育花青苷 或类黄酮 含量高 外观品质好 保健价值大的苹果新品种 对推 动苹果产业发展 改进人类健康具有重要意义 0003 果肉红色 类黄酮含量高的功能型苹果育种是多个品质性状 基因 的有效集成与 平衡 为完善新品种选育方案 提高育种效率 课题组采取了三项措施 一是在新疆红肉苹 果与苹果品种杂种一代果实总酚含量等性状遗传变异研究的基础上 提出并实施了 三选 两早一促 的苹果育种法 专利号ZL 2013 1 0205419 6 育种效率显著提高 二是利用遗 传背景复杂的 嘎啦 美国八号 寒富 及 富士 等苹果品种与新疆红肉苹果 M sieversii f niedzwetzkyana 进行多亲本杂交与反复回交 旨在进行品质育种 目前 已构建回交一 二代分离群体40个 定植杂种实生苗4万株 并申报了 果树多种源品质育种 法 专利申请号2015 10428448 8 及 易着色苹果品种培育法 专利申请号 201510890141 X 2个育种技术发明专利 三是及时地以性状基本稳定的后代株系为试材 进行品质性状评价及发育机理的研究 并已取得了诸多重要进展 目前 已创建了常规杂交 与生物技术有机结合的苹果高效育种技术体系 创制了一批新品种及优异种质 研发了苹 果新品种配套高效栽培技术体系 授权和申报发明专利10余项 育成新品种 系 16个 发表 相关研究论文120篇 其中SCI论文20余篇 这些研究成果总体处在国际同类研究的领先水 平 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种持续多代芽变选种及其与杂交育种联合对苹果红色性 状持续改良的方法 0005 本发明首先保护一种苹果育种方法 方法甲 包括如下步骤 将苹果品种C0进行 持续多代的芽变选种 第一代芽变选种将苹果品种CO作为出发品种 以后的每代芽变选种 均将上一代芽变选种得到的品种作为出发品种 每代芽变选种从全满足如下三个性状的芽 发育出的枝条或植株中选择目标品种 a 发生红色芽变 b 芽发育成的枝条或植株上生 长的苹果的果皮的花青苷含量为出发品种的2倍以上 c 芽发育成的枝条或植株上生长的 苹果的果皮的特异DNA分子的甲基化水平为出发品种的二分之一以下 说 明 书 1 12 页 4 CN 106613921 A 0006 所述特异DNA分子为如下 或 或 0007 序列表的序列1所示的DNA分子 0008 将序列表的序列1所示的DNA分子进行一个或几个核苷酸的插入和 或缺失 和 或替换得到的DNA分子 0009 与序列表的序列1所示的DNA分子具有90 以上同源性的DNA分子 0010 所述多代为2代以上 可为 3代 4代 5代 6代等 0011 所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标 d1 和 或 d2 d1 着色速度大于 苹果品种C0 d2 着色指数大于苹果品种C0 0012 所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标 d3 和 或 d4 d3 着色速度为 除 袋之后5天以内着色 d4 着色指数为80 以上 0013 所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标 d5 和 或 d6 d5 着色速度为 除 袋之后4天以内着色 d6 成熟果实表皮80 以上为宝石红色 0014 所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标 d7 和 或 d8 d7 着色速度为 除 袋之后5天以内着色 d8 着色指数为90 以上 0015 所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标 d9 和 或 d10 d9 着色速度为 除袋之后4天以内着色 d20 成熟果实表皮90 以上为宝石红色 0016 所述苹果品种C0具体可为 红富士 苹果或 嘎啦 苹果 0017 本发明还保护一种苹果育种方法 方法乙 包括如下步骤 将苹果品种C0进行持 续多代的芽变选种 第一代芽变选种将苹果品种CO作为出发品种 以后的每代芽变选种均 将上一代芽变选种得到的品种作为出发品种 每代芽变选种从全满足如下四个性状的芽发 育出的枝条或植株中选择目标品种 a 发生红色芽变 b 芽发育成的枝条或植株上生长 的苹果的果皮的花青苷含量为出发品种的2倍以上 c 芽发育成的枝条或植株上生长的苹 果的果皮的特异DNA分子的甲基化水平为出发品种的二分之一以下 