抑霉唑在草莓生长过程中对映体选择性降解行为.pdf

2023 年第 64 卷第 4 期 921 收稿日期 2022 06 07 基金项目徐州市农业科学院基金 XM2021008 作者简介张佳 1996 女辽宁锦州人硕士研究实习员研究方向为果品质量安全 E mail zhangjia208 126 com 通信作者魏猛 1983 男山东济宁人副研究员博士研究方向为土壤养分管理及草莓栽培技术 E mail weimeng1024 163 com 文献著录格式张佳蒋薇贾志航等抑霉唑在草莓生长过程中对映体选择性降解行为 J 浙江农业科学 2023 64 4 921 926 DOI 10 16178 j issn 0528 9017 20220637 抑霉唑在草莓生长过程中对映体选择性降解行为张佳 1 2 蒋薇 1 2 贾志航 1 2 宋庆科 1 张婷 1 魏猛 1 2 1 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所江苏徐州 221131 2 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所铜山试验站江苏徐州 221114 摘要采用优化的 QuEChERS 样品前处理技术和超高效液相色谱串联质谱仪 UPLC MS MS 建立了测定草莓中手性农药抑霉唑对映体的分析方法样品用乙腈提取 N 丙基乙二胺 PSA 和石墨化碳黑 GCB 净化经手性色谱柱 Lux Cellulose 2 拆分后用 UPLC MS MS 进行测定基质外标法定量分析结果表明手性农药抑霉唑对映体在 2 5 1 000 g L 1 范围内线性关系良好 R 2 0 99 方法定量限 LOQ 为 5 g kg 1 3 个添加水平 5 50 1 000 g kg 1 下 S 和 R 抑霉唑对映体在草莓基质中的平均回收率分别为 94 6 119 7 和 86 6 117 3 相对标准偏差分别为 2 0 8 3 和 5 0 9 6 抑霉唑两对映体在草莓生长中的降解符合一级动力学方程 S 抑霉唑半衰期 6 54 d R 抑霉唑半衰期 7 07 d 本研究从对映体的角度研究了抑霉唑在草莓中的降解可为手性农药对映体的环境行为研究提供基础数据关键词抑霉唑草莓手性农药超高效液相色谱串联质谱 QuEChERS 中图分类号 S668 4 文献标志码 A 文章编号 0528 9017 2023 04 0921 06 草莓色泽鲜艳口味酸甜具有丰富的营养价值在高温高湿下草莓极易引发病害杀虫剂杀菌剂等农药的使用成为保障草莓产业健康发展必不可少的措施 1 近年来草莓农药用量逐年增加据报道草莓中使用的农药高达 50 多种有较大的安全风险 2 手性农药是发展高效低风险农药的一个重要突破口目前手性农药在国内外农药市场占比达 40 以上抑霉唑是比利时 Janssen 公司开发的咪唑类手性杀菌剂英文通用名为 Imazalil 含有 1 个手性中心 2 个对映体抑霉唑为内吸性广谱杀菌剂对水果和蔬菜中常见的青霉病绿霉病有很好的防治效果 2018 年抑霉唑被登记作为防治草莓灰霉病的杀菌剂目前抑霉唑以外消旋的形式出售和使用在植物及环境中抑霉唑对映体存在选择性降解行为对映体残留存在差别从而威胁人体健康 3 4 有关抑霉唑对映体手性拆分方法有毛细管电泳法液相色谱法和液相色谱串联质谱法 Kodama 等 5 采用毛细管电泳法实现抑霉唑对映体的分离并且首次应用在柑橘中抑霉唑的检测 Pan 等 6 用自制的纤维素手性色谱柱在正相液相色谱条件下实现了抑霉唑对映体的完全分离且分离度高但分离时间过长基于手性固定相的液相色谱串联质谱法直接拆分手性农药残留具有速度快应用范围广分离效果好等优点成为手性农药分离分析的一种重要手段目前已在蔬菜水果以及土壤农药残留检测中广泛应用 7 8 鉴于此本研究利用超高效液相色谱串联质谱 UPLC MS MS 对抑霉唑进行手性拆分并结合 QuEChERS 前处理方法优化建立草莓中抑霉唑对映体残留的 UPLC MS MS 分析方法阐明手性农药抑霉唑在草莓上的降解规律填补在对映体水平上研究草莓中抑霉唑的残留水平的空白为抑霉唑更准确的风险评估提供技术支持 1 材料与方法 1 1 试验材料 SCIEX