d 芽发育成的枝条或 植株上生长枝条的节间长度为2cm以下 0018 所述特异DNA分子为如下 或 或 0019 序列表的序列1所示的DNA分子 0020 将序列表的序列1所示的DNA分子进行一个或几个核苷酸的插入和 或缺失 和 或替换得到的DNA分子 0021 与序列表的序列1所示的DNA分子具有90 以上同源性的DNA分子 0022 所述多代为2代以上 可为 3代 4代 5代 6代等 0023 所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标 e1 和 或 e2 和 或 e3 e1 着色 速度大于苹果品种C0 e2 着色指数大于苹果品种C0 e3 枝条的节间长度为2cm以下 0024 所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标 e4 和 或 e5 和 或 e6 e4 着色 速度为 除袋之后5天以内着色 e5 着色指数为80 以上 e6 枝条的节间长度为2cm以 下 0025 所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标 e7 和 或 e8 和 或 e9 e7 着色 速度为 除袋之后5天以内着色 e8 成熟果实表皮80 以上为浓红色 e9 枝条的节间长 度为2cm以下 0026 所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标 e10 和 或 e11 和 或 e12 e10 说 明 书 2 12 页 5 CN 106613921 A 着色速度为 除袋之后5天以内着色 e11 着色指数为90 以上 e12 枝条的节间长度为 2cm以下 0027 所述育种方法得到的苹果品种满足如下指标 e13 和 或 e14 和 或 e15 e13 着色速度为 除袋之后5天以内着色 e14 成熟果实表皮90 以上为浓红色 e15 枝条的 节间长度为2cm以下 0028 所述苹果品种C0具体可为 红富士 苹果或 嘎啦 苹果 0029 本发明还保护一种苹果育种方法 方法丙 包括如下步骤 0030 1 将苹果品种A和苹果品种B进行杂交 获得杂交种子 所述苹果品种A为苹果 Malus domestica CSR6R6 666 所述苹果品种B为以上任一所述方法得到的苹果品种 0031 2 将步骤 1 得到的杂交种子播种并育苗 得到实生苗 0032 3 将步骤 2 得到的实生苗移栽至大田 待其长出果实后不对果实进行套袋 筛 选得到目的植株 0033 所述将苹果品种A和苹果品种B进行杂交的方法如下 取苹果品种A的花粉 对去雄 后的苹果品种B进行授粉 0034 所述步骤 2 中 进行所述播种前 先将所述杂交种子进行1 3 层积处理以打破 休眠 所述层积处理的时间具体可为60天 0035 所述步骤 2 中 进行所述育苗的条件为 25 每天光照12小时 光照强度 3000lx 从种子萌发开始每7 10天浇一次营养液 0036 所述步骤 2 中 进行所述育苗的条件具体为 将所述杂交种子播种于装有育苗基 质的营养钵 每个营养钵播种3 5粒种子 培养至实生苗高度为8 15cm且根颈处木质化 通 常为播种2 3个月 然后将实生苗移栽至新的装有育苗基质的营养钵 每个营养钵移栽1 株 进行培养 所述培养的条件为 25 每天光照12小时 光照强度3000lx 从种子萌发开 始每7 10天浇一次营养液 将MS基本培养基的大量元素母液用水稀释至10倍体积即为营养 液 每次每个营养钵浇40 50ml 0037 所述步骤 3 中 在所述大田中进行栽培管理的方法如下 在拟定植实生苗的大田 中每亩施入有机肥6000kg并浇水沉实 定植实生苗后在大田中每亩再施入有机肥6000kg并 及时浇水 所述有机肥具体可为充分腐熟的奶牛粪 0038 所述方法中 移栽第4年 在离地面20cm处对实生苗的主干进行环剥 环剥宽度为 0 5 1 0cm 深达木质部 0039 所述方法中 移栽第5年 在实生苗的盛花期进行如下操作 每个花序的5朵花仅保 留中心花 其他全部疏除 0040 所述方法中 移栽第5年得到所述目的植株 0041 所述目的植株为果肉全红的植株 0042 所述目的植株为满足如下 f1 和 或 f2 和 或 f3 和 或 f4 的苹果植株 f1 果肉全红 f2 果肉高类黄酮含量 f3 果肉高花青苷含量 f4 果肉高抗氧化能力 所述 果肉高类黄酮含量指的是每千克鲜重的果肉中的类黄酮的含量为5000mg以上 所述果肉高 花青苷含量指的是每千克鲜重的果肉中的花青苷含量为200mg以上 果肉高抗氧化能力指 的是每千克鲜重的果肉中的抗氧化能力 又称抗氧化物含量 为3 mol以上 0043 本发明还保护苹果 Malus domestica CSR6R6 666在苹果育种中的应用 所述应 说 明 书 3 12 页 6 CN 106613921 A 用中 苹果CSR6R6 666作为亲本之一 所述应用中 苹果CSR6R6 666作为父本 所述育种的 目的为获得果肉全红的植株 0044 CSR6R6 666 又称苹果 Malus domestica CSR6R6 666 已于2017年2月17日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 简称CGMCC 地址为 北京市朝阳区 北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所 保藏登记号为CGMCC NO 13783 0045 本发明加强芽变选种工作 建立杂交育种与芽变选种优势互补 常规技术与生物 技术有机结合的高效育种技术体系 对苹果红色性状的持续改良具有重要意义 附图说明 0046 图1为红富士 品种甲和品种乙的果皮中的花青苷检测结果 0047 图2为红富士 品种甲和品种乙的果皮中的特异DNA分子甲基化水平检测结果 0048 图3为品种甲的照片 0049 图4为品种乙的照片 0050 图5为品种丁的照片 0051 图6为嘎啦的照片 0052 图7为品种己的照片 0053 图8为苹果新品系 功能1号 的照片 0054 图9为苹果新品系 功能2号 的照片 具体实施方式 0055 以下的实施例便于更好地理解本发明 但并不限定本发明 下述实施例中的实验 方法 如无特殊说明 均为常规方法 下述实施例中所用的试验材料 如无特殊说明 均为自 常规生化试剂商店购买得到的 以下实施例中的定量试验 均设置三次重复实验 结果取平 均值 0056 着色指数指的是 成熟苹果果实表皮 红色区域面积占表皮总面积的比例 0057 芦丁的结构式如下 0058 0059 Trolox的结构式如下 说 明 书 4 12 页 7 CN 106613921 A 0060 0061 80 丙酮溶液 将4体积份丙酮与1体积份水混合 0062 1 盐酸甲醇溶液 97 2ml甲醇与2 8ml浓盐酸混合 浓盐酸即市售12mol L盐酸 0063 0 5 盐酸甲醇溶液的制备方法 将0 5体积份35 浓盐酸与99 5体积份甲醇混 合 0064 提及 红富士 苹果和 嘎啦 苹果的参考文献 陈学森 辛培刚等 元帅和金帅在苹 果新品种选育中的作用 山东农业大学学报 1994 25 2 236 248 0065 实施例1 通过持续多代芽变选种对苹果红皮性状进行持续改良的方法的建立 0066 一 苹果红色芽变的特点 0067 调研发现 苹果的红色芽变具有如下三个特点 0068 1 苹果红色芽变的重演性 0069 调研发现 苹果的红色芽变可在国内外不同地区及不同年份重复发生 表现出芽 变的重演性 这为有效利用芽变选种技术对苹果红皮性状持续改良提供了科学依据 0070 2 苹果红色芽变的多效性 0071 对多个苹果红色芽变品种进行调研发现 尽管均是红色芽变 但不同芽变品种 系 在着色类型 条红或片红 着色速度以及对光的敏感程度等存在明显差异 这为有效 利用芽变选种技术选育特色多样化品种 满足消费者和栽培者的多样化需求提供了科学依 据 0072 3 苹果红色芽变的稳定性 0073 对多个苹果红色芽变品种嫁接繁殖后的稳定性进行了调研 结果表明 苹果红色 芽变具有很好的遗传稳定性和一致性 这为苹果红色芽变品种的大面积推广应用提供了科 学依据 0074 二 芽变的机理 0075 经过发明人的大量研究 苹果的红色芽变是特异DNA分子甲基化水平差异引起的 表观遗传 特异DNA分子如序列表的序列1所示 0076 经检测 红富士 苹果和 嘎啦 苹果的基因组中均具有序列表的序列1所示的特 异DNA分子 0077 三 通过持续多代芽变选种对苹果红皮性状进行持续改良的方法的建立 0078 建立如下方法 将苹果品种C0进行持续多代的芽变选种 第一代芽变选种将苹果 品种CO作为出发品种 以后的每代芽变选种均将上一代芽变选种得到的品种作为出发品 种 每代芽变选种从全满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株中选择目标品种 a 发 生红色芽变 b 