Triple Quad 3500 质谱仪美国 SCIEX 公司 Lux Cellulose 2 手性色谱柱 150 mm 922 2023 年第 64 卷第 4 期 4 6 mm 5 m 美国 Phenomenex 公司固定相为纤维素三 3 氯 4 甲基苯基氨基甲酸酯 Centrifuge 5810R 离心机德国 Eppendorf 公司 PL602 L 电子天平瑞士 METTLER TOLEDO 公司 JYL C020 匀浆机中国九阳有限公司色谱级乙腈美国 Thermo Fisher Scientific 公司氯化钠无水硫酸镁中国 Macklin 公司 N 氮基乙二胺 PSA 40 m 石墨化碳黑 GCB 天津博纳艾杰有限公司抑霉唑标准品纯度 99 对映单体比例 1 1 中国 Aladdin 公司 20 抑霉唑水乳剂中国剑牌农化股份有限公司有机滤膜 0 22 m 中国津腾试验有限公司蒸馏水 1 2 试验方法试验于 2021 年 12 月在江苏徐淮地区徐州农业科学研究所中心实验室进行 1 2 1 样品前处理准确称取红颜草莓匀浆 10 0 g 于 50 mL 离心管中加入 10 mL 色谱级乙腈涡旋 5 min 然后向提取液中加入 1 0 g 氯化钠和 4 0 g 无水硫酸镁涡旋 1 min 后于 5 000 r min 1 离心 5 min 取上清液 1 5 mL 置于装有 30 mg PSA 10 mg GCB 和 0 150 g 无水硫酸镁的 2 mL 离心管中涡旋混匀 1 min 于 5 000 r min 1 离心 5 min 取上层清液过 0 22 m 有机滤膜至进样瓶中 1 2 2 色谱与质谱检测条件液相色谱条件为手性色谱柱为 Lux Cellulose 2 150 mm 4 6 mm 5 m 美国 Phenomenex 公司流动相为超纯水 A 和乙腈 B 洗脱梯度为 A B 15 85 流速 5 mL min 1 柱温 35 进样量为 5 L 质谱条件具体为离子源为电喷雾离子源 ESI 扫描方式为正离子扫描气帘气 CUR 25 Psi 碰撞气 CAD 7 Psi 离子化电压 IS 5 500 V 离子源温度 550 雾化器 GS1 55 Psi 雾化器 GS2 55 Psi 抑霉唑质谱参数见表 1 表 1 抑霉唑质谱参数化合物分子式分子量母离子 m z 子离子 m z 锥孔电压 V 碰撞能量 V 定性定量抑霉唑 C 14 H 14 Cl 2 N 2 O 297 2 297 1 159 30 30 定量 69 30 25 定性 1 2 3 抑霉唑对映体洗脱顺序的确定根据文献报道通过 UPLC UV 串联在线旋光检测器 advanced laser polarimeter ALP 检测旋光性对映体在 Lux Cellulose 2 手性柱上的洗脱顺序确定为 S 抑霉唑和 R 抑霉唑 9 10 1 2 4 色谱参数计算考量色谱分离效果的参数主要包括容量因子 k 和分离因子二者可通过优化达到最佳值使得分离度 RS 达到最大一定范围内增大 k 可显著提高分离度增大分离因子可提高色谱分析准确度本试验通过 k 和 RS 评价抑霉唑对映异构体分离效果计算公式如下 k t t 0 t 0 1 式 1 中 k 容量因子 t 保留时间 RT t 0 死时间 k 1 k 2 2 式 2 中分离因子 k 1 k 2 容量因子 RS 1 177 t 1 t 2 w 1 2 w 2 2 3 式 3 中 RS 分离度 w 2 半峰宽 1 2 5 标准曲线准确称取 0 010 g 抑霉唑标准品至 100 mL 容量瓶中用色谱级乙腈稀释定容得 100 mg L 1 母液其对映单体的浓度为 50 mg L 1 于 20 冰箱储存待用用乙腈逐级稀释母液获得浓度依次为 5 25 50 100 500 1 000 2 000 g L 1 的外消旋体工作溶液其中抑霉唑对映体的浓度分别为 2 5 12 5 25 50 250 500 1 000 g L 1 现用现配同时采用经过提取的空白草莓基质配制相应浓度的基质标准曲线 1 2 6 基质效应通过溶剂标准曲线和基质标准曲线计算基质效应 ME 11 按式 4 