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为出发品种的2 倍以上 c 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基化水平为出 发品种的二分之一以下 上述果皮均指的是成熟苹果的果皮 0079 检测果皮的花青苷含量的方法如下 说 明 书 5 12 页 8 CN 106613921 A 0080 取0 5g果皮 液氮研磨 加入 ml 4 预冷的1 盐酸甲醇溶液 4 避光静置 提 取24h 0081 完成步骤 后 取提取液 分为两份 每份1ml 一份加入4ml KCl缓冲液 另一份 加入4ml NaAC缓冲液 混匀后4 避光静置提取15min 然后8000r min离心10min 收集上清 液 0082 KCl缓冲液 pH 1 0 025M 1 86g KCl用980ml蒸馏水溶解 用浓盐酸调pH为1 0 转移到1L容量瓶中 用蒸馏水定容 0083 NaAC缓冲液 pH 4 5 0 4M 54 43g NaAC用960ml蒸馏水溶解 用浓盐酸调pH为 4 5 转移到1L容量瓶中 用蒸馏水定容 0084 取步骤 得到的上清液 分别测定510nm和700nm下的吸光值 0085 花青苷含量 mg g A 5 0 005 1000 449 2 26900 0 5 0086 A A 510nm A700nm pH1 0条件下 A510nm A700nm pH4 5条件下 0087 mg g 中 mg指的是花青苷的质量 指的是果皮鲜重 0088 检测果皮的特异DNA分子的甲基化水平的方法如下 0089 利用QIAGEN植物基因组DNA抽提试剂盒提取果皮的基因组DNA 0090 取步骤 得到基因组DNA 采用EZ DNA Methylation Gold试剂盒进行亚硫酸盐 转化 得到亚硫酸盐处理的DNA 0091 取步骤 得到的亚硫酸盐处理的DNA 作为模板 分两个体系进行PCR扩增 0092 PCR扩增体系 10 Ex Taq Buffer 2 5 l dNTP Mixture 2 l 引物F1 2 l 引物 R1 2 l TaKaRa Ex Taq HS 0 5 l 模板4 ddH 2O 12 l 0093 PCR扩增体系 的反应程序 94 预变性5分钟 94 变性30秒 51 退火30秒 72 延伸1分钟 共进行40个循环 72 延伸10分钟 0094 PCR扩增体系 10 Ex Taq Buffer 2 5 l dNTP Mixture 2 l 引物F2 2 l 引 物R2 2 l TaKaRa Ex Taq HS 0 5 l 模板4 ddH 2O 12 l 0095 PCR扩增体系 的反应程序 94 预变性5分钟 94 变性30秒 54 退火30秒 72 延伸1分钟 共进行40个循环 72 延伸10分钟 0096 引物F1 5 TAGGTTTGAAGAATTAATTAGGGAT 3 0097 引物R1 GGGAAATTTTGGTTTTTATATGGTTTAG 3 0098 引物F2 TTTTATTTTTTATATATATTATGTTATT 3 0099 引物R2 GGATTATGTTATTAGATGGT 3 0100 分别将步骤 的两个体系的扩增产物进行测序 利用CyMATE软件 Hetzl et al 2007 输出甲基化水平数据 0101 特异DNA分子的甲基化水平 体系 的甲基化水平数据 体系 的甲基化水平数 据 2 0102 实施例2 应用实施例1建立的方法通过持续多代芽变选种对苹果红皮性状进行持 续改良 0103 本实施例中检测果皮的花青苷含量的方法和检测果皮的特异DNA分子的甲基化水 平的方法同实施例1 0104 一 红富士苹果红色芽变新品种选育 说 明 书 6 12 页 9 CN 106613921 A 0105 1 第一代芽变选种 0106 将红富士作为出发品种 将满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选 对象 a 发生红色芽变 b 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为 红富士的2倍以上 c 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基 化水平为红富士的二分之一以下 上述果皮均指的是成熟苹果的果皮 0107 将初选对象进行复选和决选后 得到的某一个品种作为品种甲 0108 2 第二代芽变选种 0109 将品种甲作为出发品种 将满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选 对象 a 发生红色芽变 b 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为 品种甲的2倍以上 c 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基 化水平为品种甲的二分之一以下 上述果皮均指的是成熟苹果的果皮 0110 将初选对象进行复选和决选后 得到的某一个品种作为品种乙 0111 红富士 品种甲和品种乙的果皮中的花青苷检测结果见图1 品种甲的果皮的花青 苷含量为红富士的2倍以上 品种乙的果皮的花青苷含量为品种甲的 倍以上 0112 红富士 品种甲和品种乙的果皮中的特异DNA分子甲基化水平检测结果见图2 品 种甲的果皮的特异DNA分子的甲基化水平是红富士的二分之一以下 品种乙的果皮的特异 DNA分子的甲基化水平是品种甲的二分之一以下 0113 红富士的果皮颜色性状 着色速度较慢 除袋之后10 15天着色 着色指数为 25 35 成熟果实表皮 25 35 显示为浅红色 剩余部分显示为黄色或绿色 红富士 的果肉颜色性状 乳白色果肉 0114 品种甲的果皮颜色性状 着色速度较快 除袋之后6 9天着色 着色指数为75 85 成熟果实表皮 75 85 显示为鲜红色 品种甲的照片见图3 品种甲的果肉颜色性 状 乳白色果肉 0115 品种乙的果皮颜色性状 着色速度快 除袋之后3 4天着色 着色指数为90 以上 成熟果实表皮 90 以上为宝石红色 品种乙的照片见图4 品种乙的果肉颜色性状 乳白 色果肉 0116 二 红富士苹果红色 短枝双芽变优质短枝型新品种选育 0117 1 第一代芽变选种 0118 将红富士作为出发品种 将满足如下四个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选 对象 a 发生红色芽变 b 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为 红富士的2倍以上 c 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基 化水平为红富士的二分之一以下 d 芽发育成的枝条或植株上生长的枝条的节间长度为 2cm以下 上述果皮均指的是成熟苹果的果皮 0119 将初选对象进行复选和决选后 得到的某一个品种作为品种丙 0120 2 第二代芽变选种 0121 将品种丙作为出发品种 将满足如下四个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选 对象 a 发生红色芽变 b 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为 品种丙的2倍以上 c 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基 化水平为品种丙的二分之一以下 d 芽发育成的枝条或植株上生长的枝条的节间长度为 说 明 书 7 12 页 10 CN 106613921 A 2cm以下 上述果皮均指的是成熟苹果的果皮 0122 将初选对象进行复选和决选后 得到的某一个品种作为品种丁 0123 红富士的果皮颜色性状 着色速度较慢 除袋之后10 15天着色 着色指数为 25 35 成熟果实表皮 25 35 显示为浅红色 剩余部分显示为黄色或绿色 红富士 的果肉颜色性状 乳白色果肉 0124 品种丙的果皮颜色性状 着色速度较快 除袋之后7 10天着色 着色指数为75 85 成熟果实表皮 75 85 显示为鲜红色 品种丙的果肉颜色性状 乳白色果肉 品种 丙的短枝性状 节间长度为2cm以下 0125 品种丁的果皮颜色性状 着色速度快 除袋之后3 5天着色 着色指数为90 以上 成熟果实表皮 90 以上为浓红色 品种丁的照片见图5 品种丁的果肉颜色性状 乳白色 果肉 品种丁的短枝性状 节间长度为2cm以下 0126 三 嘎啦苹果红色芽变新品种选育 0127 1 第一代芽变选种 0128 将嘎啦作为出发品种 将满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对 象 a 发生红色芽变 b 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为嘎 