计算基质效应为基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率之差占溶剂标准曲线斜率的百分比 1 2 7 方法准确度与精密度分别用抑霉唑对映体的回收率及相对标准偏差张佳等抑霉唑在草莓生长过程中对映体选择性降解行为 923 进行评估本实验中抑霉唑对映体的添加水平分别为 5 50 1 000 g kg 1 每个添加水平进行 6 次重复试验重复 3 天 1 2 8 田间试验草莓上抑霉唑降解动态试验选取江苏徐淮地区徐州农业科学研究所铜山试验站设施温室的红颜草莓 2 a 内未喷施抑霉唑及结构相似的农药试验地设 3 个降解试验区 1 个空白试验区每个降解试验区面积 30 m 2 在草莓生长至一半大小时施药 1 次施药浓度 250 mg kg 1 最高推荐剂量的 1 5 倍在施药后 2 h 1 3 5 7 10 15 21 27 d 取样一级动力学方程评估抑霉唑在草莓中的降解过程式 4 根据拟合的一级动力学方程计算抑霉唑降解半衰期 T 1 2 式 5 抑霉唑选择性降解差异用对映体分数 EF 评估式 6 C C 0 e k t 4 式 4 中 C t 时对映体浓度 C 0 对映体初始浓度 T 1 2 ln 2 k 5 EF A A A 6 式 6 中 A S 抑霉唑 A R 抑霉唑 1 3 统计分析所有试验均设置至少 3 个重复用 Excel 进行数据统计用 Origin 2017 软件绘制色谱图 2 结果与分析 2 1 抑霉唑对映体分离色谱条件的优化本实验在前人研究基础上利用 SCIEX Triple Quad 3500 质谱仪并结合 Lux Cellulose 2 手性色谱柱针对不同流动相比例 A B 5 95 15 85 25 75 和 35 65 不同流速 0 3 0 4 0 5 和 0 6 mL min 1 和不同柱温 25 30 35 和 40 进行色谱条件优化 2 1 1 流动相比例的优化有机相比例影响洗脱强度进而影响手性化合物的分离效果本实验分析流动相比例 A B 5 95 15 85 25 75 和 35 65 流速 0 5 mL min 1 柱温 35 对抑霉唑分离的影响如表 2 所示随着有机相比例的降低抑霉唑对映体的容量因子 k 不断升高 k 值越大分离度越大但 k 小时有利于形成窄峰形因此应综合考虑分离因子从 0 83 提高到 0 86 增大可提高分离分析准确度乙腈比例升高可缩短两对映体的保留时间提高分离效率但分离度从 2 63 降低到 1 58 图 1 中 A 一般地当分离度大于 1 5 时就认为对映体实现基线分离因此在本试验设计的 4 个有机相比例下抑霉唑对映体均可实现完全分离故综合考虑各参数分离度及分离效率最终选择了流动相比例为 A B 15 85 表 2 流动相比例对抑霉唑对映体分离效果的影响流动相比例 A B k 1 k 2 RS 5 95 0 82 0 99 0 83 1 58 15 85 0 90 1 09 0 84 1 83 25 75 1 01 1 19 0 85 2 21 35 65 1 77 2 07 0 86 2 63 注 k 1 k 2 分别为先后洗脱的对映异构体的容量因子表 3 同 2 1 2 流速对分离的影响分析流速 0 3 0 4 0 5 和 0 6 mL min 1 流动相比例 A B 15 85 柱温 35 对抑霉唑分离的影响当流速逐渐增大时容量因子 k 有所减小 k 1 范围为 0 67 0 87 k 2 范围为 0 78 1 01 分离因子在流速为 0 3 mL min 1 时最大为 0 86 流速主要通过改变色谱系统压力从而改变流动相洗脱强度通常情况下当流速增大时洗脱时间减少分析效率提高同样也会减小分离度故综合考虑各参数及分离度最终选择了流速为 0 5 mL min 1 表 3 和图 1 中 B 表 3 流速对抑霉唑对映体分离效果的影响流速 mL min 1 k 1 k 2 RS 0 3 0 87 1 01 0 86 1 86 0 4 0 67 0 78 0 85 1 67 0 5 0 69 0 78 0 85 1 83 0 6 0 71 0 83 0 85 1 50 2 1 3 柱温对分离的影响柱温是影响抑霉唑对映异构体分离的主要因素之一本实验分别考察了柱温为 25 30 35 和 