啦的2倍以上 c 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基化水 平为嘎啦的二分之一以下 上述果皮均指的是成熟苹果的果皮 0129 将初选对象进行复选和决选后 得到的某一个品种作为品种戊 0130 2 第二代芽变选种 0131 将品种戊作为出发品种 将满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选 对象 a 发生红色芽变 b 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为 品种戊的2倍以上 c 芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基 化水平为品种戊的二分之一以下 上述果皮均指的是成熟苹果的果皮 0132 将初选对象进行复选和决选后 得到的某一个品种作为品种己 0133 嘎啦的果皮颜色性状 着色速度较慢 除袋之后8 12天着色 着色指数为25 35 成熟果实表皮 25 35 显示为浅红色 剩余部分显示为黄色或绿色 嘎啦的果肉 颜色性状 乳白色果肉 嘎啦的照片见图6 0134 品种戊的果皮颜色性状 着色速度较快 除袋之后5 8天着色 着色指数为75 85 成熟果实表皮 75 85 显示为鲜红色 品种戊的果肉颜色性状 乳白色果肉 0135 品种己的果皮颜色性状 着色速度快 除袋之后3 5天着色 着色指数为90 以上 成熟果实表皮 90 以上为浓红色 品种己的照片见图7 品种己的果肉颜色性状 乳白色 果肉 0136 实施例3 苹果优异种质 CSR6R6 666 的获得和鉴定 0137 鉴定苹果植株为R1R1基因型 R6R6基因型还是R6R1基因型的方法如下 从待测苹 果植株上取苹果 提取苹果果肉的基因组DNA 以基因组DNA为模板 采用F3和R3组成的引物 对进行PCR扩增 然后按如下标准判读基因型 如果PCR扩增产物为一条带且为497bp 待测 苹果植株为R6R6基因型 如果PCR扩增产物为一条带且为386bp 待测苹果植株为R1R1基因 型 如果PCR扩增产物为两条带且分别为497bp和386bp 待测苹果植株为R6R1基因型 0138 F3 5 GGTGGTCAAAGATGTGTGTTGT 3 说 明 书 8 12 页 11 CN 106613921 A 0139 R3 5 TTTGCCTGCTACCCACTTCA 3 0140 经检测 红富士 苹果和 嘎啦 苹果均为R1R1基因型 0141 一 CSR6R6 666 的获得 0142 新疆红肉苹果作为亲本 与 红富士 等白肉栽培苹果品种杂交 按照孟德尔遗传 定律 新疆红肉苹果 R6R1基因型 与 红富士 R1R1基因型 等白肉栽培苹果品种杂交 其 后代群体应为红肉表型 R6R1基因型 白肉表型 R1R1基因型 1 1 但是 在杂交F 1代群 体中发现了R6R6基因型的单株 0143 将一株R6R6基因型的单株命名为 CSR6R6 666 0144 CSR6R6 666 具有如下表型 茎 叶 花 果皮和果肉等各部分及各个发育阶段均 为紫红色 0145 二 CSR6R6 666 的保藏 0146 CSR6R6 666 又称苹果 Malus domestica CSR6R6 666 已于2017年2月17日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 简称CGMCC 地址为 北京市朝阳区 北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所 保藏登记号为CGMCC NO 13783 0147 三 CSR6R6 777 的保藏 0148 CSR6R6 777 是发明人所在的实验室前期选育出来的另一株R6R6基因型的单株 0149 CSR6R6 777 又称苹果 Malus domestica CSR6R6 777 已于2016年12月08日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 简称CGMCC 地址为 北京市朝阳区 北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所 保藏登记号为CGMCC NO 12468 0150 四 类黄酮组分含量分析 0151 分别将 CSR6R6 666 和 CSR6R6 777 作为待测植株 0152 1 取待测植株上的苹果 取苹果果肉 0153 2 取步骤1得到的果肉 在液氮中研磨得到粉末 0154 3 称取2g步骤2得到的粉末 加入5mL 0 5 盐酸甲醇溶液 4 静置提取2h 然后 8000rpm离心20min 分别收集上清液和残渣 0155 4 取步骤3得到的残渣 加入5mL 0 5 盐酸甲醇溶液 4 静置提取1h 然后 8000rpm离心20min 收集上清液 0156 5 将步骤3得到的上清液和步骤4得到的上清液混合 得到混合液 0157 6 取步骤5得到的混合液 37 旋蒸除去甲醇 残留物用2 3ml甲醇溶解 然后 8000rpm离心20min 收集上清液 0158 7 取步骤6得到的上清液 用甲醇定容至5ml 然后用0 45 m滤膜过滤 收集滤液 0159 8 将步骤7得到的滤液进行HPLC MS分析 0160 液相色谱条件 0161 采用WATERS ACQUITY UPLC色谱仪 色谱柱为BEH C18柱 100mm 2 1mm 填料粒 径1 7 m 柱温45 进样体积1 L 0162 流动相为A液和B液的混合液 流速为0 3mL min A液为乙腈 B液为含0 2 体积 分数 甲酸的水溶液 0 0 1min A液占流动相的体积分数为5 0 1 20min A液占流动相的 体积分数由5 线性上升至20 20 22min A液占流动相的体积分数由20 线性上升至 80 22 22 1min A液占流动相的体积分数由80 线性下降至5 22 1 25min A液占流动 说 明 书 9 12 页 12 CN 106613921 A 相的体积分数为5 0163 质谱条件 0164 质谱仪为WATERS MALDI SYNAPT Q TOF MS ESI电离源 电喷雾离子化正离子采集 模式 ESI 扫描范围100 1500m z 毛细管电压3 5kV 锥孔电压30V 源温度100 脱溶温 度300 脱溶剂气流量500L h 0165 9种特定黄酮醇物质的含量见表1 表 中的9种特有物质的检测方法均属于类黄酮 组分及含量检测方法 参考文献 陈学森 张晶 刘大亮 等 新疆红肉苹果杂种一代的遗传 变异及功能型苹果优株评价 J 中国农业科学 2014 47 11 2193 2204 0166 表1 0167 0168 0169 以上结果表明 CSR6R6 666 和 CSR6R6 777 均具有很强的类黄酮合成能力 果 肉富含类黄酮 并且含有特殊的黄酮醇类组分 是培育功能型苹果品种的优异种质 CSR6R6 666 优于 CSR6R6 777 0170 实施例4 芽变选种和杂交育种有机结合培育 功能1号 功能型苹果新品系 0171 一 功能型苹果新品系 0172 1 回交 在山东烟台市牟平区进行 0173 2011年4月 取 CSR6R6 666 的花粉 对去雄后的品种乙进行授粉 收获BC 1杂交种 子 将BC 1杂交种子洗净后放到1 3 冰箱保鲜室层积处理60d左右 目的是通过满足需冷量 来解除种子休眠 0174 2 温室育苗 在山东泰安进行 0175 2011年12月 将步骤1得到的BC 1杂交种子播种于装有育苗基质的营养钵 每个营 养钵播种3 5粒种子 培养至实生苗高度为8 15cm且根颈处木质化 通常为播种2 3个月 然后将实生苗移栽至新的装有育苗基质的营养钵 每个营养钵移栽1株 进行培养 本步骤 中的培养条件为 25 每天光照12小时 光照强度3000lx 从种子萌发开始每7 10天浇一 次营养液 将MS基本培养基的大量元素母液用水稀释至10倍体积即为营养液 每次每个营 养钵浇40 50ml 说 明 书 10 12 页 13 CN 106613921 A 0176 3 杂种实生苗定植 在山东冠县进行 0177 2012年2月 在拟定植实生苗的选种圃 大田 中每亩施入有机肥 本实施例中采用 的为充分腐熟的奶牛粪 6000kg并浇水沉实 2012年4月 将3600株步骤2得到的实生苗定植 于选种圃 2012年4月在定植有实生苗的选种圃中每亩再施入有机肥 本实施例中采用充分 腐熟的奶牛粪 6000kg并及时浇水 0178 4 杂种实生苗环剥处理 0179 2015年5月 在离地面20cm处对各实生苗的主干进行环剥 环剥宽度为0 5 1 0cm 深达木质部 此操作的目的是促进营养物质的积累及花芽分化 以缩短童期 提早结果 0180 5 花果管理 0181 2016年4 5月 在各实生苗的盛花期进行疏花 每个花序的5朵花仅保留中心花 其 他全部疏除 幼果不套袋 常规管理 0182 6 功能型苹果新品系 功能1号 的获得 0183 20