40 时抑霉唑对映体的分离情况结果见图 1 中 C 随着柱温升高抑霉唑对映体的分离度变化小但当柱温升高到 40 时分离度下降到 1 48 因此综合比较不同柱温下 2 对映异构体的分离度 RS 和保留时间最终选择了柱温 35 综合以上优化结果选择流动相为超纯水924 2023 年第 64 卷第 4 期 A 乙腈 B 15 85 流速 0 5 mL min 1 柱温 35 作为仪器分析条件在该条件下抑霉唑 2 对映体在 8 min 内出峰完毕分离度 RS 1 5 达到分析要求 A 表示流动相比例对分离效果的影响 B 表示流速对分离效果的影响 C 表示柱温对分离效果的影响图 1 不同色谱分离条件下手性杀菌剂抑霉唑分离色谱图 2 2 净化方法的优化抑霉唑的提取和净化基于 QuEChERS 方法优化 QuEChERS 方法因其快速简便廉价有效可靠和安全的特点已成为分析农药和兽药残留的一种广泛使用的前处理方法与传统前处理方法相比 QuEChERS 适用性更为广泛且通常拥有较高的回收率和高样品处理通量 12 15 为了减少杂质干扰且提高回收效率在草莓基质中的加标浓度为 100 g kg 1 消旋体评估不同吸附剂比例 50 mg PSA 10 mg GCB 50 mg PSA 20 mg GCB 50 mg PSA 30 mg GCB 对抑霉唑对映体回收率的影响结果见图 2 随着 GCB 用量的增加抑霉唑对映体回收率均有所下降当 GCB 的用量增加到 30 mg 时回收率低于 80 50 mg PSA 10 mg GCB 和 50 mg PSA 20 mg GCB 净化剂组合在草莓基质中显示出符合要求的回收率 80 120 为了获得较高回收率和较好的纯化效果选择 50 mg PSA 10 mg GCB 用于草莓样品的净化图 2 草莓中抑霉唑对映体的提取效率 2 3 抑霉唑检测方法评价 2 3 1 线性关系与基质效应在优化条件下按 1 2 节方法考察抑霉唑对映体的溶剂和基质标准曲线方程决定系数和基质效张佳等抑霉唑在草莓生长过程中对映体选择性降解行为 925 应结果见表 4 结果表明抑霉唑对映体在 2 5 1 000 g L 1 浓度范围内线性关系良好决定系数 R 2 均在 0 99 以上故本试验选择基质标准曲线为草莓基质进行定量分析根据抑霉唑对映体的线性方程考察基质效应基质效应 matrix effect 影响分析检测过程的准确性和可靠性色谱串联质谱分析中基质效应一般被认为共洗脱的成分导致被分析物质响应增强或抑制基质效应的增强常伴随着分析方法精密度的下降因此在农药检测中多通过建立标准曲线消除基质效应 16 17 通常当基质效应在 10 10 时可忽略不计本实验中 S 抑霉唑和 R 抑霉唑基质效应分别为 63 5 和 30 4 表 4 S 抑霉唑和 R 抑霉唑在草莓中表现出较强的基质减弱效应因此本方法采用基质标准溶液进行定量分析表 4 抑霉唑对映体在不同基质中的标准曲线决定系数 R 2 和基质效应化合物基质回归方程决定系数 R 2 线性范围 g L 1 基质效应定量限 g kg 1 S 抑霉唑乙腈 y 1 002 3 x 31 100 0 995 0 2 5 100 0 草莓 y 365 x 828 62 0 999 9 2 5 100 0 63 5 5 R 抑霉唑乙腈 y 483 7 x 11 377 0 995 8 2 5 100 0 草莓 y 336 63 x 8 322 6 0 999 3 2 5 100 0 30 4 5 2 3 2 准确度和精密度检测方法的准确度和精密度按照 1 2 7 节进行低中高 3 个浓度水平的样品加标回收实验每个水平重复 6 次同时按 1 2 5 节配制相应浓度的基质标准溶液用基质外标法定量回收率和相对标准偏差 RSD 见表 5 抑霉唑 2 对映体在草莓基质中日内回收率 86 6 105 9 日内 RSD 为 0 5 9 5 日间回收率 86 6 119 7 日间 RSD 为 0 5 11 3 以最低添加浓度计算方法的定量限得草莓基质中抑霉唑对映体的定量限为 5 g kg 1 表 5 草莓中不同添加水平下抑霉唑对映体的回收率和相对标准偏差化合物添加水平 g kg 1 日间 n 6 1 d 2 d 3 d 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD 日内 n 16 RSD S 抑霉唑 5 105 9 0 5 108 5 2 2 105 2 3 4 2 0 50 94 6 4 4 119 7 7 1 110 4 5 2 5 6 1 000 99 2 9 5 112 9 9 0 104 3 6 4 8 3 R 抑霉唑 5 97 0 5 0 117 3 5 3 101 2 4 7 5 0 50 89 8 9 5 113 6 11 3 99 4 7 9 9 6 1 000 86 6 8 1 110 3 4 5 105 3 5 5 6 0 2 4 草莓生长过程中抑霉唑的降解动态采用本方法检测红颜草莓生长过程中手性农药抑霉唑对映体的残留变化情况结果见表 6 抑霉唑 2 对映体在草莓上的降解均符合一级动力学方程 S 抑霉唑在草莓上的消解方程为 y 17 233e 0 106 x R 2 为 0 940 3 半衰期 6 54 0 09 d R 抑霉唑在草莓上的消解方程为 y 18 375e 0 098 x R 2 为 0 967 7 半衰期 7 07 0 17 d 分析半衰期表明抑霉唑 2 个对映体在草莓生长过程中有显著的选择性降解行为 P 0 05 降解过程中 EF 从 0 51 降至 0 42 与 EF 0 5 存在显著差异 P 0 01 说明 2 个对映体在草莓上存在选择性降解行为手性农药的选择性降解行为会受到生物酶微生物等因素的影响 18 同一手性农药在不同作物上的选择性降解行为也存在差异 19 如 R 乙螨唑在苹果和土壤中优先降解而 S 乙螨唑在草莓中优先降解 20 刘娜等 21 研究表明粉唑醇 2 对映体在草莓生长中不存在选择性降解行为因此手性农药的施用和风险评估应考虑其施用作物栽培环境等因素表 6 草莓生长过程中手性农药抑霉唑对映体的残留变化时间 d 平均浓度标准偏差 g kg 1 S 抑霉唑 R 抑霉唑 EF 0 083 666 24 3 00 649 46 7 91 0 51 0 002 1 639 48 19 91 645 19 15 44 0 50 0 001 2 527 85 16 00 560 77 9 60 0 49 0 004 3 410 35 21 82 451 05 16 61 0 48 0 002 5 292 13 31 31 337 90 10 31 0 45 0 003 7 232 37 33 55 268 64 22 78 0 45 0 005 14 93 02 12 87 124 54 12 56 0 43 0 009 21 50 40 0 93 66 11 3 62 0 43 0 011 27 49 26 11 21 58 23 1 21 0 42 0 013926 2023 年第 64 卷第 4 期 3 小结本研究建立了一种基于 QuEChERS 超高效液相色谱串联质谱检测草莓中抑霉唑对映体的手性拆分方法抑霉唑对映体在 2 5 1 000 g L 1 范围内线性关系良好 R 2 0 99 方法定量限 LOQ 为 5 g kg 1 S 和 R 抑霉唑对映体在草莓基质中的平均回收率分别为 94 6 119 7 和 86 6 117 3 相对标准偏差分别为 2 0 8 3 和 5 0 9 6 研究了抑霉唑在草莓生长过程中的对映体选择性降解行为结果表明抑霉唑对映体在草莓生长中存在选择性降解 S 抑霉唑半衰期 6 54 d R 抑霉唑半衰期 7 07 d 本研究建立的方法有较高的准确度和精密度可对草莓中手性农药抑霉唑对映体准确拆分和测定分析速度快灵敏度高可为手性农药抑霉唑的进一步研究提供技术参考文献 1 班思凡李春梅贺青华等设施栽培草莓中农药残留膳食风险评估 J 食品工业科技 2020 41 3 212 220 2 付岩张亮吴银良草莓中嘧霉胺的残留与膳食风险评估 J 现代食品科技 2017 33 11 206 211 3 陈宗懋食品中农药残留检测发展的新趋势 J 农产品质量与安全 2010 1 9 12 4 LV T CARVALHO P N CASAS M E et al Enantioselective uptake translocation and degradation of the chiral pesticides tebuconazole and imazalil by P h r a g m i t e s a u s t r a l i s J Environmental Pollution 2017 229 362 370 5 KODAMA S YAMAMOTO A OHURA T et al Enantioseparation of imazalil residue in orange by capillary electrophoresis with 2 hydroxypropyl cyclodextrin as a chiral selector J Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003 51 21 6128 6131 6 PAN C X XU X Z ZHANG X J et al Comparative study of the enantioseparation of uniconazole and imazalil by HPLC on various cellulose chiral columns J Analytical Letters 2006 39 3 631 638 7 骆冲黄聪灵朱富伟等两种叶菜中 5 种典型手性农药对映体的超高效液相色谱串联质谱 UPLC MS MS 分析方法研究 J 分析测试学报 2018 37 3 294 299 8 崔璇钟青张新忠等农产品中手性农药对映体残留色谱法分析研究进展 J 分析测试学报 2019 38 2 249 262 9 CHASI T YANG W QIU J et al Direct enantioseparation of nitrogen heterocyclic pesticides on cellulose based chiral column by high performance liquid chromatography J Chirality 2015 27 1 32 38 10 LI R N DONG F S XU J et al Enantioseparation of imazalil and monitoring of its enantioselective degradation in apples and soils using ultrahigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometry J Journal of Agricultural and Food Chemistry 2017 65 16 3259 3267 11 张圆圆刘磊李娜等农药残留检测中不同蔬菜的基质效应 J 农药学学报 2019 21 3 327 337 12 王琦岳宁李晓慧等 QuEChERS 技术结合超高效液相串联质谱同时测定薄皮甜瓜中 7 种葫芦素 J 食品科学 2022 43 4 144 149 13 ORFANIDI A GIKA H THEODORIDIS G et al Development of a UHPLC MS MS method for the determination of 84 pharmaceuticals and drugs of abuse in human liver J Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 2020 1151 122192 14 LIU T FANG K LIU Y et al Enantioselective residues and toxicity effects of the chiral triazole fungicide hexaconazole in earthworms E i s e n i a f e t i d a J Environmental Pollution 2021 270 116269 15 徐子婷郝莉花马静等 QuEChERS SPE 超高效液相色谱串联质谱法测定调味面制品中的 12 种真菌毒素 J